PAGE1PAGE2專(zhuān)題17基因工程考點(diǎn)01重組DNA技術(shù)的基本工具一、多選題1．（2025·江蘇·高考真題）圖示人體正?；駻突變?yōu)橹虏』騛及HindⅢ切割位點(diǎn)。AluⅠ限制酶識(shí)別序列及切割位點(diǎn)為，下列相關(guān)敘述正確的有（

）A．基因A突變?yōu)閍是一種堿基增添的突變B．用兩種限制酶分別酶切A基因后，形成的末端類(lèi)型不同C．用兩種限制酶分別酶切a基因后，產(chǎn)生的片段大小一致D．產(chǎn)前診斷時(shí)，該致病基因可選用HindⅢ限制酶開(kāi)展酶切鑒定【答案】BD【難度】0.4【知識(shí)點(diǎn)】基因突變、DNA重組技術(shù)的基本工具【分析】“分子手術(shù)刀”——限制酶：（1）來(lái)源：主要是從原核生物中分離純化出來(lái)的。（2）功能：能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)，因此具有專(zhuān)一性。（3）結(jié)果：經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式，即黏性末端和平末端?！驹斀狻緼、對(duì)比A基因和a基因的序列，A基因中“AAGCTT”變?yōu)閍基因中“AAGCTG”，是堿基替換（T→G），并非堿基增添，A錯(cuò)誤；B、HindⅢ切割產(chǎn)生黏性末端，AluⅠ切割后產(chǎn)生的是平末端，二者末端類(lèi)型不相同，B正確；C、a基因中有2個(gè)HindⅢ切割位點(diǎn)，切割后產(chǎn)生3個(gè)片段，有3個(gè)AluⅠ切割位點(diǎn)，切割后產(chǎn)生4個(gè)片段，用兩種限制酶分別酶切a基因后，產(chǎn)生的片段大小不一致，C錯(cuò)誤；D、因?yàn)檎；駻和致病基因a的HindⅢ切割位點(diǎn)數(shù)量不同，所以產(chǎn)前診斷時(shí)，該致病基因可選用HindⅢ限制酶開(kāi)展酶切鑒定，D正確。故選BD?？键c(diǎn)02DNA的粗提取、PCR、電泳鑒定一、單選題2．（2025·廣東·高考真題）Solexa測(cè)序是一種將PCR與熒光檢測(cè)相結(jié)合的高通量測(cè)序技術(shù)。為了確保該P(yáng)CR過(guò)程中，DNA聚合酶催化一個(gè)脫氧核苷酸單位完成聚合反應(yīng)后，DNA鏈不繼續(xù)延伸，應(yīng)保護(hù)底物中脫氧核糖結(jié)構(gòu)上的（

）A．1'-堿基 B．2'-氫 C．3'-羥基 D．5'-磷酸基團(tuán)【答案】C【難度】0.85【知識(shí)點(diǎn)】DNA分子的結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)、PCR擴(kuò)增的原理與過(guò)程【分析】在DNA復(fù)制過(guò)程中，在DNA聚合酶的催化作用下，將一個(gè)個(gè)的脫氧核苷酸連接形成磷酸二酯鍵，使子鏈延伸，但是DNA聚合酶催化延伸子鏈方向只能從5′→3′?！驹斀狻恳阎狣NA聚合酶催化延伸子鏈方向只能從5′→3′，原因是脫氧核苷酸的3'碳有羥基，可以結(jié)合下一個(gè)脫氧核苷酸的5′碳的磷酸基團(tuán)，故為了DNA聚合酶催化一個(gè)脫氧核苷酸單位完成聚合反應(yīng)后，DNA鏈不繼續(xù)延伸，應(yīng)保護(hù)底物中脫氧核糖結(jié)構(gòu)上的3'-羥基，使其不能結(jié)合下一個(gè)脫氧核苷酸的5′碳的磷酸基團(tuán)，C正確。故選C。3．（2025·陜晉青寧卷·高考真題）對(duì)下列關(guān)于中學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的描述錯(cuò)誤的是（

）①探究淀粉酶對(duì)淀粉和蔗糖的水解作用②觀察植物細(xì)胞的質(zhì)壁分離現(xiàn)象③探究培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的變化④觀察植物細(xì)胞的有絲分裂⑤觀察葉綠體和細(xì)胞質(zhì)的流動(dòng)⑥D(zhuǎn)NA的粗提取與鑒定A．①⑥通過(guò)觀察顏色判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果 B．③⑥均須進(jìn)行離心操作C．②④均可使用洋蔥作為實(shí)驗(yàn)材料 D．②⑤實(shí)驗(yàn)過(guò)程均須保持細(xì)胞活性【答案】B【難度】0.65【知識(shí)點(diǎn)】質(zhì)壁分離及其復(fù)原實(shí)驗(yàn)、酶的特性、有絲分裂實(shí)驗(yàn)、DNA的粗提取及鑒定【分析】探索淀粉酶對(duì)淀粉和蔗糖的作用的實(shí)驗(yàn)中，最后需要用斐林試劑檢測(cè)，因此需要水浴加熱和根據(jù)顏色反應(yīng)來(lái)確定。【詳解】A、淀粉和蔗糖都不是還原糖，不能與斐林試劑反應(yīng)，淀粉和蔗糖水解產(chǎn)物為還原糖，可以與斐林試劑反應(yīng)，因此可以用斐林試劑鑒定淀粉酶對(duì)淀粉和蔗糖的水解作用，若淀粉組出現(xiàn)紅黃色，蔗糖組沒(méi)有出現(xiàn)紅黃色，說(shuō)明淀粉酶可以催化淀粉水解不能催化蔗糖水解；⑥中DNA與二苯胺在沸水浴下顯藍(lán)色，因此①⑥均通過(guò)顏色判斷結(jié)果，A正確；B、③通過(guò)血球計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)酵母菌，無(wú)需離心；⑥需離心去除雜質(zhì)以提取DNA，B錯(cuò)誤；C、②可用洋蔥紫色外表皮觀察質(zhì)壁分離，④可用洋蔥根尖分生區(qū)觀察有絲分裂，C正確；D、②活的植物細(xì)胞原生質(zhì)體具有選擇透性，可以發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象；⑤活細(xì)胞的葉綠體和細(xì)胞質(zhì)才能流動(dòng)，因此②⑤實(shí)驗(yàn)過(guò)程均須保持細(xì)胞活性，D正確。故選B。4．（2025·湖南·高考真題）用替代的實(shí)驗(yàn)材料或者試劑開(kāi)展下列實(shí)驗(yàn)，不能達(dá)成實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡氖牵ǎ┻x項(xiàng)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容替代措施A用高倍顯微鏡觀察葉綠體用“菠菜葉”替代“蘚類(lèi)葉片”BDNA的粗提取與鑒定用“豬成熟紅細(xì)胞”替代“豬肝細(xì)胞”C觀察根尖分生區(qū)組織細(xì)胞的有絲分裂用“醋酸洋紅液”替代“甲紫溶液”D比較過(guò)氧化氫在不同條件下的分解用“過(guò)氧化氫酶溶液”替代“肝臟研磨液”A．A B．B C．C D．D【答案】B【難度】0.65【知識(shí)點(diǎn)】觀察葉綠體、線粒體和細(xì)胞質(zhì)流動(dòng)實(shí)驗(yàn)、酶促反應(yīng)的因素及實(shí)驗(yàn)、有絲分裂實(shí)驗(yàn)、DNA的粗提取及鑒定【分析】制作裝片流程：解離→漂洗→染色→制片。解離的目的是用藥液使組織中的細(xì)胞相互分離開(kāi)來(lái)，漂洗的目的是洗去藥液，防止解離過(guò)度，染色時(shí)用甲紫溶液或醋酸洋紅液能使染色體著色?！驹斀狻緼、蘚類(lèi)葉片薄，只有一層細(xì)胞，可直接用于觀察葉綠體，菠菜葉由多層細(xì)胞構(gòu)成，但可用菠菜葉稍帶些葉肉的下表皮細(xì)胞來(lái)觀察葉綠體，因?yàn)槿~肉細(xì)胞中有葉綠體，所以能用“菠菜葉”替代“蘚類(lèi)葉片”進(jìn)行高倍顯微鏡觀察葉綠體的實(shí)驗(yàn)，A正確；B、豬是哺乳動(dòng)物，豬成熟紅細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞核和眾多細(xì)胞器，也就不含DNA，而豬肝細(xì)胞含有細(xì)胞核和線粒體等含有DNA的結(jié)構(gòu)，所以不能用“豬成熟紅細(xì)胞”替代“豬肝細(xì)胞”進(jìn)行DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)，B錯(cuò)誤；C、醋酸洋紅液和甲紫溶液都屬于堿性染料，都能使染色體著色，所以在觀察根尖分生區(qū)組織細(xì)胞的有絲分裂實(shí)驗(yàn)中，能用“醋酸洋紅液”替代“甲紫溶液”，C正確；D、肝臟研磨液中含有過(guò)氧化氫酶，所以在比較過(guò)氧化氫在不同條件下的分解實(shí)驗(yàn)中，能用“過(guò)氧化氫酶溶液”替代“肝臟研磨液”，D正確。故選B。5．（2025·河北·高考真題）某科創(chuàng)小組將葉綠素合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)入小麥愈傷組織，獲得再生植株，并進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。下列實(shí)驗(yàn)操作錯(cuò)誤的是（

）A．將種子消毒后，取種胚接種到適當(dāng)?shù)墓腆w培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織B．在提取的DNA溶液中加入二苯胺試劑，沸水浴后觀察顏色以鑒定DNAC．將小麥色素提取液滴加到濾紙條，然后將色素滴加部位浸入層析液進(jìn)行層析D．對(duì)葉片抽氣處理后，轉(zhuǎn)到富含CO2的清水中，探究不同光照下的光合作用強(qiáng)度【答案】C【難度】0.85【知識(shí)點(diǎn)】綠葉中色素的提取和分離實(shí)驗(yàn)、影響光合作用的因素、DNA的粗提取及鑒定、植物組織的培養(yǎng)及基本過(guò)程【分析】色素提取的原理：葉綠體中的色素溶解于有機(jī)溶劑，如無(wú)水乙醇；色素分離的原理：四種色素在層析液中的溶解度不同，因而隨層析液在濾紙上擴(kuò)散的速度不同，溶解度越高，擴(kuò)散速度越快，溶解度越低，擴(kuò)散速度越慢?！驹斀狻緼、將種子消毒后，取種胚接種到適當(dāng)?shù)墓腆w培養(yǎng)基可以誘導(dǎo)愈傷組織，這是植物組織培養(yǎng)中常用的獲取愈傷組織的方法，A正確；B、在提取的DNA溶液中加入二苯胺試劑，沸水浴后會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色反應(yīng)，以此來(lái)鑒定DNA，B正確；C、在進(jìn)行色素層析時(shí)，色素滴加部位不能浸入層析液，否則色素會(huì)溶解在層析液中，無(wú)法在濾紙條上進(jìn)行層析分離，C錯(cuò)誤；D、對(duì)葉片抽氣處理后，轉(zhuǎn)到富含CO2的清水中，通過(guò)觀察不同光照下葉片上浮的情況等可以探究不同光照下的光合作用強(qiáng)度，D正確。故選C。二、多選題6．（2025·河北·高考真題）X染色體上的D基因異常可導(dǎo)致人體患病，在男性中發(fā)病率為1/3500，某患病男孩（其母親沒(méi)有患?。染色體上的基因D和H內(nèi)各有一處斷裂，斷裂點(diǎn)間的染色體片段發(fā)生顛倒重接。研究者對(duì)患兒和母親的DNA進(jìn)行了PCR檢測(cè)，所用引物和擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖。不考慮其他變異，下列分析錯(cuò)誤的是（

