命題點(diǎn)3基因工程

II主干整合

i.基因工程的理論基礎(chǔ)

(1)不同生物的DNA分子能拼接起來的理論基礎(chǔ)

①DNA的基本組成單位都是4種脫氧核昔酸。

②DNA分子都遵循堿基互補(bǔ)配對原則。

③雙鏈DNA分子的空間結(jié)構(gòu)都是規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)。

(2)外源基因可以在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的理論基礎(chǔ)

①基因是控制生物性狀的獨(dú)立遺傳單位。

②遺傳信息的傳遞都遵循中心法則。

③生物界共用一套遺傳密碼。

2.基因工程的三種基本工具

識別雙鏈DNA分子的特定核甘酸序

警列，并使每一條鏈中特定部位的磷酸

?限制性內(nèi)二酯鍵斷開

一切核酸酶遜一般用相同限制酶切割載體和目的

基

因方法基因

工

程DNA

的連接醐1①E.coliDNA連接酶只能連接黏性末端

三(注)1②T4DNA連接酶能連接黏性末端和平末端

種

基

本①能在細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制，或整合到

工一受體上，隨受體同步復(fù)制

具DNADNA

一察露一②有一個至多個限制酶切割位點(diǎn)

(特點(diǎn))

一③具有特殊的標(biāo)記基因，便于重組DNA分

子的篩選

3.基因工程的基本操作程序

(1)基因工程的四個主要操作步驟

廣篩選方法：從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能

目的基因的清晰的基因中進(jìn)行篩選

篩選與獲取

一獲取方法：常用PCR特異性地快速

擴(kuò)增目的基因

［位置：基因的上游，緊挨

轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)

啟

(基

核動功能:RNA聚合酶識別和結(jié)

因

心子

表合的部位，驅(qū)動基因的轉(zhuǎn)錄

步

達(dá)組表達(dá)載體

驟目的基因:人們所需要的基因

)載

體1，，位置：目的基因的下游

的孰功能:終止轉(zhuǎn)錄

構(gòu)

建標(biāo)記基因：用于目的基因的檢

測與篩選

「植物：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、花粉管通道法

將目的基因?qū)?/p>

一動物：顯微注射技術(shù)（導(dǎo)人受精卵）

入受體細(xì)胞

一微生物：Ca?+處理法

「分子水平：PCR等技術(shù)、抗原一抗體

目的基因的

雜交

檢測與鑒定.

一個體生物學(xué)水平：抗性、耐性實(shí)驗

（2）基因工程操作程序中的注意點(diǎn)

①目的基因的插入位點(diǎn)不是隨意的，基因表達(dá)需要啟動子與終止子的調(diào)控，所以目的基因應(yīng)

插入在啟動子與終止子之間。當(dāng)需要目的基因在特定細(xì)胞中表達(dá)時，需要利用特定的啟動子,

如目的基因要在乳腺細(xì)胞中表達(dá)時，啟動子要換成乳腺蛋白基因的啟動子。

②基因表達(dá)載體中，啟動子位于目的基因的首端，是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，終止

子位于目的基因的尾端，使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止，而起始密碼子和終止密碼子在mRNA

上。

③植物細(xì)胞的全能性較高，可經(jīng)植物組織培養(yǎng)過程成為完整植物體，因此植物基因工程的受

體細(xì)胞可以是受精卵也可以是體細(xì)胞；高度分化的動物細(xì)胞的全能性受到限制，動物基因工

程中的受體細(xì)胞一般是受精卵。要合成糖蛋白、有生物活性的胰島素等則需要用真核生物，

如酵母菌（需要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的加工、分泌）等。

4.蛋白質(zhì)工程

預(yù)期蛋白質(zhì)的功能

設(shè)計預(yù)廟的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

改造或合成操作

蛋

基因推測應(yīng)片的氨基酸序列

手段白

設(shè)計

改造現(xiàn)有蛋質(zhì)找到并改變相對應(yīng)的脫

流程

白質(zhì)，或制工氧核甘酸序列（基因）或

結(jié)果

造出新的蛋程合成新的基因

獲得所■要的蛋白質(zhì)

白質(zhì)

5.PCR技術(shù)原理與條件

人,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫，是一種在體

亙工外對目的基因的核甘酸序列進(jìn)行大量

復(fù)制的技術(shù)

