醫(yī)用臭氧對斑馬魚幼魚缺氧腦損傷的影響及機制探究一、引言1.1研究背景與意義新生兒缺氧缺血性腦?。℉ypoxic-IschemicEncephalopathy，HIE）是指在圍生期缺氧窒息而導致的缺氧缺血性損害，臨床出現(xiàn)一系列腦病的表現(xiàn)，是圍生期窒息后引起的最常見和嚴重的并發(fā)癥。據(jù)世界衛(wèi)生組織資料顯示，全球每年仍有400萬新生兒死亡，與窒息相關者占23％，在歐美等發(fā)達國家，中高度新生兒缺氧缺血性腦病的死亡和嚴重傷殘率也高達53％-61％。在英國的相關研究中，HIE發(fā)病率為6/1000足月兒，有1/1000死亡或遺留嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙。其不僅嚴重威脅新生兒的生命健康，即便患兒存活，也往往會遺留如腦性癱瘓、智力低下、癲癇、耳聾、視力障礙等嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，給家庭和社會帶來沉重的負擔。目前，對于新生兒缺氧缺血性腦病的研究，動物模型起著至關重要的作用。傳統(tǒng)的研究多采用大鼠、豬、羊等動物模型。然而，這些模型存在諸多局限性。制作大鼠腦缺氧模型時，將一側頸動脈結扎后置于低氧環(huán)境中進行缺氧誘導，對于早產(chǎn)大鼠而言，很難存活，不利于后續(xù)預后研究；而足月大鼠缺氧模型，部分大鼠不能存活，存活的大鼠又可能無明顯精神、運動障礙表現(xiàn)。利用羊、豬胎兒模型則成本高昂，且種群差異大，難以進行大樣本量的研究。因此，尋找一種更理想的動物模型迫在眉睫。斑馬魚作為一種新型模式動物，近年來在生物學和醫(yī)學研究中備受關注。斑馬魚與人類的各種器官系統(tǒng)近似，其心血管、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等發(fā)育機制和特點與人類具有相似性。野生斑馬魚的全基因組與人類基因組的相似度高達87％，使得兩者在大部分發(fā)育信號通路上也是保守的。同時，斑馬魚具有諸多獨特優(yōu)勢：其一，斑馬魚體型小，養(yǎng)殖不繁瑣且費用低廉，但其產(chǎn)卵量大，生長周期短，能在短時間內(nèi)提供大量實驗樣本，可有效提高實驗效率；其二，斑馬魚胚胎及幼魚身體透明，利用轉基因斑馬魚，如內(nèi)皮中表達綠色熒光蛋白的tg（flk1：gfp）斑馬魚，能夠便捷地用熒光顯微鏡觀察到全身血管；其三，在腦血管生成和血腦屏障結構方面，斑馬魚與哺乳動物具有極高的相似性，不僅腦血管的發(fā)育和功能與哺乳動物高度一致，促進血管生成的細胞和分子機制也高度保守，且其免疫系統(tǒng)與哺乳動物相似，具備相對完整的適應性免疫系統(tǒng)和保守的先天性免疫系統(tǒng)；其四，斑馬魚胚胎及幼魚能夠進行活體成像，可實時可視化血管生成的觀察，并能在空間和時間上判斷其血流動力學和血管結構的變化；其五，斑馬魚的全基因組測序工作已完成，針對斑馬魚的基因操作技術也非常成熟，通過靶向修飾或敲除某些基因改變其表達水平，能較容易地對興趣基因進行精確操作，十分適合進行人類疾病建模及機制研究?；谶@些優(yōu)勢，斑馬魚已逐漸成為研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病的理想模式生物，尤其在腦血管疾病研究領域發(fā)揮著重要作用。醫(yī)用臭氧治療作為一種新興的治療手段，已在多種疾病的治療中展現(xiàn)出獨特的潛力。臭氧是由三個氧原子組成（O3），又稱三氧，具有不穩(wěn)定特性和很強的氧化能力，是除氟之外最強的氧化劑，在常溫狀態(tài)下臭氧的半衰期約為20-30分鐘。采用臭氧自體血回輸是一種新的非藥物療法，臭氧密度是氧氣的1.6倍，在水中的溶解性是氧氣的10倍。