）注：引物組合S1和S2，R1和R2可分別用于對(duì)正?；駾和H序列的擴(kuò)增檢測(cè)A．該病患者中男性顯著多于女性，女性中攜帶者的占比為1/3500B．用R1和R2對(duì)母親和患兒DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)的結(jié)果相同C．與正常男性相比，患病男孩X染色體上的基因排列順序發(fā)生改變D．利用S1和S2進(jìn)行PCR檢測(cè)，可診斷母親再次孕育的胎兒是否患該病【答案】AB【難度】0.4【知識(shí)點(diǎn)】伴性遺傳的遺傳規(guī)律及應(yīng)用、PCR擴(kuò)增的原理與過(guò)程【分析】分析題意可知，某患病男孩（其母親沒(méi)有患?。染色體上的基因D和H內(nèi)各有一處斷裂，斷裂點(diǎn)間的染色體片段發(fā)生顛倒重接，故出現(xiàn)染色體倒位?！驹斀狻緼、某患病男孩其母親沒(méi)有患病，可知該病為伴X染色體隱性遺傳病，該病患者中男性顯著多于女性，在男性中發(fā)病率為1/3500，則該致病基因d頻率為1/3500，正?；駾基因頻率為3499/3500，女性中攜帶者的占比為2×1/3500×3499/3500，A錯(cuò)誤；B、該男孩的母親為攜帶者，基因型為XDXd，該男孩基因型為XdY，該男孩的染色體倒位，故用R1和R2不能擴(kuò)增出產(chǎn)物來(lái)，母親有正常的H基因，有產(chǎn)物，故對(duì)母親和患兒DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)的結(jié)果不同，B錯(cuò)誤；C、該男孩的染色體倒位，故與正常男性相比，患病男孩X染色體上的基因排列順序發(fā)生改變，C正確；D、利用S1和S2進(jìn)行PCR檢測(cè)，有產(chǎn)物則含有正常D基因，若無(wú)產(chǎn)物，則含有致病基因，故可診斷母親再次孕育的胎兒是否患該病，D正確。故選AB。二、解答題7．（2025·河南·高考真題）某二倍體植物松散株型與緊湊株型是一對(duì)相對(duì)性狀，緊湊株型適合高密度種植，利于增產(chǎn)。研究人員獲得了一個(gè)緊湊株型的植株，為研究控制該性狀的基因，將其與純合松散株型植株雜交，F(xiàn)1均為松散株型，F(xiàn)2中松散株型：緊湊株型=3：1，控制該相對(duì)性狀的基因?yàn)锳/a?；卮鹣铝袉?wèn)題：(1)該緊湊株型性狀由（填“A”或“a”）基因控制。(2)在A基因編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域中插入一段序列得到a基因（圖1），a基因表達(dá)的肽鏈比A基因表達(dá)的肽鏈短。造成此現(xiàn)象的原因是。(3)研究人員設(shè)計(jì)了3條引物（P1~P3），位置如圖1（→表示引物5′→3′方向）。以3個(gè)F2單株（甲、乙、丙）的DNA為模板，使用不同引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分別為圖2-A和2-B（不考慮PCR結(jié)果異常）。①圖2-A中使用的引物組合是；丙單株無(wú)擴(kuò)增條帶的原因是。②結(jié)合圖2-A的擴(kuò)增結(jié)果，在圖2-B中，參照甲的條帶補(bǔ)充乙與丙的電泳條帶（將正確條帶涂黑）。③使用圖2-A中的引物組合擴(kuò)增F2全部樣本，有擴(kuò)增條帶松散株型：無(wú)擴(kuò)增條帶松散株型=。【答案】(1)a(2)插入序列后，a基因中編碼終止密碼子的序列提前，a基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA提前終止翻譯(3)P2和P3丙的基因型為AA，無(wú)引物P3的結(jié)合序列，利用引物P2和P3擴(kuò)增時(shí)，無(wú)法得到擴(kuò)增產(chǎn)物2∶1【難度】0.65【知識(shí)點(diǎn)】基因分離定律的實(shí)質(zhì)和應(yīng)用、遺傳信息的翻譯、PCR擴(kuò)增的原理與過(guò)程、性狀的顯、隱性關(guān)系及基因型、表現(xiàn)型、等位基因【分析】基因分離定律的實(shí)質(zhì)：雜合體內(nèi)，等位基因在減數(shù)分裂形成配子時(shí)隨同源染色體的分開(kāi)而分離，進(jìn)入兩個(gè)不同的配子，獨(dú)立的隨配子遺傳給后代。【詳解】（1）根據(jù)題意可知，研究人員獲得了一個(gè)緊湊株型的植株，為研究控制該性狀的基因，將其與純合松散株型植株雜交，F(xiàn)1均為松散株型，F(xiàn)2中松散株型∶緊湊株型=3∶1，說(shuō)明緊湊株型為隱性性狀，由a基因控制。（2）在A基因編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域中插入一段序列得到a基因（圖1），a基因表達(dá)的肽鏈比A基因表達(dá)的肽鏈短，說(shuō)明終止密碼子提前出現(xiàn)，因此推測(cè)可能是A基因內(nèi)部插入一段序列后，使a基因中編碼終止密碼子的序列提前，a基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA提前終止翻譯。（3）①子二代中的基因型為AA、Aa、aa，根據(jù)圖示可知，A和a基因上均含有P1和P2引物互補(bǔ)的序列，而P3引物識(shí)別的序列只有a基因中才存在，若選擇引物P1和P2進(jìn)行擴(kuò)增，則A基因和a基因均能擴(kuò)增出相應(yīng)產(chǎn)物，只是a基因擴(kuò)增的產(chǎn)物長(zhǎng)度要大于A基因擴(kuò)增的產(chǎn)物，即AA的個(gè)體擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶與aa的個(gè)體擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶不同，且Aa的個(gè)體擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶應(yīng)為兩條，與圖A不符，若選擇引物P3和P2進(jìn)行擴(kuò)增，則只有Aa和aa的個(gè)體中因含有a基因而能擴(kuò)增出產(chǎn)物，且擴(kuò)增出的產(chǎn)物電泳條帶相同，而AA的個(gè)體由于不含與P3引物結(jié)合的序列，因此不能擴(kuò)增出產(chǎn)物，沒(méi)有對(duì)應(yīng)的電泳條帶。即圖2-A中使用的引物組合是P2和P3，丙的基因型為AA，無(wú)引物P3的結(jié)合序列，利用引物P2和P3擴(kuò)增時(shí)，無(wú)法得到擴(kuò)增產(chǎn)物。②圖A是利用引物P3和P2擴(kuò)增后電泳的結(jié)果，則圖B是利用引物P1和P2擴(kuò)增的產(chǎn)物電泳的結(jié)果，由于a基因擴(kuò)增出來(lái)的產(chǎn)物長(zhǎng)度大于A基因擴(kuò)增的產(chǎn)物，因此AA（松散株型）、aa（緊湊株型）基因的個(gè)體擴(kuò)增的產(chǎn)物電泳時(shí)均只有一個(gè)條帶，且aa基因的個(gè)體擴(kuò)增的產(chǎn)物電泳時(shí)形成的電泳條帶距離點(diǎn)樣孔近，而Aa（松散株型）的個(gè)體擴(kuò)增的產(chǎn)物電泳時(shí)會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)電泳條帶，故乙與丙的電泳條帶為。③使用圖2-A中的引物組合（P3和P2）擴(kuò)增F2全部樣本，由于只有含a基因的個(gè)體才能擴(kuò)增出相應(yīng)產(chǎn)物，且A-為松散株型，而子二代中Aa∶AA=2∶1，所以使用圖2-A中的引物組合擴(kuò)增F2全部樣本，有擴(kuò)增條帶松散株型（Aa）∶無(wú)擴(kuò)增條帶松散株型（AA）=2∶1。8．（2025·云南·高考真題）冬瓜果面有蠟粉可提高果實(shí)抗病、耐日灼和耐儲(chǔ)性。為探究冬瓜果面蠟粉的遺傳方式并對(duì)蠟粉基因（用“A”“a”表示）進(jìn)行定位，科研人員進(jìn)行了一系列雜交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表。群體植株總數(shù)/株果面有蠟粉株數(shù)/株果面無(wú)蠟粉株數(shù)/株P(guān)130300P230030F15235230F2574430144注：F1為P1和P2雜交后代，F(xiàn)2為F1自交后代。回答下列問(wèn)題：(1)根據(jù)雜交結(jié)果可知，果面蠟粉的遺傳遵循基因的定律，依據(jù)是。(2)實(shí)驗(yàn)證明蠟粉性狀的改變是由基因突變引起的，突變基因上出現(xiàn)了一個(gè)限制酶H的切割位點(diǎn)，可用于在苗期篩選出果實(shí)表面有蠟粉的植株，據(jù)此設(shè)計(jì)引物后進(jìn)行植株基因型鑒定的步驟為：提取基因組DNA→目的DNA片段→限制酶H切割擴(kuò)增產(chǎn)物→電泳。結(jié)果顯示P1植株為1條條帶，P2植株為2條條帶，則F2中有蠟粉的植株為條條帶，限制酶H的切割位點(diǎn)位于（填“A”“a”或“A和a”）上。(3)用表中材料設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證（1）中得到的結(jié)論，寫(xiě)出所選材料及遺傳圖解。【答案】(1)分離F2中出現(xiàn)3:1的性狀分離比，符合一對(duì)等位基因的遺傳規(guī)律(2)PCR擴(kuò)增1或3a(3)選用材料：F1植株和P2植株遺傳圖解【難度】0.65【知識(shí)點(diǎn)】基因分離定律的實(shí)質(zhì)和應(yīng)用、PCR擴(kuò)增的原理與過(guò)程、DNA重組技術(shù)的基本工具【分析】基因分離定律：在生物的體細(xì)胞中，控制同一性狀的遺傳因子成對(duì)存在，不相融合；在形成配子時(shí)，成對(duì)的遺傳因子發(fā)生分離，分離后的遺傳因子分別進(jìn)入不同的配子中，隨配子遺傳給后代。【詳解】（1）根據(jù)雜交結(jié)果可知，果面蠟粉的遺傳遵循基因的分離定律，因?yàn)镕1自交得到的F2中，果面有蠟粉株數(shù)與果面無(wú)蠟粉株數(shù)之比約為3：1（430：144≈3：1），符合基因分離定律中雜合子自交后代性狀分離比3：1的比值。（2）要進(jìn)行植株基因型鑒定，在提取基因組DNA后，需要通過(guò)PCR擴(kuò)增目的DNA片段。P1植株為1條條帶，P2植株為2條條帶，說(shuō)明P1為純合子且其基因不能被限制酶H切割（假設(shè)P1基因型為AA），P2為純合子且其基因能被限制酶H切割（假設(shè)P2基因型為aa），限制酶H的切割位點(diǎn)位于a上。F1基因型為Aa，F(xiàn)2中有蠟粉的植株基因型為AA或Aa。AA只有1條條帶（不能被切割），Aa會(huì)有3條條帶（A不能被切割為1條，a被切割為2條），所以F2中有蠟粉的植株為1條或3條條帶。（3）驗(yàn)證分離定律，采用測(cè)交的方法，所選材料：F1Aa與P2aa（測(cè)交實(shí)驗(yàn)可以驗(yàn)證基因的分離定律）。9．（2025·北京·高考真題）學(xué)習(xí)以下材料，回答（1）~（4）題。野生動(dòng)物個(gè)體識(shí)別的新方法識(shí)別野生動(dòng)物個(gè)體有助于野外生態(tài)學(xué)的研究。近年，人們發(fā)現(xiàn)可以從動(dòng)物糞便中提取該動(dòng)物的DNA，PCR擴(kuò)增特定的DNA片段，測(cè)定產(chǎn)物的長(zhǎng)度或序列，據(jù)此可識(shí)別個(gè)體，在此基礎(chǔ)上可以獲得野生動(dòng)物的多種生態(tài)學(xué)信息。微衛(wèi)星DNA是一種常用于個(gè)體識(shí)別的DNA片段，廣泛分布于核基因組中。每個(gè)微衛(wèi)星DNA是一段串聯(lián)重復(fù)序列，每個(gè)重復(fù)單位長(zhǎng)度為2~6bp（堿基對(duì)），重復(fù)數(shù)可以達(dá)到幾十個(gè)（圖1）．基因組中有很多個(gè)微衛(wèi)星DNA，分布在不同位置。每個(gè)位置的微衛(wèi)星DNA可視為一個(gè)“基因”，由于重復(fù)單位的數(shù)目不同，同一位置的微衛(wèi)星“基因”可以有多個(gè)“等位基因”，能組成多種“基因型”．分析多個(gè)微衛(wèi)星“基因”，可得到個(gè)體特異的“基因型”組合，由此區(qū)分開(kāi)不同的個(gè)體。依據(jù)微衛(wèi)星“基因”兩側(cè)的旁鄰序列（圖1），設(shè)計(jì)并合成特異性引物，PCR擴(kuò)增后，檢測(cè)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度，即可得知所測(cè)個(gè)體的“等位基因”（以片段長(zhǎng)度命名），進(jìn)而獲得該個(gè)體的“基因型”。例如，圖2是對(duì)某種哺乳動(dòng)物個(gè)體A和B的一個(gè)微衛(wèi)星“基因”進(jìn)行擴(kuò)增后電泳分析的結(jié)果示意圖，個(gè)體A的“基因型”為177/183。