原理DNA半保留復(fù)制

生”模板DNA、2種引物、4種脫氧核昔

條件

3-酸、耐高溫的DNA聚合酶（TagDNA

技

PC2R術(shù)聚合酶）

理

原勺啰_DNA的合成方向總是從子鏈的5,端向

條

與方向3,端延伸

件

是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序

引物列互補(bǔ)配對的短單鏈核酸，使DNA

聚合酶能從引物的3,端開始連接脫

氧核甘酸

□我短時間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因

6.PCR技術(shù)的過程

變性：加熱超過90℃,DNA解鏈

復(fù)性：冷卻至50℃左右，引物與互補(bǔ)DNA鏈結(jié)合

延伸：加熱到72℃左右，在耐高溫的DNA聚合酶的作用下合成子鏈

（l）PCR技術(shù)中，不需要解旋酶，需要耐高溫的DNA聚合酶。

（2）關(guān)于引物：依據(jù)目的基因兩端的部分核甘酸序列設(shè)計。兩種引物之間以及每種引物內(nèi)部不

能發(fā)生堿基互補(bǔ)配對。有時候引物5,端需要含有某種限制酶的識別序列。

7.DNA的粗提取與鑒定

利用DNA、RNA,蛋白質(zhì)和脂質(zhì)

原理等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，

提取DNA,去除其他成分

DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)

DNA性質(zhì)溶于酒精;DNA能溶于2moi

DNA的

的NaCl溶液

粗提取

與鑒定.在一定溫度下，DNA遇二苯胺試

劑會呈現(xiàn)藍(lán)色

研磨~過濾（取上清液）f加入體積

相等的、預(yù)冷的酒精（體積分?jǐn)?shù)為

.95%）,靜置2~3min一攪拌（或離

心）~取白色絲狀物（或沉淀物）一

溶解一鑒定DNA

8.DNA片段的電泳鑒定

原理在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠

的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)

DNA片|

鑒星凝膠中的DNA分子通過染色，可以在

段的電

泳鑒定|波長為30（）nm的紫外燈下被檢測出來

他篁要避免外源DNA等因素的污染

II真題研究

1.（2023?廣東，11）“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗的基本過程：裂解一分離一沉淀一鑒定。

下列敘述錯誤的是（）

A.裂解：使細(xì)胞破裂釋放出DNA等物質(zhì)

B.分離：可去除混合物中的多糖、蛋白質(zhì)等

C.沉淀：可反復(fù)多次以提高DNA的純度

D.鑒定：加入二苯胺試劑后即呈現(xiàn)藍(lán)色

答案D

解析裂解是使細(xì)胞破裂釋放出DNA等物質(zhì)，針對不同的實(shí)驗材料，可選擇不同的方法破

壞細(xì)胞，如植物細(xì)胞可選擇研磨的方法，而動物細(xì)胞可選擇吸水漲破的方法，A正確；將DNA

溶于NaCl溶液中，加入二苯胺試劑，沸水浴五分鐘，待冷卻后，溶液能呈現(xiàn)藍(lán)色，D錯誤。

2.（2023?廣東，20）種子大小是作物重要的產(chǎn)量性狀。研究者對野生型擬南芥（2〃=10）進(jìn)行誘

變篩選到一株種子增大的突變體。通過遺傳分析和測序，發(fā)現(xiàn)野生型。A/基因發(fā)生一個堿基

G到A的替換，突變后的基因為隱性基因，據(jù)此推測突變體的表型與其有關(guān)，開展相關(guān)實(shí)驗。

回答下列問題：

（1）擬采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將野生型ZM/基因轉(zhuǎn)入突變體植株，若突變體表型確由該突變造成，

則轉(zhuǎn)基因植株的種子大小應(yīng)與_______植株的種子大小相近。

⑵用PCR反應(yīng)擴(kuò)增DAI基因，用限制性內(nèi)切核酸酶對PCR產(chǎn)物和進(jìn)行切割，用

DNA連接酶將兩者連接。為確保插入的DAI基因可以正常表達(dá)，其上下游序列需具備

（3）轉(zhuǎn)化后，T—DNA（其內(nèi)部基因在減數(shù)分裂時不發(fā)生交換）可在基因組單一位點(diǎn)插入，也可

以同時插入多個位點(diǎn)。在插入片段均遵循基因分離及自由組合定律的前提下，選出單一位點(diǎn)