相關研究表明，臭氧可迅速消除由于腦組織局部供氧不足而引起的水腫，從而避免斑痕的產(chǎn)生；可大大提高血氧飽和度，改善血液循環(huán)，激活紅細胞代謝，提高人體的組織活性，使組織的供氧情況得到改善，同時恢復細胞功能，使以前缺氧的氧代謝變得更有效；還能改變血液中血小板的聚合方式，在有血栓的地方生成的過氧化氫能改變血栓的發(fā)展，使血栓解體，改善血液的結構以及紅細胞在動脈和靜脈中的流動方式，增加紅細胞的彈性，從而提高血液通過毛細血管的能力，并增加身體組織的氧氣供應；此外，臭氧可氧化并除去粘附在血管壁的色斑等脂肪物質(zhì)，并能增加血管彈性。在臨床應用中，臭氧自體血療法已廣泛應用于腦血管病、病毒性肝炎、感染性疾病、自身免疫性疾病、各種疼痛癥等，并取得了一定的療效。然而，醫(yī)用臭氧對新生兒缺氧缺血性腦病的治療效果及作用機制，目前尚不完全明確。本研究旨在利用斑馬魚幼魚構建缺氧腦損傷模型，探討醫(yī)用臭氧對其影響。通過深入研究醫(yī)用臭氧對斑馬魚幼魚缺氧腦損傷的保護作用及相關機制，有望為新生兒缺氧缺血性腦病的治療提供新的思路和潛在的治療方法，為臨床治療提供更堅實的理論基礎和實驗依據(jù)，對改善新生兒缺氧缺血性腦病患兒的預后具有重要的現(xiàn)實意義。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在新生兒缺氧缺血性腦病的研究中，動物模型的構建是探索其發(fā)病機制和治療方法的重要手段。國外學者在斑馬魚缺氧腦損傷模型構建方面開展了諸多研究。Yu等將斑馬魚放入氧濃度低于0.8mg/mL的缺氧室中，成功模擬出缺血缺氧性腦損傷模型。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，缺氧處理后的斑馬魚出現(xiàn)抽搐、不平衡游動等行為學改變，且利用TTC染色可觀察到腦組織損傷分布，缺血缺氧10分鐘后，斑馬魚腦組織視神經(jīng)葉頂蓋處出現(xiàn)缺血半暗區(qū)，隨著缺氧時間延長，梗死灶范圍擴大，這為研究腦卒中復雜的細胞分子病理生理改變和開發(fā)神經(jīng)保護藥物提供了重要模型基礎。國內(nèi)也有不少關于斑馬魚缺氧腦損傷模型構建的探索。如河南省兒童醫(yī)院鄭州兒童醫(yī)院的研究者提出，通過對斑馬魚幼魚進行禁食處理，再給予35℃的高溫刺激、低氧環(huán)境，同時用醋酸和乙醇浸泡，結合1500Lux的強光刺激以及波長30-40μm、強度為60-80mw/cm2的電磁波照射等多種協(xié)同方法，能高效誘導斑馬魚幼魚的腦細胞損傷凋亡，當缺氧沉底與蘇醒總時間在19-26min時，即可成功制備缺氧性腦損傷斑馬魚模型，大大提高了模型制備效率。在醫(yī)用臭氧治療方面，國外研究發(fā)現(xiàn)臭氧具有多種生物學效應。臭氧能迅速消除腦組織局部供氧不足引起的水腫，避免斑痕產(chǎn)生；可提高血氧飽和度，改善血液循環(huán)，激活紅細胞代謝，增強人體組織活性，改善組織供氧，恢復細胞功能，使氧代謝更有效；還能改變血液中血小板聚合方式，在有血栓處生成過氧化氫以改變血栓發(fā)展，使血栓解體，改善血液結構和紅細胞流動方式，增加紅細胞彈性，提高血液通過毛細血管的能力，增加組織氧氣供應；此外，臭氧可氧化并除去血管壁上的脂肪物質(zhì)，增加血管彈性。國內(nèi)對醫(yī)用臭氧治療的應用研究也取得了一定成果。在臨床應用中，臭氧自體血療法已廣泛應用于腦血管病、病毒性肝炎、感染性疾病、自身免疫性疾病、各種疼痛癥等。例如，在腦外傷早期治療中，通過對14例腦外傷患者的研究發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)治療相比，聯(lián)合三氧療法治療的患者日常生活活動能力和MMSE評分有顯著改善，表明三氧療法能減輕炎癥反應，促進腦重塑，減輕神經(jīng)功能損傷，且安全可靠。在對缺血缺氧性腦病患者的研究中，采用臭氧自體血治療，觀察到患者神經(jīng)功能缺失程度（NIHSS）評分和Barthel指數(shù)評分在治療后有明顯改善，顯示出臭氧治療對缺血缺氧性腦病的積極作用。