有一個(gè)遠(yuǎn)離大陸的孤島，陸生哺乳動(dòng)物幾乎無(wú)法到達(dá)，人類(lèi)活動(dòng)將食肉動(dòng)物貉帶到該島上?？茖W(xué)家在島上采集貉的新鮮糞便，提取DNA，擴(kuò)增并分析了10個(gè)微衛(wèi)星“基因”，結(jié)果在30份樣品中成功鑒定出個(gè)體（如表）。幾個(gè)月后再次采集貉的新鮮糞便，進(jìn)行同樣的分析，在40份樣品中成功鑒定出個(gè)體（如表）。據(jù)此，科學(xué)家估算出該島上貉的種群數(shù)量。兩次采樣所鑒定出的貉的個(gè)體編號(hào)第一次采集的30份糞便樣品所對(duì)應(yīng)的個(gè)體編號(hào)N01N02N03N04N05N06N07N08N08N09N10N11N12N12N13N14N14N15N16N17N18N18N19N20N21N22N22N23N24N24第二次采集的40份糞便樣品所對(duì)應(yīng)的個(gè)體編號(hào)N03N04N05N08N09N09N12N14N18N23N24N25N26N26N26N27N28N29N30N30N31N32N32N33N33N33N34N35N36N37N38N39N40N41N42N43N44N44N45N46(1)圖2中個(gè)體B的“基因型”為。(2)使用微衛(wèi)星DNA鑒定個(gè)體時(shí)，能區(qū)分的個(gè)體數(shù)是由微衛(wèi)星“基因”的數(shù)目和的數(shù)目決定的。(3)科學(xué)家根據(jù)表1信息，使用了法的原理來(lái)估算這個(gè)島上貉的種群數(shù)量，計(jì)算過(guò)程及結(jié)果為。(4)在上述研究基礎(chǔ)上，利用現(xiàn)有DNA樣品，設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)方案，了解該島貉種群的性別比例?！敬鸢浮?1)174/174(2)重復(fù)單位(3)標(biāo)記重捕根據(jù)標(biāo)記重捕法的計(jì)算公式N=（M×n）/m，則該島上豹的種群數(shù)量N=(24×32)/10≈77（只）。(4)從現(xiàn)有DNA樣品中，選擇Y染色體上特有的微衛(wèi)星DNA序列，設(shè)計(jì)特異性引物；對(duì)所有DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增；對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，若能擴(kuò)增出相應(yīng)條帶，則該個(gè)體為雄性，若不能擴(kuò)增出相應(yīng)條帶，則該個(gè)體為雌性；統(tǒng)計(jì)雄性和雌性個(gè)體的數(shù)量，從而計(jì)算出該島豹種群的性別比例?！倦y度】0.4【知識(shí)點(diǎn)】種群密度的調(diào)查方法及應(yīng)用、PCR擴(kuò)增的原理與過(guò)程【分析】標(biāo)記重捕法是一種用于估算動(dòng)物種群數(shù)量的常用方法。其原理是在被調(diào)查種群的活動(dòng)范圍內(nèi)，捕獲一部分個(gè)體，做上標(biāo)記后再放回原來(lái)的環(huán)境，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后進(jìn)行重捕，根據(jù)重捕到的動(dòng)物中標(biāo)記個(gè)體數(shù)占總個(gè)體數(shù)的比例，來(lái)估計(jì)種群密度。標(biāo)記重捕法適用于活動(dòng)能力強(qiáng)、活動(dòng)范圍大的動(dòng)物，使用時(shí)需要滿足一定條件，比如標(biāo)記個(gè)體與未標(biāo)記個(gè)體在重捕時(shí)被捕獲的概率相等，在調(diào)查期間沒(méi)有個(gè)體遷入、遷出、出生、死亡等。【詳解】（1）從圖2中可知，個(gè)體B擴(kuò)增后的電泳條帶對(duì)應(yīng)的片段只有長(zhǎng)度為174，根據(jù)“以片段長(zhǎng)度命名”等位基因進(jìn)而確定基因型的規(guī)則，個(gè)體B的“基因型”為174/174。（2）根據(jù)題干信息“每個(gè)位置的微衛(wèi)星DNA可視為一個(gè)‘基因’，由于重復(fù)單位的數(shù)目不同，同一位置的微衛(wèi)星‘基因’可以有多個(gè)‘等位基因’，能組成多種‘基因型’，分析多個(gè)微衛(wèi)星‘基因’，可得到個(gè)體特異的‘基因型’組合，由此區(qū)分開(kāi)不同的個(gè)體”可知，使用微衛(wèi)星DNA鑒定個(gè)體時(shí)，能區(qū)分的個(gè)體數(shù)是由微衛(wèi)星“基因”的數(shù)目和重復(fù)單位的數(shù)目決定的。（3）科學(xué)家采用了標(biāo)記重捕法的原理來(lái)估算種群數(shù)量。第一次采集30份糞便樣品鑒定出24個(gè)不同個(gè)體（相當(dāng)于標(biāo)記數(shù)M=24），第二次采集40份糞便樣品鑒定出32個(gè)不同個(gè)體（相當(dāng)于重捕數(shù)n=32），其中兩次都有的個(gè)體數(shù)為10個(gè)（相當(dāng)于重捕中被標(biāo)記的個(gè)體數(shù)m=10）。根據(jù)標(biāo)記重捕法的計(jì)算公式N=（M×n）/m，則該島上豹的種群數(shù)量N=(24×32)/10≈77（只）。（4）從現(xiàn)有DNA樣品中，選擇Y染色體上特有的微衛(wèi)星DNA序列，設(shè)計(jì)特異性引物。對(duì)所有DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，若能擴(kuò)增出相應(yīng)條帶，則該個(gè)體為雄性；若不能擴(kuò)增出相應(yīng)條帶，則該個(gè)體為雌性。統(tǒng)計(jì)雄性和雌性個(gè)體的數(shù)量，從而計(jì)算出該島豹種群的性別比例。10．（2025·江蘇·高考真題）川金絲猴是我國(guó)特有的珍稀瀕危物種，為了更好地保護(hù)這一物種，研究者開(kāi)展了以下研究。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：(1)川金絲猴警戒行為具有監(jiān)測(cè)捕食者和同種個(gè)體的功能，這說(shuō)明生物之間的關(guān)系有。川金絲猴的警戒行為依賴于環(huán)境中獲取的信息，信息類(lèi)型有。川金絲猴根據(jù)這些信息及時(shí)作出反應(yīng)，一方面可以降低被捕食風(fēng)險(xiǎn)，另一方面為爭(zhēng)奪獲得更多機(jī)會(huì)。(2)川金絲猴以植食為主，消化道中部分微生物直接參與高纖維食物的消化，這些微生物與川金絲猴構(gòu)成關(guān)系。(3)研究者為了進(jìn)一步研究川金絲猴的食性，采集其糞便樣本，進(jìn)行DNA提取、擴(kuò)增，部分實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下。請(qǐng)完成下表：實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮?jiǎn)要操作步驟釋放DNA在去雜后的樣本中加入裂解液析出DNA離心后?、?，加入乙醇②在沉淀物中加入純水?dāng)U增DNA將③、引物、樣本DNA、含有Mg2?緩沖液、超純水等加入PCR管中，進(jìn)行PCR(4)為分析川金絲猴攝食的植物種類(lèi)，研究者設(shè)計(jì)一對(duì)引物F和R，能同時(shí)擴(kuò)增出不同種植物葉綠體中的rbeL基因片段，是因?yàn)橐颋和R的堿基能與rbcL基因的保守序列的堿基。用引物F和R對(duì)4種植物樣本甲~丁的葉綠體基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，結(jié)果如圖所示。若對(duì)4個(gè)樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA電泳條帶分析，能檢出的樣本是。研究者用引物F和R對(duì)川金絲猴糞便DNA進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，得到的序列有圖中的3種序列，據(jù)此可確定川金絲猴攝食的植物有。若要更準(zhǔn)確鑒定出川金絲猴攝食的植物，參照葉綠體基因庫(kù)，還需選用的保守序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)川金絲猴糞便DNA進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序分析。注：“·”表示與植物甲對(duì)應(yīng)位置上相同的堿基：“……”表示省略200個(gè)堿基(5)依據(jù)上述研究，保護(hù)川金絲猴可采取的措施有（填字母）。a．建立川金絲猴生態(tài)廊道，促進(jìn)種群間基因交流

b．保護(hù)川金絲猴棲息地的植被和它喜食的植物c．需用標(biāo)記重捕法定期重捕，以精確監(jiān)測(cè)種群數(shù)量

d．主要依賴遷地保護(hù)，擴(kuò)大川金絲猴種群數(shù)量【答案】(1)捕食和種內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)物理信息、化學(xué)信息、行為信息食物和空間、配偶等(2)互利共生(3)上清液溶解DNA4種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶(4)互補(bǔ)配對(duì)丁丙丁葉綠體基因組其他DNA片段(5)ab【難度】0.4【知識(shí)點(diǎn)】群落中生物的種間關(guān)系、生態(tài)系統(tǒng)中信息的種類(lèi)、作用及傳遞過(guò)程、生物多樣性喪失原因及其保護(hù)措施、PCR擴(kuò)增的原理與過(guò)程【分析】生態(tài)系統(tǒng)中信息的種類(lèi)(1)物理信息：生態(tài)系統(tǒng)中的光、聲、溫度、濕度、磁力等，通過(guò)物理過(guò)程傳遞的信息，如蜘蛛網(wǎng)的振動(dòng)頻率；(2)化學(xué)信息：生物在生命活動(dòng)中，產(chǎn)生了一些可以傳遞信息的化學(xué)物質(zhì)，如植物的生物堿、有機(jī)酸，動(dòng)物的性外激素等；(3)行為信息：動(dòng)物的特殊行為，對(duì)于同種或異種生物也能夠傳遞某種信息，如孔雀開(kāi)屏。【詳解】（1）捕食者與川金絲猴是捕食關(guān)系，川金絲猴和同種個(gè)體之間是種內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。生態(tài)系統(tǒng)中信息的種類(lèi)有物理信息、化學(xué)信息和行為信息。川金絲猴根據(jù)這些信息及時(shí)作出反應(yīng)，一方面可以降低被捕食風(fēng)險(xiǎn)，另一方面為爭(zhēng)奪食物和空間等資源獲得更多機(jī)會(huì)。（2）川金絲猴以植食為主，消化道中部分微生物直接參與高纖維食物的消化，這些微生物從川金絲猴胃內(nèi)獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，又能為川金絲猴分解纖維素，兩者構(gòu)成互利共生關(guān)系。（3）研究者為了進(jìn)一步研究川金絲猴的食性，采集其糞便樣本，進(jìn)行DNA提取、擴(kuò)增，部分實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下：釋放DNA：在去雜后的樣本中加入裂解液，細(xì)胞裂解，內(nèi)容物釋放，→析出DNA：DNA呈溶解狀態(tài)，離心后?、偕锨逡?