插入的植株，并進(jìn)一步獲得目的基因穩(wěn)定遺傳的植株（如圖），用于后續(xù)驗證突變基因與表型

的關(guān)系。

叵］農(nóng)桿菌（T-DNA攜帶D4/基因和卡那霉素抗性基因）

/花序浸沒于農(nóng)桿菌菌液進(jìn)行轉(zhuǎn)化

卡那霉素選卡那霉素選

T.代擇培養(yǎng)基篩擇培養(yǎng)基篩擇培養(yǎng)基篩

選種子選種子選種子

T代七代T：,代

①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化To代植株并自交，將「代種子播種在選擇培養(yǎng)基上，能夠萌發(fā)并生長的陽性

個體即表示其基因組中插入了o

②Ti代陽性植株自交所得的T2代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基，選擇陽性率約—%

的培養(yǎng)基中幼苗繼續(xù)培養(yǎng)。

③將②中選出的T2代陽性植株（填“自交”“與野生型雜交”或“與突變體雜交”）

所得的T3代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基，陽性率達(dá)到%的培養(yǎng)基中的幼苗

即為目標(biāo)轉(zhuǎn)基因植株。為便于在后續(xù)研究中檢測該突變，研究者利用PCR擴(kuò)增野生型和突變

型基因片段，再使用限制性內(nèi)切核酸酶X切割產(chǎn)物，通過核酸電泳即可進(jìn)行突變檢測，相關(guān)

信息如圖，在電泳圖中將酶切結(jié)果對應(yīng)位置的條帶涂黑。

野

生5'CCTTTTCATT.?…0AGGACTCTGCCTT……TTACAAGTTA3'(

型3'GGAAAAGTAA........CTCCTGAGACGGAA........AATGTTCAAT5'

突

變5'CCTTTTCATT…?\GGACTCTGCCTT……TTACAAGTTA3'(]50bp)

型3'GGAAAAGTAA........CTCCTGAGACGGAA........AATGTTCAAT5'

10........50........(15()bp)

限制性內(nèi)切核酸酶XAAGG；NNNNNNCCTT

識別及切割序列TTCCNNNNNN：GGAA網(wǎng)代表任意核甘酸）

核酸電泳圖標(biāo)準(zhǔn)參照物野生型突變型

150bp

1（X）bp

50bp（bp指核甘酸對）

答案（1）野生型（2）載體啟動子和終止子（3）①DV基因和卡那霉素抗性基因②75

③自交100

核酸電泳圖標(biāo)準(zhǔn)參照物野生型突變型

150bp

1（M）bp

50bp（bp指核甘酸對）

解析（1）根據(jù)題干信息可知，突變后的基因為隱性基因，則野生型ZM/基因為顯性基因，因

此采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將野生型基因轉(zhuǎn)入突變體植株，若突變體表型確由該突變造成，則

轉(zhuǎn)基因植株的種子大小應(yīng)與野生型植株的種子大小相近。（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增ZM/基因后,

應(yīng)該用同種限制性內(nèi)切核酸酶對D4/基因和載體進(jìn)行切割，再用DNA連接酶將兩者連接起

來；在基因表達(dá)載體中，啟動子位于目的基因的上游，終止子位于目的基因的下游，因此為

確保插入的基因可以正常表達(dá)，其上下游序列需具備啟動子和終止子。（3）①根據(jù)題干信

息和圖示分析，將To代植株的花序浸沒在農(nóng)桿菌（T-DNA上含有D4/基因和卡那霉素抗性

基因）菌液中轉(zhuǎn)化，再將獲得的Ti代種子播種在選擇培養(yǎng)基（含有卡那霉素）上，若在選擇培養(yǎng)

基上有能夠萌發(fā)并生長的陽性個體，則說明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因組中插入

了DV基因和卡那霉素抗性基因。②Ti代陽性植株都含有ZM/基因，由于T—DNA（其內(nèi)部

基因在減數(shù)分裂時不發(fā)生交換）可在基因組單一位點(diǎn)插入，也可以同時插入多個位點(diǎn)，所以不

確定是單一位點(diǎn)插入還是多位點(diǎn)插入，若是單一位點(diǎn)插入，相當(dāng)于一對等位基因的雜合子，

其自交后代應(yīng)該出現(xiàn)3：1的性狀分離比，而題干要求選出單一位點(diǎn)插入的植株，因此應(yīng)該選

擇陽性率約75%的培養(yǎng)基中幼苗繼續(xù)培養(yǎng)。③將以上獲得的T2代陽性植株自交，再將得到的

T3代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基上，若某培養(yǎng)基上全部為具有卡那霉素抗性的植株