然而，目前國內(nèi)外研究仍存在一些不足之處。一方面，雖然斑馬魚缺氧腦損傷模型的構建取得了一定進展，但不同研究中模型構建的方法和條件存在差異，缺乏統(tǒng)一的標準，這使得不同研究結果之間難以直接比較，也不利于深入探究缺氧腦損傷的發(fā)病機制和治療靶點。另一方面，醫(yī)用臭氧對新生兒缺氧缺血性腦病的治療研究相對較少，其治療效果和作用機制尚未完全明確，尤其是在分子生物學層面的研究還較為薄弱。此外，現(xiàn)有研究中樣本量普遍較小，缺乏大規(guī)模、多中心的臨床研究來進一步驗證醫(yī)用臭氧治療的有效性和安全性。本研究擬在現(xiàn)有研究基礎上，利用斑馬魚幼魚構建標準化的缺氧腦損傷模型，深入探討醫(yī)用臭氧對斑馬魚幼魚缺氧腦損傷的影響及其作用機制，旨在為新生兒缺氧缺血性腦病的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療策略，彌補當前研究的不足，推動該領域的進一步發(fā)展。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在利用斑馬魚幼魚這一模式生物，深入探究醫(yī)用臭氧對缺氧腦損傷的影響，具體研究目的和內(nèi)容如下：研究目的：明確醫(yī)用臭氧對斑馬魚幼魚缺氧腦損傷是否具有保護作用，確定不同濃度醫(yī)用臭氧在保護斑馬魚幼魚缺氧腦損傷中的最佳作用濃度，初步揭示醫(yī)用臭氧對斑馬魚幼魚缺氧腦損傷發(fā)揮保護作用的潛在機制。研究內(nèi)容：建立斑馬魚幼魚缺氧腦損傷模型：依據(jù)現(xiàn)有研究中斑馬魚缺氧腦損傷模型的構建方法，如將斑馬魚放入氧濃度低于0.8mg/mL的缺氧室中，或對斑馬魚幼魚進行禁食處理，再給予35℃的高溫刺激、低氧環(huán)境，同時用醋酸和乙醇浸泡，結合1500Lux的強光刺激以及波長30-40μm、強度為60-80mw/cm2的電磁波照射等方法，構建斑馬魚幼魚缺氧腦損傷模型。通過觀察斑馬魚幼魚的行為學改變，如抽搐、不平衡游動等，以及利用TTC染色觀察腦組織損傷分布情況，判斷模型是否成功建立。探究醫(yī)用臭氧對斑馬魚幼魚缺氧腦損傷的保護作用：將成功構建的缺氧腦損傷斑馬魚幼魚模型隨機分為不同實驗組，分別給予不同濃度的醫(yī)用臭氧處理。通過行為學實驗，如觀察斑馬魚幼魚的游動速度、平衡能力、對刺激的反應等，評估醫(yī)用臭氧對斑馬魚幼魚神經(jīng)功能的影響；采用組織學分析方法，如蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察腦組織形態(tài)學變化，判斷醫(yī)用臭氧對腦組織損傷的改善情況；利用免疫組化技術，檢測相關神經(jīng)標志物的表達水平，進一步確定醫(yī)用臭氧對神經(jīng)細胞的保護作用。確定醫(yī)用臭氧的最佳作用濃度：在上述實驗中，設置多個不同濃度的醫(yī)用臭氧實驗組，對比不同濃度醫(yī)用臭氧處理后斑馬魚幼魚的行為學表現(xiàn)、腦組織形態(tài)學變化以及神經(jīng)標志物表達水平等指標。通過統(tǒng)計學分析，確定在保護斑馬魚幼魚缺氧腦損傷中效果最佳的醫(yī)用臭氧濃度。探討醫(yī)用臭氧發(fā)揮保護作用的機制：從分子生物學層面入手，研究醫(yī)用臭氧對斑馬魚幼魚缺氧腦損傷相關信號通路的影響。采用實時熒光定量PCR技術，檢測與氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡等相關基因的表達水平變化；運用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術，分析相關信號通路中關鍵蛋白的表達及磷酸化水平。通過這些實驗，初步揭示醫(yī)用臭氧對斑馬魚幼魚缺氧腦損傷發(fā)揮保護作用的潛在機制。