，再加入乙醇，DNA不溶于酒精→故在沉淀物中加入純水，②再次溶解DNA→擴(kuò)增DNA：PCR擴(kuò)增DNA，需要將③4種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶、引物、樣本DNA、含有Mg2?緩沖液、超純水等加入PCR管中，進(jìn)行PCR。（4）為分析川金絲猴攝食的植物種類(lèi)，研究者設(shè)計(jì)一對(duì)引物F和R，能同時(shí)擴(kuò)增出不同種植物葉綠體中的rbeL基因片段，是因?yàn)橐颋和R的堿基能與rbeL基因的保守序列的堿基互補(bǔ)配對(duì)，從而在耐高溫的DNA聚合酶的作用下延伸子鏈。用引物F和R對(duì)4種植物樣本甲~丁的葉綠體基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，結(jié)果如圖所示，可知植物甲乙丙的條帶一樣長(zhǎng)，植物丁的短，對(duì)4個(gè)樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA電泳條帶分析，只能區(qū)分不同長(zhǎng)度的DNA片段，故能檢出的樣本是丁。研究者用引物F和R對(duì)川金絲猴糞便DNA進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，得到的序列有圖中的3種序列，說(shuō)明攝食的植物有三種，甲和乙的序列相同，不能確定，故據(jù)此可確定川金絲猴攝食的植物有丙和丁。選用葉綠體的其他基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)川金絲猴糞便DNA進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序分析，能更準(zhǔn)確鑒定出川金絲猴攝食的植物。（5）a、建立川金絲猴生態(tài)廊道，促進(jìn)種群間基因交流，能夠保護(hù)川金絲猴遺傳多樣性和物種多樣性，a正確；b、保護(hù)川金絲猴棲息地的植被和它喜食的植物，能夠保護(hù)川金絲猴，b正確；c、川金絲猴是我國(guó)特有的珍稀瀕危物種，不能用標(biāo)記重捕法定期重捕，c錯(cuò)誤；d、保護(hù)川金絲猴主要依賴就地保護(hù)，d錯(cuò)誤。故選ab。11．（2025·湖南·高考真題）未成熟豌豆豆莢的綠色和黃色是一對(duì)相對(duì)性狀，科研人員揭示了該相對(duì)性狀的部分遺傳機(jī)制?；卮鹣铝袉?wèn)題：(1)純合綠色豆莢植株與純合黃色豆莢植株雜交，只有一種表型。自交得到的中，綠色和黃色豆莢植株數(shù)量分別為297株和105株，則顯性性狀為。(2)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)：相對(duì)于綠色豆莢植株，黃色豆莢植株中基因H（編碼葉綠素合成酶）的上游缺失非編碼序列G。為探究G和下游H的關(guān)系，研究人員擬將某綠色豆莢植株的基因H突變?yōu)閔（突變位點(diǎn)如圖a所示，h編碼的蛋白無(wú)功能），然后將獲得的Hh植株與黃色豆莢植株雜交，思路如圖a：①為篩選Hh植株，根據(jù)突變位點(diǎn)兩側(cè)序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物提取待測(cè)植株的DNA進(jìn)行PCR。若擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果全為預(yù)測(cè)的1125bp，則基因H可能未發(fā)生突變，或發(fā)生了堿基對(duì)的；若H的擴(kuò)增產(chǎn)物能被酶切為699bp和426bp的片段，而h的酶切位點(diǎn)喪失，則圖b（擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后電泳結(jié)果）中的（填“Ⅰ”“Ⅱ”或“Ⅲ”）對(duì)應(yīng)的是Hh植株。②若圖a的中綠色豆莢：黃色豆莢=1：1，則中黃色豆莢植株的基因型為[書(shū)寫(xiě)以圖a中親本黃色豆莢植株的基因型（△G+H）/（△G+H）為例，其中“△G”表示缺失G]。據(jù)此推測(cè)中黃色豆莢植株產(chǎn)生的遺傳分子機(jī)制是。③若圖a的中兩種基因型植株的數(shù)量無(wú)差異，但豆莢全為綠色，則說(shuō)明?！敬鸢浮?1)綠色(2)替換Ⅱ(G+h)/(△G+H)該植株中基因H上游缺失非編碼序列G，導(dǎo)致基因H不能正常表達(dá)，表現(xiàn)為黃色豆莢非編碼序列G缺失不影響基因H表達(dá)【難度】0.4【知識(shí)點(diǎn)】基因分離定律的實(shí)質(zhì)和應(yīng)用、PCR擴(kuò)增的原理與過(guò)程【分析】判斷性狀顯隱性通常有兩種方法。一是具有相對(duì)性狀的純合親本雜交，子一代所表現(xiàn)出來(lái)的性狀就是顯性性狀，比如本題中純合綠色豆莢植株與純合黃色豆莢植株雜交，F(xiàn)1只有一種表型，此表型對(duì)應(yīng)的性狀即為顯性性狀。二是雜合子自交，后代出現(xiàn)性狀分離，分離比中占比多的那個(gè)性狀為顯性性狀，像本題F1自交得到F2，綠色和黃色豆莢植株數(shù)量比約為3:1，綠色植株數(shù)量多，所以綠色是顯性性狀?！驹斀狻浚?）純合綠色豆莢植株與純合黃色豆莢植株雜交，F(xiàn)1只有一種表型，說(shuō)明F1表現(xiàn)的性狀為顯性性狀。F1自交得到F2，綠色和黃色豆莢植株數(shù)量比約為297:105≈3:1，符合孟德?tīng)柗蛛x定律中雜合子自交后代顯性性狀與隱性性狀的分離比，所以顯性性狀為綠色。（2）①若擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果全為預(yù)測(cè)的1125bp，基因H可能未發(fā)生突變，若發(fā)生突變且產(chǎn)物長(zhǎng)度不變，則可能是發(fā)生了堿基對(duì)的替換。H的擴(kuò)增產(chǎn)物能被酶切為699bp和426bp的片段，h的酶切位點(diǎn)喪失。Hh植株會(huì)產(chǎn)生兩種類(lèi)型的擴(kuò)增產(chǎn)物，一種是H經(jīng)酶切后的699bp和426bp片段，一種是h未被酶切的1125bp片段，所以圖b中的Ⅱ?qū)?yīng)的是Hh植株。②Hh植株與黃色豆莢植株(△G+H)/(△G+H)雜交，若F1?中綠色豆莢：黃色豆莢=1:1，說(shuō)明Hh植株產(chǎn)生了兩種配子G+H和G+h，且黃色豆莢植株只能產(chǎn)生含△G+H的配子，所以F1中黃色豆莢植株的基因型為(G+h)/(△G+H)。中黃色豆莢植株產(chǎn)生的遺傳分子機(jī)制是：該植株中基因H上游缺失非編碼序列G，導(dǎo)致基因H不能正常表達(dá)，表現(xiàn)為黃色豆莢。③若圖a的F1中兩種基因型植株的數(shù)量無(wú)差異，但豆莢全為綠色，說(shuō)明雖然黃色親本中基因H上游缺失G，但H基因仍能正常表達(dá)（或表達(dá)量足夠）合成葉綠素，使豆莢表現(xiàn)為綠色，即非編碼序列G缺失不影響基因H表達(dá)?？键c(diǎn)03基因工程的基本操作程序及應(yīng)用和蛋白質(zhì)工程一、單選題12．（2025·安徽·高考真題）質(zhì)粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，將該質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞后，其編碼的酶可分解X-gal，產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，進(jìn)而形成藍(lán)色菌落，如圖所示?？蒲行〗M以該質(zhì)粒作為載體，采用基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)人源干擾素基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)。下列敘述錯(cuò)誤的是（

）A．使用氯化鈣處理大腸桿菌以提高轉(zhuǎn)化效率，可增加篩選平板上白色和藍(lán)色菌落數(shù)B．如果篩選平板中僅含卡那霉素，生長(zhǎng)出的白色菌落不可判定為含目的基因的菌株C．因質(zhì)粒K中含兩個(gè)標(biāo)記基因，篩選平板中長(zhǎng)出的白色菌落即為表達(dá)目標(biāo)蛋白的菌株D．若篩選平板中藍(lán)色菌落偏多，原因可能是質(zhì)粒K經(jīng)酶切后自身環(huán)化并導(dǎo)入了大腸桿菌【答案】C【難度】0.65【知識(shí)點(diǎn)】將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、目的基因的檢測(cè)與鑒定【分析】基因工程技術(shù)的基本步驟：（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫(kù)中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成；（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等；（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣；（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定。【詳解】A、使用氯化鈣處理大腸桿菌，可使其處于感受態(tài)，提高轉(zhuǎn)化效率，即更多的大腸桿菌能吸收質(zhì)粒，無(wú)論吸收的是含目的基因的重組質(zhì)粒（可能形成白色菌落）還是未重組的質(zhì)粒K（形成藍(lán)色菌落），都可增加篩選平板上白色和藍(lán)色菌落數(shù)，A正確；B、由于僅含卡那霉素，未添加X(jué)-gal，無(wú)論導(dǎo)入的是重組質(zhì)粒還是空白質(zhì)粒，因不含X-gal，無(wú)法產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，故生長(zhǎng)出的菌落均為白色，B正確；C、篩選平板中長(zhǎng)出的白色菌落，可能是導(dǎo)入了重組質(zhì)粒（含目的基因），但也可能是雖然導(dǎo)入了質(zhì)粒但目的基因沒(méi)有成功表達(dá)目標(biāo)蛋白，不能僅僅因?yàn)槭前咨渚团卸楸磉_(dá)目標(biāo)蛋白的菌株，C錯(cuò)誤；D、若篩選平板中藍(lán)色菌落偏多，原因可能是質(zhì)粒K經(jīng)酶切后自身環(huán)化并導(dǎo)入了大腸桿菌，因?yàn)樽陨憝h(huán)化的質(zhì)粒K中β-半乳糖苷酶基因完整，能表達(dá)活性β-半乳糖苷酶，分解X-gal形成藍(lán)色菌落，D正確。故選C。二、解答題13．（2025·陜晉青寧卷·高考真題）馬鈴薯作為重要農(nóng)作物，提高其冷耐受性可拓展優(yōu)質(zhì)馬鈴薯的種植區(qū)域。我國(guó)科研人員發(fā)現(xiàn)，野生馬鈴薯中S基因的表達(dá)與其冷耐受性調(diào)控有關(guān)，將該基因?qū)朐耘囫R鈴薯中可顯著增強(qiáng)其抗寒能力?；卮鹣铝袉?wèn)題。(1)PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，需要模板DNA、引物、、含Mg2+的緩沖液和耐高溫的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的步驟中起作用。(2)圖中標(biāo)識(shí)了載體和S基因中限制酶的切割位點(diǎn)。為將S基因正確插入載體，PCR擴(kuò)增S基因時(shí)需在引物的（填“5'端”或“3'端”）添加限制酶識(shí)別序列，結(jié)合上表分析，上游引物應(yīng)添加的堿基序列是5'--3'，切割載體時(shí)應(yīng)選用的兩種限制酶是，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和載體分別被限制酶切割后，經(jīng)純化和連接，獲得含S基因的表達(dá)載體并導(dǎo)入農(nóng)桿菌。