即為需要選擇的植株，即陽性率達(dá)到100%的培養(yǎng)基中的幼苗即為目標(biāo)轉(zhuǎn)基因植株。根據(jù)圖

示分析，野生型和突變型基因片段的長度都是150bp,野生型基因沒有限制酶X的切割位點(diǎn)，

而突變型的基因有限制酶X的切割位點(diǎn)，結(jié)合圖中的數(shù)據(jù)分析可知，電泳圖中，野生型只有

150bp,突變型有50bp和100bp。

【思維延伸］_判斷與填充

(l)PCR技術(shù)中，提高復(fù)性的溫度能有效減少反應(yīng)非特異條帶的產(chǎn)生(2021?湖北，16)(V)

⑵利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)在No的a和p亞基之間加入一段連接肽，可獲得熱穩(wěn)定的融合型脯

水合酶(Ni),加入連接肽需要通過改造基因?qū)崿F(xiàn)(2021?遼寧，14)(V)

(3)用同樣方法從等體積兔血和雞血中提取的DNA量相近(2019?江蘇，10)(X)

提示：兔血液中的成熟紅細(xì)胞沒有DNA,因此等體積的兔血提取的DNA量小于雞血。

⑷粗提取DNA時，向雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸偏水并攪拌，向過濾后所得濾液中加入

與濾液體積相等的、體積分?jǐn)?shù)為95%的冷卻的酒精后再進(jìn)行過濾，在得到的濾液中加入特定

試劑后容易提取出DNA相對含量較高的白色絲狀物(2021?山東，13)(X)

提示：向雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餌水并攪拌，過濾后在得到的濾液中加入與濾液體積

相等的、體積分?jǐn)?shù)為95%的冷卻的酒精，此時DNA析出，不會進(jìn)入濾液中。

(5)(2018?江蘇，32節(jié)選)為了便于擴(kuò)增的DNA片段與表達(dá)載體連接，需在引物的匕端加上

限制性酶切位點(diǎn)，且常在兩條引物上設(shè)計加入不同的限制性酶切位點(diǎn)，主要目的是使DNA

片段能定向插入表達(dá)載體，減少自連。

(6)(2022.山東，25節(jié)選)為構(gòu)建重組載體，需先設(shè)計引物，通過PCR特異性擴(kuò)增P基因。用

于擴(kuò)增P基因的引物需滿足的條件是能與P基因母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對、短單鏈核酸O

為使PCR產(chǎn)物能被限制酶切割，需在引物上添加相應(yīng)的限制酶識別序列，該限制酶識別序列

應(yīng)添加在引物的5'端(填"3’端”或"5,端”)。

⑺(2019?江蘇，33節(jié)選)為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)

計引物進(jìn)行PCR鑒定。如圖所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置，PCR

鑒定時應(yīng)選擇的一對引物是乙、丙。某學(xué)生嘗試用圖中另外一對引物從某一菌落的質(zhì)粒中擴(kuò)

增出了400bp片段，原因是目的基因反向連接。

(8)(2019?全國I,38節(jié)選)在體外利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時，使反應(yīng)體系中的模板DNA

解鏈為單鏈的條件是加熱至90℃以上。在PCR反應(yīng)中使用hqDNA聚合酶而不使用大腸桿

菌DNA聚合酶的主要原因是TaqDNA聚合酶熱穩(wěn)定性高，而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下

會失活。

⑼（2023?海南，20節(jié)選）基因遞送是植物遺傳改良的重要技術(shù)之一，農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時，

可將外源基因遞送到植物細(xì)胞中的原因是農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，Ti質(zhì)粒中的T—DNA

能將外源基因遞送到植物細(xì)胞中，并與植物細(xì)胞的染色體DNA整合到一起。

叵題組集訓(xùn)