二、斑馬魚與缺氧腦損傷模型2.1斑馬魚作為模式生物的優(yōu)勢斑馬魚作為一種重要的模式生物，在生命科學研究領域發(fā)揮著日益關鍵的作用，尤其是在腦血管疾病研究中，展現(xiàn)出諸多傳統(tǒng)模式生物所無法比擬的獨特優(yōu)勢。從繁殖特性和成本效益來看，斑馬魚體型小巧，成魚體長僅3-4厘米，這使得其養(yǎng)殖空間需求小，養(yǎng)殖設備簡單，養(yǎng)殖成本低廉。但其繁殖能力卻極為強大，成年斑馬魚每次交配可產(chǎn)出多達300個胚胎，且產(chǎn)卵周期短，每周可產(chǎn)卵一次，生長周期也較短，從受精卵發(fā)育到性成熟僅需3-4個月。這意味著在短時間內(nèi)能夠獲得大量的實驗樣本，極大地提高了實驗效率，降低了實驗成本，為大規(guī)模的實驗研究提供了便利條件。例如，在研究某種藥物對腦血管疾病的治療效果時，可以同時對數(shù)千條斑馬魚進行實驗，從而獲得更具統(tǒng)計學意義的數(shù)據(jù)，減少實驗誤差。斑馬魚胚胎及幼魚身體透明的特性，為研究提供了直觀的觀察窗口。利用轉基因技術，如構建內(nèi)皮中表達綠色熒光蛋白的tg（flk1：gfp）斑馬魚，能夠在熒光顯微鏡下清晰地觀察到全身血管的形態(tài)、結構和分布情況。這種可視化的觀察方式，使得研究人員可以直接、實時地追蹤血管的發(fā)育過程，包括血管的生成、分支和重塑等，以及在疾病狀態(tài)下血管的病理變化，如血管狹窄、堵塞或破裂等。相比之下，傳統(tǒng)的實驗動物如大鼠、小鼠等，由于其身體不透明，觀察血管需要進行復雜的解剖和染色等操作，且難以實現(xiàn)實時動態(tài)觀察。在腦血管生成和血腦屏障結構方面，斑馬魚與哺乳動物高度相似。其腦血管的發(fā)育和功能遵循與哺乳動物類似的機制，從胚胎期的血管發(fā)生到成體的血管穩(wěn)態(tài)維持，都涉及相似的細胞和分子信號通路。例如，在血管生成過程中，斑馬魚和哺乳動物都依賴血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等關鍵信號分子來調(diào)控血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和分化。同時，斑馬魚的血腦屏障結構和功能也與哺乳動物具有相似性，能夠有效地保護大腦免受有害物質(zhì)的侵入，維持大腦內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。這種相似性使得斑馬魚成為研究腦血管疾病發(fā)病機制和治療策略的理想模型，研究結果更具有外推性和臨床參考價值。斑馬魚的免疫系統(tǒng)與哺乳動物相似，具備相對完整的適應性免疫系統(tǒng)和保守的先天性免疫系統(tǒng)。在腦血管疾病中，炎癥反應是一個重要的病理過程，斑馬魚免疫系統(tǒng)的相似性使得研究人員可以利用斑馬魚模型深入探討炎癥在腦血管疾病中的作用機制，以及免疫調(diào)節(jié)治療的潛在靶點。例如，在研究缺血性腦卒中后的炎癥反應時，斑馬魚模型可以用于觀察炎癥細胞的浸潤、炎癥因子的釋放以及免疫細胞與腦血管細胞之間的相互作用，為開發(fā)針對炎癥的治療方法提供理論依據(jù)。斑馬魚胚胎及幼魚能夠進行活體成像，這是其在腦血管疾病研究中的又一突出優(yōu)勢。通過活體成像技術，如共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡等，可以在空間和時間上精確地判斷斑馬魚血流動力學和血管結構的變化。例如，在研究血管生成過程中，可以實時觀察血管內(nèi)皮細胞的動態(tài)行為，包括細胞的增殖、遷移和融合等；在研究腦卒中時，可以實時監(jiān)測腦部血流的變化、缺血區(qū)域的形成和發(fā)展以及血管再通后的血流恢復情況。這種實時、動態(tài)的觀察能力，有助于深入了解腦血管疾病的發(fā)病機制和病理過程，為開發(fā)新的治療方法提供重要的實驗依據(jù)。