(3)用攜帶S基因的農(nóng)桿菌侵染栽培馬鈴薯愈傷組織時(shí)，基因表達(dá)載體中T-DNA進(jìn)入愈傷組織細(xì)胞，將S基因整合到，抗性基因可用于篩選成功轉(zhuǎn)化的愈傷組織。該愈傷組織經(jīng)形成芽、根，繼續(xù)培育可獲得抗寒能力顯著增強(qiáng)的馬鈴薯植株?！敬鸢浮?1)4種脫氧核苷酸延伸(2)5'端AGATCTBamHⅠ、EcoRⅠ(3)栽培馬鈴薯愈傷組織細(xì)胞的染色體上2再分化【難度】0.4【知識(shí)點(diǎn)】植物組織培養(yǎng)技術(shù)綜合、基因工程的操作程序綜合【分析】1、基因工程的步驟：目的基因的提取、目的基因與運(yùn)載體結(jié)合、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、目的基因的檢測(cè)與鑒定。2、對(duì)限制酶選擇條件：不能破壞目的基因和啟動(dòng)子、終止子，以便于目的基因和載體正確連接?！驹斀狻浚?）PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，需要模板DNA、引物、4種脫氧核苷酸、含Mg2+的緩沖液和耐高溫的DNA聚合酶。PCR一般分為變性、復(fù)性和延伸三步，其中DNA聚合酶在PCR的延伸步驟中起作用。（2）為了使目的基因能夠被限制酶切割，擴(kuò)增目的基因時(shí)，需要在引物的5'端添加限制酶的識(shí)別序列。結(jié)合圖表分析，在載體的啟動(dòng)子和終止子之間有BamHI、EcoRI和XbaI的識(shí)別序列，而S基因內(nèi)部含有XbaI、NdeI和BamHI的識(shí)別序列，要用BamHI、EcoRI或XbaI切割載體，又不能用XbaI、NdeI或BamHI切割S基因，再根據(jù)各種限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)，可知，需要用BamHI、EcoRI切割載體，用BamHI的同尾酶BglⅡ和EcoRI切割S基因，故PCR擴(kuò)增S基因時(shí)需在上游引物添加的堿基序列是5'-AGATCT-3'。（3）T-DNA屬于可轉(zhuǎn)移DNA，用攜帶S基因的農(nóng)桿菌侵染栽培馬鈴薯愈傷組織時(shí)，基因表達(dá)載體中T-DNA進(jìn)入愈傷組織細(xì)胞，將S基因整合到栽培馬鈴薯愈傷組織細(xì)胞的染色體上，抗性基因1位于T-DNA外部，用于篩選含有重組載體的農(nóng)桿菌，而抗性基因2位于T-DNA內(nèi)部，可用于篩選成功轉(zhuǎn)化的愈傷組織。該愈傷組織經(jīng)再分化形成芽、根，繼續(xù)培育可獲得抗寒能力顯著增強(qiáng)的馬鈴薯植株。14．（2025·廣東·高考真題）大腸桿菌是重要工業(yè)菌株之一，其培養(yǎng)過(guò)程可分為快速生長(zhǎng)期和生長(zhǎng)穩(wěn)定期兩個(gè)階段。為了通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成與降解速率來(lái)動(dòng)態(tài)調(diào)控代謝途徑關(guān)鍵酶的蛋白量，使細(xì)胞適配不同階段的生產(chǎn)需求，研究者設(shè)計(jì)了兩種質(zhì)粒，并以穩(wěn)定性好的紅色熒光蛋白mKate2為模式蛋白。測(cè)試質(zhì)粒功能?；卮鹣铝袉?wèn)題：(1)研究者首先構(gòu)建質(zhì)粒①（圖a）用于在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)C-末端帶SsrA短肽的mKate2，將質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞后，在添加抗生素的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)基上菌落的生長(zhǎng)狀況，結(jié)合PCR及檢測(cè)，篩選獲得重組菌株W1。(2)將W1在適宜條件下進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，定時(shí)取樣檢測(cè)培養(yǎng)液中細(xì)胞密度，方法有（答一種）。接種前需檢測(cè)液體培養(yǎng)基的熒光強(qiáng)度，其作用是。培養(yǎng)結(jié)果（圖b）表明，進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期后熒光強(qiáng)度快速下降，原因是。(3)研究者選用啟動(dòng)子PX、X基因（編碼阻遏蛋白X，阻遏PX開(kāi)啟轉(zhuǎn)錄），重新構(gòu)建質(zhì)粒②（圖a），導(dǎo)入野生型大腸桿菌中獲得重組菌株W2。在適宜條件下?lián)u瓶培養(yǎng)，W2的生長(zhǎng)趨勢(shì)不變，培養(yǎng)期間熒光強(qiáng)度的變化趨勢(shì)為。(4)莽草酸是一種重要工業(yè)化學(xué)品，其胞內(nèi)合成代謝途徑見(jiàn)圖c。由于野生型大腸桿菌胞內(nèi)酶A活性弱，且莽草酸會(huì)被快速轉(zhuǎn)化為細(xì)胞生長(zhǎng)必需物，因此細(xì)胞中無(wú)法大量積累莽草酸。為了保證細(xì)胞正常生長(zhǎng)，并在生長(zhǎng)穩(wěn)定期實(shí)現(xiàn)莽草酸的大量積累，利用上述兩種質(zhì)粒的調(diào)控功能，結(jié)合野生型菌株遺傳物質(zhì)的改造，提出重組生產(chǎn)菌株構(gòu)建思路：?！敬鸢浮?1)熒光(2)稀釋涂布平板法、顯微鏡直接計(jì)數(shù)法排除培養(yǎng)基本身熒光對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾PGro在生長(zhǎng)穩(wěn)定期停止基因轉(zhuǎn)錄，且?guī)в蠸srA短肽的mKate2被降解(3)快速生長(zhǎng)期無(wú)熒光，生長(zhǎng)穩(wěn)定期熒光強(qiáng)度先上升后保持穩(wěn)定(4)先敲除野生菌株中的酶B基因，再將質(zhì)粒①中的mKate2基因替換為酶B基因，將質(zhì)粒②中的mKate2基因替換為酶A基因，并將兩種質(zhì)粒導(dǎo)入野生菌株中【難度】0.15【知識(shí)點(diǎn)】PCR擴(kuò)增的原理與過(guò)程、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、目的基因的檢測(cè)與鑒定、基因工程在農(nóng)牧業(yè)、制藥及環(huán)境等方面的應(yīng)用【分析】1、基因工程技術(shù)的基本步驟：（1）目的基因的獲?。悍椒ㄓ袕幕蛭膸?kù)中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定。2、引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸。引物能使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開(kāi)始連接脫氧核苷酸。用于PCR的引物長(zhǎng)度通常為20—30個(gè)核苷酸。3、啟動(dòng)子是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的上游，緊挨轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終表達(dá)出人類(lèi)需要的蛋白質(zhì)?！驹斀狻浚?）在基因工程中，篩選重組菌株時(shí)，常用的檢測(cè)方法除了PCR，根據(jù)質(zhì)粒中存在紅色熒光蛋白基因，可利用熒光檢測(cè)，篩選獲得重組菌株W1。（2）檢測(cè)培養(yǎng)液中細(xì)胞密度常用的方法有稀釋涂布平板法（通過(guò)統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)來(lái)估算細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)而得到細(xì)胞密度）、顯微鏡直接計(jì)數(shù)法（利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)）。接種前檢測(cè)液體培養(yǎng)基的熒光強(qiáng)度，是為了排除培養(yǎng)基本身熒光對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，作為空白對(duì)照。進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期后，由于PGro在生長(zhǎng)穩(wěn)定期停止基因轉(zhuǎn)錄，所以不再合成帶有SsrA短肽的mKate2，同時(shí)C-末端帶有SsrA短肽的蛋白質(zhì)可被大腸桿菌內(nèi)源蛋白酶系統(tǒng)特異性識(shí)別并以一定速率降解，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度快速下降。（3）在重組菌株W2中，啟動(dòng)子PX被阻遏蛋白X阻遏轉(zhuǎn)錄。在細(xì)胞快速生長(zhǎng)階段，阻遏蛋白X阻遏mKate2基因的表達(dá)；隨著細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定器，阻遏蛋白X停止表達(dá)并被降解，對(duì)PX啟動(dòng)子的阻遏作用降低，mKate2基因開(kāi)始表達(dá)，熒光強(qiáng)度開(kāi)始上升，由于原料的限制，最后保持穩(wěn)定，所以培養(yǎng)期間熒光強(qiáng)度的變化趨勢(shì)為快速生長(zhǎng)期無(wú)熒光，生長(zhǎng)穩(wěn)定期熒光強(qiáng)度先上升后保持穩(wěn)定。（4）為了保證細(xì)胞正常生長(zhǎng)，并在生長(zhǎng)穩(wěn)定期實(shí)現(xiàn)莽草酸的大量積累，利用上述兩種質(zhì)粒的調(diào)控功能，結(jié)合野生型菌株遺傳物質(zhì)的改造，提出重組生產(chǎn)菌株構(gòu)建思路是：首先對(duì)野生型大腸桿菌進(jìn)行改造，敲除酶B基因；然后將質(zhì)粒①中的mKate2基因替換為酶B基因，使相關(guān)代謝途徑關(guān)鍵酶在快速生長(zhǎng)期正常表達(dá)以保證細(xì)胞正常生長(zhǎng)，進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期后該酶降解，減少對(duì)莽草酸的轉(zhuǎn)化；同時(shí)將質(zhì)粒②中的mKate2基因替換為酶A基因，利用其調(diào)控機(jī)制在生長(zhǎng)穩(wěn)定期實(shí)現(xiàn)莽草酸合成相關(guān)基因的穩(wěn)定表達(dá)，從而大量積累莽草酸，最后將兩種質(zhì)粒導(dǎo)入野生菌株。15．（2025·云南·高考真題）我國(guó)研究人員發(fā)明了生產(chǎn)維生素C的兩步發(fā)酵法，流程如圖甲。為了減少氧化葡糖桿菌競(jìng)爭(zhēng)性消耗山梨糖，需要進(jìn)行滅菌以結(jié)束第一步發(fā)酵。在兩步發(fā)酵法的基礎(chǔ)上，我國(guó)研究人員進(jìn)一步嘗試用三菌混菌體系建立一步發(fā)酵法。在氧化葡糖桿菌（原始菌MCS）中利用基因工程技術(shù)導(dǎo)入大腸桿菌基因ccdB，得到工程菌IR3C。MCS和IR3C單菌培養(yǎng)時(shí)，活菌數(shù)變化曲線如圖乙，MCS、IR3C分別與普通生酮基古龍酸菌和巨大芽孢桿菌進(jìn)行三菌混菌發(fā)酵時(shí)，產(chǎn)物含量變化曲線如圖丙。回答下列問(wèn)題：(1)要使基因ccdB在IR3C中穩(wěn)定遺傳、表達(dá)并發(fā)揮作用，構(gòu)建的基因表達(dá)載體除啟動(dòng)子外，還必須有。(2)繪制圖乙需統(tǒng)計(jì)活菌數(shù)，常用方法是。當(dāng)活菌達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，基因ccdB編碼的蛋白質(zhì)開(kāi)始發(fā)揮作用，推測(cè)該蛋白質(zhì)的作用是，開(kāi)始發(fā)揮作用的時(shí)間是，判斷理由是。