題組一基因工程

1.如圖1中的三個DNA片段上依次表示出了EcoRI、BamnI和Sau3AI三種限制性內(nèi)切

核酸酶的識別序列與切割位點(diǎn)，圖2為某種基因表達(dá)載體的示意圖（載體上的EcoRI,

SG/3AI的切點(diǎn)是唯一的）。請回答下列問題：

?*1

一GAATTC一一GGATCC一—‘GATC一

—CTTAAG————CCTAGG——CTAG—

IIt

圖1

（1）經(jīng)BmzHl酶切后得到的目的基因可以與上述表達(dá)載體被酶切后的產(chǎn)物連

接，理由是o

（2）圖2中啟動子的作用是,

終止子的作用是,抗生素

抗性基因的作用是。

（3）構(gòu)建基因表達(dá)載體時，還需要用到DNA連接酶。常見的DNA連接酶有DNA

連接酶和DNA連接酶，其中能連接平末端的是DNA連接酶。

（4）若某人利用圖2所示的表達(dá)載體獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組DNA分子（如

圖3所示）。這三種重組DNA分子中，不能在宿主細(xì)胞中表達(dá)目的基因產(chǎn)物的有,

原因是___________________________________________________________________________

答案（1）5她3Al兩種酶切割后產(chǎn)生的片段具有相同的黏性末端（2）RNA聚合酶識別和

結(jié)合的部位使轉(zhuǎn)錄過程停止便于重組DNA分子的篩選(3)E.coliT4T4(4)甲和丙

甲中目的基因插入在啟動子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均

不能被轉(zhuǎn)錄

解析(1)經(jīng)BamHI酶切后得到的黏性末端是GATC-,與Sau3AI酶切后獲得的黏性末端

相同，所以經(jīng)BmiHl酶切后得到的目的基因可以與被SOM3Al酶切后的產(chǎn)物連接。(2)啟動

子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，與RNA聚合酶結(jié)合后，開始進(jìn)行轉(zhuǎn)錄過程；終止子使

轉(zhuǎn)錄過程停止；抗生素抗性基因表達(dá)后，生物具有抗生素抗性，便于重組DNA分子的篩選。

(4)在基因表達(dá)載體中，目的基因應(yīng)位于啟動子和終止子之間才能表達(dá)。甲中目的基因插入在

啟動子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均不能被轉(zhuǎn)錄。

2.(2023?鄂州高三聯(lián)考)多酚氧化酶(PP。)基因的大量表達(dá)是促使果實(shí)褐變的主要原因之一。

科研人員將外源多酚氧化酶基因的同源片段(ASPPO)與載體結(jié)合，構(gòu)建PPO基因的反義表達(dá)

載體(重組質(zhì)粒2),并在農(nóng)桿菌介導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)了對鴨梨組培苗的轉(zhuǎn)化，其操作流程如圖1,圖中

限制酶SacI的識別序列為GAGCT,C,限制酶XbaI的識別序列為T,CTAGA,限制酶Hiwdlll

的識別序列為A’AGCTT,Ka/為卡那霉素抗性基因，aadA為鏈霉素抗性基因。請回答下列

問題：

鴨梨植株

圖1

(1)多酚氧化酶基因的同源片段(ASPPO)的獲取：根據(jù)尸尸?；?'端450bp的片段兩側(cè)的堿

基序列，設(shè)計引物進(jìn)行過程①(以mRNA為模板進(jìn)行的特殊PCR)。過程①中需要使用的酶有

,為使擴(kuò)增出的ASPPO基因能與質(zhì)粒2構(gòu)建反義表達(dá)載體，

左、右側(cè)引物(填“5'”或"3’”)端分別需要添加的序列是0

(2)ASPPO片段的克隆：將ASPPO片段與質(zhì)粒1連接形成的重組質(zhì)粒1導(dǎo)入大腸桿菌，該過

程需要預(yù)先用Ca2+處理大腸桿菌細(xì)胞，其目的是o與體

外擴(kuò)增相比，將重組質(zhì)粒1導(dǎo)入大腸桿菌中擴(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)有。

(3)PPO基因反義表達(dá)載體的構(gòu)建：過程④中利用將ASPPO片段與質(zhì)

粒2定向連接形成重組質(zhì)粒2,導(dǎo)入農(nóng)桿菌后進(jìn)行篩選、測序鑒定，再使用(物理狀

態(tài))培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)農(nóng)桿菌。

(4)鴨梨的遺傳轉(zhuǎn)化：將預(yù)培養(yǎng)的鴨梨葉片愈傷組織置于上述農(nóng)桿菌菌液中浸漬5min后，再

將愈傷組織轉(zhuǎn)接到添加(抗生素)的選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

(5)反義轉(zhuǎn)基因鴨梨的檢測：科研人員分別提取了非轉(zhuǎn)基因鴨梨植株葉片及轉(zhuǎn)基因鴨梨植株葉

片的總RNA,以PPO基因編碼區(qū)全長為探針進(jìn)行雜交檢測轉(zhuǎn)基因鴨梨的內(nèi)源PPO基因轉(zhuǎn)錄

情況，結(jié)果如圖2。該檢測的原理是,實(shí)驗結(jié)果表明植株（填

“A”或"B"）可能是成功實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植株。為進(jìn)一步驗證獲得的轉(zhuǎn)基因植株是否是

耐褐化新品種，還需進(jìn)行的檢測是。

圖2

答案（1）逆轉(zhuǎn)錄酶和KzqDNA聚合酶5'GAGCTC,TCTAGA（2）使大腸桿菌細(xì)胞處于

一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)能準(zhǔn)確復(fù)制、方便取用、穩(wěn)定保存等

（3）（SacI、XbaI）限制酶和DNA連接酶液體（4）卡那霉素

（5）堿基互補(bǔ)配對A待植株開花結(jié)果后，觀察果實(shí)是否褐變

解析（1）過程①是RT-PCR,需要使用的酶有逆轉(zhuǎn)錄酶和QqDNA聚合酶。為使擴(kuò)增出的

ASPPO基因能與質(zhì)粒2構(gòu)建反義表達(dá)載體，左、右側(cè)引物5'端分別需要添加的序列是SacI

和XbaI的識別序列GAGCTC,TCTAGA□（4）將預(yù)培養(yǎng)的鴨梨葉片愈傷組織置于農(nóng)桿菌菌液

中浸漬5min,因為只有T—DNA進(jìn)入愈傷組織細(xì)胞，因此用含卡那霉素的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行

篩選。（5）探針雜交檢測的原理是堿基互補(bǔ)配對，圖中實(shí)驗結(jié)果表明植株A的轉(zhuǎn)錄水平較低，

可能原因是反義RNA與尸尸?；蜣D(zhuǎn)錄形成的RNA結(jié)合，從而更容易被RNA酶水解，使最

終表達(dá)量下降，所以A是成功實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植株。為進(jìn)一步驗證獲得的轉(zhuǎn)基因植株是否

是耐褐化新品種，還需待植株開花結(jié)果后，觀察果實(shí)是否褐變。

題組二DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定

3.（2023?珠海高三期末）反轉(zhuǎn)錄PCR又稱逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT—PCR）,是以mRNA為模板進(jìn)行的

特殊PCR,過程如圖。下列相關(guān)敘述錯誤的是（）

5'------------------^3'mRNA

①口引物P1

3'^----------5,單鏈cDNA

引物P2②J

______________雙鏈cDNA

A.圖示過程需要控制溫度，否則可能得不到產(chǎn)物

B.RT—PCR技術(shù)中，不需要已知mRNA的全部序列

C.過程③中子鏈沿著模板鏈的5'—3,方向延伸

D.RT-PCR技術(shù)可應(yīng)用于是否被RNA病毒感染的檢測

答案C

解析過程③中，在引物作用下，DNA聚合酶從引物3,端開始延伸DNA鏈，即子鏈沿著

模板鏈的3,一5'方向延伸，C錯誤。

4.染色質(zhì)是由一定長度的核小體為基本單位構(gòu)成的。將大鼠肝細(xì)胞中分離出的染色質(zhì)用非特

異性核酸酶水解后去除染色質(zhì)蛋白，對得到的DNA片段進(jìn)行凝膠電泳，結(jié)果如圖所示。若

先將染色質(zhì)中的蛋白質(zhì)去掉后用同樣的非特異性核酸酶處理，則得到隨機(jī)長度的DNA片段。

據(jù)此分析，下列有關(guān)敘述錯誤的是（）

染色質(zhì)

-bp

核酸酶處理泳三

印—800

部分水解的染色質(zhì)

q—600

除去染色質(zhì)蛋臼一400

DNA片段一200

A.凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來

B.染色質(zhì)中的蛋白質(zhì)可能對DNA具有保護(hù)作用

C.構(gòu)成核小體的基本單位是脫氧核糖核甘酸

D.在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠濃度、DN