(3)基于圖丙，利用IR3C三菌混菌發(fā)酵的產(chǎn)量（填“高于”或“低于”）MCS三菌混菌發(fā)酵的產(chǎn)量，其原因是?！敬鸢浮?1)標(biāo)記基因、目的基因、終止子、復(fù)制原點(diǎn)(2)稀釋涂布平板法能抑制細(xì)菌增殖15h在15h時(shí)，IR3C數(shù)量下降，而MSC數(shù)量上升(3)高于IR3C轉(zhuǎn)入了ccdB基因，阻止細(xì)胞增殖，減少氧化葡糖桿菌競(jìng)爭(zhēng)性消耗山梨糖，從而更多山梨糖被用于合成維生素C。【難度】0.65【知識(shí)點(diǎn)】微生物的接種方法、基因工程在農(nóng)牧業(yè)、制藥及環(huán)境等方面的應(yīng)用【分析】基因工程是指按照人類(lèi)的愿望，將不同生物的遺傳物質(zhì)在體外人工剪切并和載體重組后轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，并表達(dá)產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)的技術(shù)，基因工程能夠打破種屬的界限，在基因水平上改變生物遺傳性，并通過(guò)工程化為人類(lèi)提供有用產(chǎn)品及服務(wù)?！驹斀狻浚?）基因工程中構(gòu)建的基因表達(dá)載體，除啟動(dòng)子外、還要有標(biāo)記基因、目的基因、終止子、復(fù)制原點(diǎn)等。（2）統(tǒng)計(jì)活菌數(shù)目常用稀釋涂布平板法，從圖2看出，隨著時(shí)間推移，種群數(shù)量不斷增加，在15h時(shí)，IR3C數(shù)量下降，而MSC數(shù)量上升，所以推測(cè)轉(zhuǎn)入的基因ccdB編碼的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)能抑制細(xì)菌增殖或誘導(dǎo)細(xì)菌凋亡，發(fā)揮作用的時(shí)間大約在15h。（3）從圖丙看出，IR3C三菌混菌發(fā)酵產(chǎn)生的2-酮-L-古龍酸含量比MSC三菌混菌發(fā)酵產(chǎn)量高，因此可以推測(cè)，IR3C三菌混菌發(fā)酵維生素C產(chǎn)量更高，可能的原因是IR3C轉(zhuǎn)入了ccdB基因，誘導(dǎo)細(xì)菌死亡，減少氧化葡糖桿菌競(jìng)爭(zhēng)性消耗山梨糖，從而更多山梨糖被用于合成維生素C。16．（2025·甘肅·高考真題）水稻白葉枯?。ㄖ仓甑娜~片上會(huì)出現(xiàn)逐漸擴(kuò)大的黃白色至枯白色病斑）由白葉枯病菌引起，嚴(yán)重威脅水稻生產(chǎn)和糧食安全?？茖W(xué)家利用CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)，對(duì)水稻白葉枯病的感病基因SWEET（該基因被白葉枯病菌利用以侵染水稻）的啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行了定點(diǎn)“修改”，編輯后的水稻幼胚通過(guò)植物組織培養(yǎng)技術(shù)獲得抗病植株（如下圖）?；卮鹣铝袉?wèn)題。(1)CRISPR-Cas9重組Ti質(zhì)粒構(gòu)建完成后，可通過(guò)（方法）將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并將整合到該細(xì)胞的染色體上。為了能夠篩選出轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞，需要在植物組織培養(yǎng)基中添加。(2)實(shí)驗(yàn)中用到的水稻幼胚在植物組織培養(yǎng)中被稱為，對(duì)其消毒時(shí)需依次使用酒精和處理。誘導(dǎo)形成再生植株的過(guò)程中需使用生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素，原因是。(3)為了檢測(cè)基因編輯水稻是否成功，首先需采用技術(shù)檢測(cè)目標(biāo)基因的啟動(dòng)子區(qū)是否被成功編輯；然后，在個(gè)體水平需將基因編輯后的水稻與野生型水稻分別接種白葉枯病菌，通過(guò)比較來(lái)驗(yàn)證抗病性。(4)在該研究中，基因編輯成功后的水稻可以抗白葉枯病的原因?yàn)??！敬鸢浮?1)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法Ti質(zhì)粒上的T-DNA潮霉素(2)外植體次氯酸鈉生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素是啟動(dòng)細(xì)胞分裂、脫分化和再分化的關(guān)鍵激素(3)PCR-測(cè)序病斑的大?。ɑ虿“呙娣e、發(fā)病情況等合理答案）(4)對(duì)感病基因SWEET的啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行定點(diǎn)修改后，白葉枯病菌無(wú)法利用該基因侵染水稻。【難度】0.65【知識(shí)點(diǎn)】將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、目的基因的檢測(cè)與鑒定、植物組織培養(yǎng)技術(shù)綜合【分析】基因工程的基本操作程序包括：目的基因的獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，目的基因的檢測(cè)和鑒定。植物組織培養(yǎng)技術(shù)是指在無(wú)菌和人工控制的環(huán)境條件下，將離體的植物器官（如根、莖、葉、花、果實(shí)等）、組織、細(xì)胞以及原生質(zhì)體，培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適宜的培養(yǎng)條件，使其長(zhǎng)成完整植株的技術(shù)。

【詳解】（1）將重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。因?yàn)檗r(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒上的T-DNA（可轉(zhuǎn)移DNA）能夠整合到植物細(xì)胞的染色體DNA上。利用農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞，從而將重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入植物細(xì)胞。為了篩選出轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞，由于重組Ti質(zhì)粒上含有潮霉素抗性基因（HygR），所以需要在植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基中添加潮霉素，只有成功導(dǎo)入重組Ti質(zhì)粒的細(xì)胞才能在含有潮霉素的培養(yǎng)基上存活。（2）在植物組織培養(yǎng)中，離體的植物器官、組織或細(xì)胞被稱為外植體，所以實(shí)驗(yàn)中用到的水稻幼胚被稱為外植體。對(duì)水稻幼胚消毒時(shí)需依次使用酒精、次氯酸鈉處理。在植物組織培養(yǎng)誘導(dǎo)形成再生植株的過(guò)程中，生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素是啟動(dòng)細(xì)胞分裂、脫分化和再分化的關(guān)鍵激素。不同濃度的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的配比可以調(diào)控細(xì)胞的分裂和分化方向，從而誘導(dǎo)形成根和芽等不同的器官，最終形成再生植株。（3）為了檢測(cè)基因編輯水稻是否成功，首先需采用PCR-測(cè)序技術(shù)檢測(cè)目標(biāo)基因的啟動(dòng)子區(qū)是否編輯成功。通過(guò)PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因的啟動(dòng)子區(qū)片段，然后進(jìn)行測(cè)序，與編輯前的序列進(jìn)行對(duì)比，看是否發(fā)生了預(yù)期的改變。在個(gè)體水平需將基因編輯后的水稻與野生型水稻分別接種白葉枯病菌，通過(guò)比較病斑的大小（或病斑面積、發(fā)病情況等）來(lái)驗(yàn)證抗病性。如果基因編輯后的水稻病斑明顯小于野生型水稻，說(shuō)明其抗病性增強(qiáng)。（4）在該研究中，基因編輯成功后的水稻可以抗白葉枯病的原因?yàn)椋簩?duì)感病基因SWEET的啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行定點(diǎn)修改后，白葉枯病菌無(wú)法利用該基因侵染水稻，從而使水稻獲得了抗病性。17．（2025·河南·高考真題）卡拉膠是一類(lèi)源于海洋紅藻的大分子多糖，可被某些細(xì)菌降解為具有多種應(yīng)用前景的卡拉膠寡糖。某研究小組擬篩選具有高活性卡拉膠酶（CG）的菌種用于生產(chǎn)卡拉膠寡糖?；卮鹣铝袉?wèn)題：(1)選擇海藻和海泥作為樣本篩選卡拉膠降解菌的原因是。將培養(yǎng)后的菌液混勻并充分，再接種至微孔板中，經(jīng)培養(yǎng)和篩選獲得了CG活性最高的菌種。(2)為構(gòu)建攜帶cg（CG的編碼基因）的大腸桿菌表達(dá)載體（圖1），對(duì)cg的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，隨后用E.coliDNA連接酶連接。為保證連接準(zhǔn)確性和效率，cg轉(zhuǎn)錄模板鏈的5'端最好含有酶切位點(diǎn)。另有兩組同學(xué)選用了各不相同的雙酶切組合和T4DNA連接酶重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，獲得的部分重組質(zhì)粒分子大小符合預(yù)期，但均無(wú)法使用各自構(gòu)建表達(dá)載體的雙酶切組合進(jìn)行切割，其原因是。

限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)如下：(3)為將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌，需要先用Ca2+處理大腸桿菌細(xì)胞，目的是，隨后在含和的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間后，根據(jù)菌落周?chē)袩o(wú)水解透明圈篩選目的菌株。(4)已知空間上鄰近的兩個(gè)半胱氨酸易形成二硫鍵，從而提升蛋白質(zhì)的耐熱性。為提高CG的耐熱性，研究人員分析了五個(gè)氨基酸位點(diǎn)的空間距離和保守度（保守度值越大表明該位點(diǎn)對(duì)酶的功能越關(guān)鍵），如圖2所示。根據(jù)分析結(jié)果，選擇第位的氨基酸替換成半胱氨酸最合適，原因是。

【答案】(1)在富含卡拉膠的環(huán)境中，存在能夠分解卡拉膠的微生物的可能性較大稀釋(2)BamHI重組質(zhì)粒連接處的序列不再是原來(lái)的限制酶識(shí)別序列(3)使細(xì)胞處于一種能吸收周?chē)h(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)卡拉膠四環(huán)素(4)44該位點(diǎn)的氨基酸空間上離半胱氨酸更近，容易形成二硫鍵，而且保守度低，替換后對(duì)酶功能的影響較小【難度】0.65【知識(shí)點(diǎn)】基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、目的基因的檢測(cè)與鑒定、蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用及實(shí)例分析【分析】基因工程的基本操作步驟主要包括四步：①目的基因的獲取；②基因表達(dá)載體的構(gòu)建；③將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞；④目的基因的檢測(cè)與表達(dá)。其中，基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心?！驹斀狻浚?）卡拉膠是一類(lèi)源于海洋紅藻的大分子多糖，可被某些細(xì)菌降解為具有多種應(yīng)用前景的卡拉膠寡糖。由于在富含卡拉膠的環(huán)境中，存在能夠分解卡拉膠的微生物的可能性較大，因此可選擇海藻和海泥作為樣本篩選卡拉膠降解菌。將培養(yǎng)后的菌液混勻并充分稀釋?zhuān)俳臃N至微孔板中，經(jīng)培養(yǎng)和篩選獲得了CG活性最高的菌種。（2）E.coliDNA連接酶只能連接具有黏性末端的片段，因此切割質(zhì)粒和目的基因時(shí)不能選擇切成平末端的限制酶，即不能選擇EcoRV酶和SmaⅠ酶，而SpeⅠ酶與XbaⅠ酶切割后的黏性末端相同，若選擇SpeⅠ酶與XbaⅠ酶切割，會(huì)出現(xiàn)質(zhì)粒和目的基因的自連、甚至目的基因倒接，因此切割質(zhì)粒時(shí)SpeⅠ酶與XbaⅠ酶中只能選擇一個(gè)，而另一個(gè)限制酶需要選擇BamHⅠ酶，又由于轉(zhuǎn)錄的方向是由啟動(dòng)子→終止子，且mRNA形成的方向是5’→3’，且mRNA與DNA的模板鏈方向相反，因此基因模板鏈的3’應(yīng)靠近啟動(dòng)子，故為保證連接準(zhǔn)確性和效率，cg轉(zhuǎn)錄模板鏈的5'端最好含有BamHI酶切位點(diǎn)。T4DNA連接酶既可以連接平末端，也可連接黏性末端，不同的平末端均可由T4DNA連接酶連接，由于限制酶的識(shí)別序列具有專(zhuān)一性，若連接后的序列不存在最初限制酶的識(shí)別序列，則可能導(dǎo)致重組質(zhì)粒無(wú)法使用各自構(gòu)建表達(dá)載體的雙酶切組合進(jìn)行切割。故另有兩組同學(xué)選用了各不相同的雙酶切組合和T4DNA連接酶重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，獲得的部分重組質(zhì)粒分子大小符合預(yù)期，但均無(wú)法使用各自構(gòu)建表達(dá)載體的雙酶切組合進(jìn)行切割，其原因是重組質(zhì)粒連接處的序列不再是原來(lái)的限制酶識(shí)別序列。（3）為將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌，需要先用Ca2+處理大腸桿菌細(xì)胞，目的是使細(xì)胞處于一種能吸收周?chē)h(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，便于重組DNA進(jìn)入受體細(xì)胞。由于具有高活性卡拉膠酶（CG）的菌種可分解卡拉膠，使其菌落周?chē)纬赏该魅?，且重組質(zhì)粒上含有四環(huán)素抗性基因，因此導(dǎo)入目的基因的大腸桿菌可接種在含卡拉膠和四環(huán)素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間后，根據(jù)菌落周?chē)袩o(wú)水解透明圈篩選目的菌株。（4）據(jù)圖可知，虛線長(zhǎng)度代表氨基酸間的空間距離，由于第44位點(diǎn)的氨基酸空間上離半胱氨酸更近，容易形成二硫鍵，而且保守度低，替換后對(duì)酶功能的影響較小，因此選擇第44位的氨基酸替換成半胱氨酸最合適。18．（2025·湖南·高考真題）非洲豬瘟病毒是一種雙鏈DNA病毒，可引起急性豬傳染病。基因A編碼該病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白A，其在病毒侵入宿主細(xì)胞和誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用?；卮鹣铝袉?wèn)題：(1)制備特定抗原①獲取基因A，構(gòu)建重組質(zhì)粒（該質(zhì)粒的部分結(jié)構(gòu)如圖所示）。重組質(zhì)粒的必備元件包括目的基因、限制酶切割位點(diǎn)、標(biāo)記基因、啟動(dòng)子和等；為確定基因A已連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，應(yīng)選用圖中的一對(duì)引物對(duì)待測(cè)質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小為bp。②將DNA測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌構(gòu)建重組菌。培養(yǎng)重組菌，誘導(dǎo)蛋白A合成。收集重組菌發(fā)酵液進(jìn)行離心，發(fā)現(xiàn)上清液中無(wú)蛋白A，可能的原因是（答出兩點(diǎn)即可）。(2)制備抗蛋白A單克隆抗體用蛋白A對(duì)小鼠進(jìn)行免疫后，將免疫小鼠B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，誘導(dǎo)融合的常用方法有（答出一種即可）。選擇培養(yǎng)時(shí)，對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)和，多次篩選獲得足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的細(xì)胞。體外培養(yǎng)或利用小鼠大量生產(chǎn)的抗蛋白A單克隆抗體，可用于非洲豬瘟的早期診斷?！敬鸢浮?1)終止子、復(fù)制原點(diǎn)P1和P3782重組菌沒(méi)有裂解或沒(méi)有將蛋白A釋放到細(xì)胞外、轉(zhuǎn)速過(guò)高使蛋白A發(fā)生沉淀、蛋白A親水性較差發(fā)生沉淀、蛋白A被大腸桿菌的蛋白酶降解(2)聚乙二醇（PEG）融合法（或滅活病毒誘導(dǎo)法、電融合法）抗體檢測(cè)【難度】0.4【知識(shí)點(diǎn)】基因表達(dá)載體的構(gòu)建、動(dòng)物細(xì)胞融合與單克隆抗體的制備【分析】1基因工程的操作步驟：（1）目的基因的選與獲取：從基因文庫(kù)中獲取目的基因、利用PCR技術(shù)獲取和擴(kuò)增目的基因、化學(xué)方法直接合成目的基因。（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：基因表達(dá)載體是載體的一種，除目的基因、標(biāo)記基因外，它還必須有啟動(dòng)子、終止子(terminator等，這是基因工程的核心步驟。（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：構(gòu)建好的基因表達(dá)載體需要通過(guò)一定的方式才能進(jìn)入受體細(xì)胞。（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定。首先是分子水平的檢測(cè)，包括通過(guò)PCR等技術(shù)檢測(cè)受體細(xì)胞的染色體DNA上是否插入了目的基因或檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA；從轉(zhuǎn)基因生物細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原一抗體雜交，檢測(cè)目的基因是否翻譯成相應(yīng)的蛋白等。其次，還需要進(jìn)行個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定?！驹斀狻浚?）重組質(zhì)粒的必備元件包括目的基因、限制酶切割位點(diǎn)、標(biāo)記基因、啟動(dòng)子和終止子，復(fù)制原點(diǎn)等，終止子能終止轉(zhuǎn)錄過(guò)程。要確定基因A已連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，應(yīng)選用引物P1和P3。因?yàn)镻1與基因A下游的非編碼區(qū)互補(bǔ)配對(duì)，P3與基因A上游且靠近啟動(dòng)子的區(qū)域互補(bǔ)配對(duì)，這樣擴(kuò)增的片段大小為200+582=782bp。將DNA測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌構(gòu)建重組菌，培養(yǎng)后上清液中無(wú)蛋白A，可能的原因有：重組菌沒(méi)有裂解或沒(méi)有將蛋白A釋放到細(xì)胞外，轉(zhuǎn)速過(guò)高使蛋白A發(fā)生沉淀，蛋白A親水性較差發(fā)生沉淀，蛋白A被大腸桿菌的蛋白酶降解。（2）①誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合的常用方法有聚乙二醇（PEG）融合法、滅活病毒誘導(dǎo)法、電融合法等，這里答出其中一種即可，比如聚乙二醇（PEG）融合法。②選擇培養(yǎng)時(shí)，對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測(cè)，多次篩選獲得足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的細(xì)胞。19．（2025·河北·高考真題）為治理水體中對(duì)生物有毒害的鎘污染，研究者構(gòu)建了分泌信號(hào)肽SP7、鎘離子結(jié)合蛋白CADR、定位于細(xì)胞壁的蛋白GP1和黃色熒光蛋白YFP編碼序列融合表達(dá)的載體，轉(zhuǎn)入單細(xì)胞衣藻，實(shí)現(xiàn)CADR大量合成、分泌并定位于細(xì)胞壁，以吸附水體中的鎘離子?；卮鹣铝袉?wèn)題：(1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脫氧核苷酸中，隨著PCR反應(yīng)進(jìn)行，分子數(shù)量逐漸減少的是和。模板與引物在PCR反應(yīng)的階段開(kāi)始結(jié)合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高溫，其原因?yàn)椤?2)載體中可用的酶切位點(diǎn)信息和擬構(gòu)建載體的部分結(jié)構(gòu)如圖1所示。在將CADR、GP1和YFP基因逐個(gè)構(gòu)建到載體時(shí)，為避免錯(cuò)誤連接，需向以上三個(gè)基因的兩端分別添加限制酶識(shí)別序列，其中GPl兩端應(yīng)添加（填兩種限制酶）的識(shí)別序列。用DNA連接酶連接時(shí)，可催化載體和目的基因之間形成鍵。(3)若在熒光顯微鏡下觀察到轉(zhuǎn)基因衣藻表現(xiàn)為，初步表明融合蛋白表達(dá)成功。將轉(zhuǎn)基因衣藻和野生型衣藻置于含鎘離子的培養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時(shí)間后，若轉(zhuǎn)基因衣藻細(xì)胞壁比野生型衣藻細(xì)胞壁的鎘離子含量，則表明融合蛋白能結(jié)合鎘離子。(4)將轉(zhuǎn)基因衣藻和野生型衣藻在不同鎘離子濃度的培養(yǎng)液中培養(yǎng)6天后，檢測(cè)細(xì)胞密度，結(jié)果見(jiàn)圖2。轉(zhuǎn)基因衣藻在含有不同濃度鎘離子的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)均優(yōu)于野生型衣藻的原因可能是。240μmol·L-1鎘離子濃度下，轉(zhuǎn)基因衣藻和野生型衣藻生長(zhǎng)均被明顯抑制的原因可能是。(5)轉(zhuǎn)基因衣藻可用于水體鎘污染治理，與施加化學(xué)藥物法相比，能體現(xiàn)出其環(huán)境治理優(yōu)勢(shì)的兩個(gè)特性是和。（填標(biāo)號(hào)）①衣藻作為生物材料在水體中可自我繁殖②衣藻生長(zhǎng)速率受鎘離子濃度影響③衣藻可吸收水體中能引起富營(yíng)養(yǎng)化的物質(zhì)④衣藻吸附的鎘可沿食物鏈傳遞【答案】(1)脫氧核苷酸引物復(fù)性PCR反應(yīng)需要在高溫條件下進(jìn)行變性步驟（90-95℃使雙鏈DNA解旋為單鏈），普通的DNA聚合酶在高溫下會(huì)變性失活，而耐高溫的DNA聚合酶能在高溫環(huán)境中保持活性，保證PCR反應(yīng)的正常進(jìn)行。(2)SmaⅠ和EcoRⅠ磷酸二酯鍵(3)細(xì)胞表面發(fā)出黃色熒光高(4)轉(zhuǎn)基因衣藻表達(dá)的融合蛋白能結(jié)合鎘離子，降低了鎘離子對(duì)衣藻的毒害作用鎘離子濃度過(guò)高，超出了融合蛋白的吸附能力，對(duì)衣藻產(chǎn)生了嚴(yán)重的毒害作用(5)①③【難度】0.4【知識(shí)點(diǎn)】PCR擴(kuò)增的原理與過(guò)程、基因表達(dá)載體的構(gòu)建【分析】基因工程技術(shù)的基本步驟：（1）目的基因的獲?。悍椒ㄓ袕幕蛭膸?kù)中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定?！驹斀狻浚?）在PCR反應(yīng)中，原料是脫氧核苷酸，隨著反應(yīng)進(jìn)行不斷被消耗，分子數(shù)量逐漸減少；引物在PCR過(guò)程中會(huì)結(jié)合到模板DNA上參與子鏈合成，也會(huì)逐漸減少，所以分子數(shù)量逐漸減少的是引物和脫氧核苷酸。模板與引物在PCR的復(fù)性階段開(kāi)始結(jié)合。在復(fù)性過(guò)程中，溫度降低，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高溫，是因?yàn)镻CR反應(yīng)需要在高溫條件下進(jìn)行變性步驟（90-95℃使雙鏈DNA解旋為單鏈），普通的DNA聚合酶在高溫下會(huì)變性失活，而耐高溫的DNA聚合酶能在高溫環(huán)境中保持活性，保證PCR反應(yīng)的正常進(jìn)行。（2）觀察圖1，要避免錯(cuò)誤連接，GPI兩端應(yīng)添加SmaⅠ和EcoRⅠ的識(shí)別序列。因?yàn)閷ADR、GP1和YFP基因逐個(gè)構(gòu)建到載體時(shí)，使用這兩種限制酶切割可以產(chǎn)生不同的黏性末端，能保證目的基因準(zhǔn)確插入載體。又因?yàn)镹beⅠ和XbaⅠ限制酶切割后產(chǎn)生的黏性末端相同，所以這兩種限制酶只能選一個(gè)，按照連接的順序在將GPl連接到載體時(shí)應(yīng)該用SmaⅠ和EcoRⅠ。DNA連接酶連接時(shí)，可催化載體和目的基因之間形成磷酸二酯鍵，從而將載體和目的基因連接起來(lái)。（3）若在熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞表面發(fā)出黃色熒光，初步表明融合蛋白表達(dá)成功，因?yàn)槿诤系鞍字杏悬S色熒光蛋白YFP，其表達(dá)后會(huì)發(fā)出黃色熒光。將轉(zhuǎn)基因衣藻和野生型衣藻置于含鎘離子的培養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時(shí)間后，若轉(zhuǎn)基因衣藻細(xì)胞壁比野生型衣藻細(xì)胞壁的鎘離子含量高，則表明融合蛋白能結(jié)合鎘離子。因?yàn)槿诤系鞍字械腃ADR可吸附水體中的鎘離子，若融合蛋白發(fā)揮作用，會(huì)使細(xì)胞壁鎘離子含量升高。（4）轉(zhuǎn)基因衣藻在含有不同濃度鎘離子的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)均優(yōu)于野生型衣藻的原因可能是轉(zhuǎn)基因衣藻表達(dá)的融合蛋白能結(jié)合鎘離子，降低了鎘離子對(duì)衣藻的毒害作用。240μmol?L?1鎘離子濃度下，轉(zhuǎn)基因衣藻和野生型衣藻生長(zhǎng)均被明顯抑制的原因可能是鎘離子濃度過(guò)高，超出了融合蛋白的吸附能力，對(duì)衣藻產(chǎn)生了嚴(yán)重的毒害作用。（5）轉(zhuǎn)基因衣藻可用于水體鎘污染治理，與施加化學(xué)藥物相比，能體現(xiàn)出其環(huán)境治理優(yōu)勢(shì)的兩個(gè)特性是①和③。①衣藻作為生物材料在水體中可自我繁殖，能夠持續(xù)發(fā)揮作用；③衣藻可吸收水體中能引起富營(yíng)養(yǎng)化的物質(zhì)，便于后續(xù)處理，而化學(xué)藥物可能存在二次污染等問(wèn)題。20．（2025·湖北·高考真題）某種昆蟲(chóng)病毒的遺傳物質(zhì)為雙鏈環(huán)狀DNA．該病毒具有包膜結(jié)構(gòu)，包膜上的蛋白A與宿主細(xì)胞膜上的受體結(jié)合后，兩者的膜發(fā)生融合，從而使病毒DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行自我復(fù)制?；卮鹣铝袉?wèn)題：(1)要清楚觀察病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)需要使用的顯微鏡類(lèi)型是。(2)體外培養(yǎng)的梭形昆蟲(chóng)細(xì)胞，被上述病毒感染后會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)閳A球形，原因是病毒感染引起了昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)（填細(xì)胞結(jié)構(gòu)名稱）的改變。(3)這類(lèi)病毒的基因組中通常含有抗細(xì)胞凋亡的基因，這類(lèi)基因?qū)Σ《镜纳飳W(xué)意義是：。(4)該病毒DNA能在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制，卻無(wú)法在大腸桿菌中復(fù)制。為解決這一問(wèn)題，可在該病毒的DNA中插入序列，以實(shí)現(xiàn)利用大腸桿菌擴(kuò)增該病毒DNA的目的。(5)用該病毒感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，可以在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到該病毒完整的基因組DNA，但無(wú)對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。推測(cè)其無(wú)法轉(zhuǎn)錄的原因是：。(6)采用脂溶劑處理該病毒顆?？墒共《臼?duì)宿主細(xì)胞的感染性，其原因是：?！敬鸢浮?1)電子顯微鏡(2)細(xì)胞骨架(3)抑制宿主細(xì)胞的凋亡，為病毒的復(fù)制和繁殖提供更多的時(shí)間和場(chǎng)所(4)大腸桿菌復(fù)制原點(diǎn)(5)病毒基因組沒(méi)有在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子(6)蛋白鑲嵌或貫穿于膜上，脂溶劑處理該病毒顆粒使得包膜溶解，包膜上的蛋白A游離，蛋白A與細(xì)胞膜受體結(jié)合不能使病毒DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)【難度】0.65【知識(shí)點(diǎn)】病毒結(jié)構(gòu)、分類(lèi)和增殖、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞【分析】病毒的結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，主要由核酸（DNA或RNA）和蛋白質(zhì)外殼組成。有些病毒在核衣殼之外還有包膜結(jié)構(gòu)。核酸是病毒的遺傳物質(zhì)，儲(chǔ)存著病毒的遺傳信息，控制著病毒的繁殖、變異等生命活動(dòng)。蛋白質(zhì)外殼則起到保護(hù)核酸的作用，同時(shí)還能介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的識(shí)別與結(jié)合。具有包膜的病毒，其包膜一般來(lái)源于宿主細(xì)胞膜或核膜，包膜上鑲嵌著一些糖蛋白刺突，這些刺突有助于病毒吸附和侵入宿主細(xì)胞?！驹斀狻浚?）病毒個(gè)體極其微小，普通光學(xué)顯微鏡無(wú)法清晰觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)，需要使用電子顯微鏡才能清楚觀察病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)。（2）細(xì)胞骨架對(duì)于維持細(xì)胞的形態(tài)具有重要作用，體外培養(yǎng)的梭形昆蟲(chóng)細(xì)胞被病毒感染后轉(zhuǎn)變?yōu)閳A球形，很可能是病毒感染引起了昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架的改變。（3）病毒需要在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行生存和繁殖，細(xì)胞凋亡會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡，不利于病毒的生存和繁殖。病毒基因組中含有的抗細(xì)胞凋亡基因可以抑制宿主細(xì)胞的凋亡，為病毒的復(fù)制和繁殖提供更多的時(shí)間和場(chǎng)所。（4）要使病毒DNA能在大腸桿菌中復(fù)制，需要在病毒DNA中插入大腸桿菌復(fù)制原點(diǎn)序列，這樣才能利用大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行復(fù)制。（5）轉(zhuǎn)錄需要特定的酶等條件，該病毒DNA能進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，但無(wú)對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，可能是因?yàn)椴《净蚪M沒(méi)有在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子。（6）該病毒具有包膜結(jié)構(gòu)，包膜的主要成分是脂質(zhì)等，脂溶劑可以溶解病毒的包膜，蛋白鑲嵌或貫穿于膜上，脂溶劑處理該病毒顆粒使得包膜溶解，包膜上的蛋白A游離，蛋白A與細(xì)胞膜受體結(jié)合不能使病毒DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。21．（2025·黑吉遼蒙卷·高考真題）香樹(shù)脂醇具有抗炎等功效，從植物中提取難度大、產(chǎn)率低。通過(guò)在酵母菌中表達(dá)外源香樹(shù)脂醇合酶基因N，可高效生產(chǎn)香樹(shù)脂醇?；卮鹣铝袉?wèn)題。

(1)可從中查詢基因N的編碼序列，設(shè)計(jì)特定引物。如圖1所示，a鏈為轉(zhuǎn)錄模板鏈，為保證基因N與質(zhì)粒pYL正確連接，需在引物1和引物2的5'端分別引入和限制酶識(shí)別序列。PCR擴(kuò)增基因N，特異性酶切后，利用連接DNA片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒，大小約9.5kb（kb為千堿基對(duì)），假設(shè)構(gòu)建重組質(zhì)粒前后，質(zhì)粒pYL對(duì)應(yīng)部分大小基本不變。(2)進(jìn)一步篩選構(gòu)建的質(zhì)粒，以1-4號(hào)菌株中提取的質(zhì)粒為模板，使用引物1和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳PCR產(chǎn)物，結(jié)果如圖2。在第5組的PCR反應(yīng)中，使用無(wú)菌水代替實(shí)驗(yàn)組的模板DNA，目的是檢驗(yàn)PCR反應(yīng)中是否有的污染。初步判斷實(shí)驗(yàn)組（從“1~4”中選填）的質(zhì)粒中成功插入了基因N，理由是。(3)為提高香樹(shù)脂醇合酶催化效率，將編碼第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的堿基序列替換為編碼丙氨酸的堿基序列，丙氨酸的密碼子有GCA等。a是誘變第240位脯氨酸編碼序列的引物（GCA為誘變序列），b、c、d