此外，斑馬魚的全基因組測序工作已經(jīng)完成，其遺傳序列與人類高度保守，相似度高達87％。同時，針對斑馬魚的基因操作技術，如Tol2轉座子介導的基因捕獲突變、轉基因技術、嗎啉基反義寡核苷酸（morpholino,MO）介導的基因下調(diào)技術和CRISPR/Cas9基因敲除技術等非常成熟。這些技術使得研究人員可以通過靶向修飾或敲除某些基因，改變其表達水平，精確地研究基因在腦血管疾病中的功能和作用機制。例如，通過CRISPR/Cas9技術敲除斑馬魚中與腦血管發(fā)育相關的基因，觀察其對腦血管結構和功能的影響，從而揭示該基因在腦血管疾病中的潛在作用，為尋找新的治療靶點提供線索。2.2斑馬魚幼魚缺氧腦損傷模型的構建方法在研究新生兒缺氧缺血性腦病的發(fā)病機制和治療方法時，構建可靠的斑馬魚幼魚缺氧腦損傷模型是至關重要的環(huán)節(jié)。目前，常用的構建方法主要包括物理性缺氧構建法和化學性缺氧構建法，這兩種方法各有其獨特的操作流程、原理及特點。2.2.1物理性缺氧構建法物理性缺氧構建法主要是通過降低水中的溶氧量來模擬缺氧環(huán)境，其中充入氮氣是較為常見的操作方式。具體而言，首先需要準備一個透明的水箱作為實驗容器，配備專業(yè)的充氮設備，如氮氣瓶及配套的氣體輸送管道和流量調(diào)節(jié)閥。同時，為了精確監(jiān)測水中的溶氧量變化，需使用溶解氧電子監(jiān)測儀。當以斑馬魚胚胎或幼魚為研究對象時，考慮到充入氮氣時產(chǎn)生的水流沖力可能對幼魚造成傷害，可預先用尼龍濾網(wǎng)制作管壁具有通透性但幼魚無法逃出的PVC管，并將其固定在水箱底部。將斑馬魚幼魚放入PVC管內(nèi)后，開始充入氮氣，通過調(diào)節(jié)氮氣流量，動態(tài)觀察水中溶解量，模擬形成密閉缺氧水族箱。在構建模型的過程中，對溶氧量的精準控制是關鍵。眾多研究表明，當水中有效溶氧量小于0.8mg/L時，斑馬魚會出現(xiàn)明顯的缺氧反應。例如，Yu和Li等研究者通過實驗發(fā)現(xiàn)，當水中溶氧量達到這一臨界值時，斑馬魚會靜止于水底，且在1min內(nèi)保持該狀態(tài)，此時可視為建模的終止時間點。也有學者依據(jù)斑馬魚沉底不動，僅鰓蓋偶爾活動的行為表現(xiàn)，來初步判斷斑馬魚是否已造成腦損傷。當斑馬魚幼魚出現(xiàn)這些行為特征時，表明其已處于缺氧狀態(tài)，腦損傷模型初步構建成功。這種物理性缺氧構建法具有諸多優(yōu)點。一方面，操作相對簡便，不需要復雜的化學試劑和特殊的實驗條件，只需要具備基本的實驗設備即可進行；另一方面，通過精確控制氮氣流量和監(jiān)測溶氧量，可以較為準確地模擬不同程度的缺氧環(huán)境，有利于研究缺氧程度對腦損傷的影響。然而，該方法也存在一定的局限性。例如，充入氮氣時產(chǎn)生的水流可能會對斑馬魚幼魚造成一定的物理刺激，影響實驗結果的準確性；而且在實際操作中，要確保整個實驗環(huán)境的密封性良好，以維持穩(wěn)定的缺氧狀態(tài)，這對實驗設備和操作技術提出了較高的要求。2.2.2化學性缺氧構建法化學性缺氧構建法的原理是利用某些化學物質(zhì)抑制線粒體的電子傳遞鏈，從而阻斷細胞的有氧呼吸，導致細胞缺氧。疊氮化鈉（NaN3）是常用的化學試劑之一，它能夠特異性地抑制線粒體的電子傳遞鏈，使細胞無法正常利用氧氣進行能量代謝，進而造成細胞缺氧。在使用疊氮化鈉構建斑馬魚幼魚缺氧腦損傷模型時，需要嚴格控制其使用濃度。研究表明，當疊氮化鈉濃度在150-400μmol/L時，斑馬魚胚胎發(fā)育會出現(xiàn)遲緩現(xiàn)象。這是因為在這個濃度范圍內(nèi)，疊氮化鈉雖然抑制了線粒體的電子傳遞鏈，但細胞仍具有一定的代償能力，所以表現(xiàn)為發(fā)育速度減緩。當濃度達到900μmol/L時，胚胎發(fā)育會終止，這與物理性極度缺氧時的結果一致，說明此時細胞的有氧呼吸被徹底阻斷，無法維持正常的生命活動，斑馬魚幼魚的腦損傷程度達到了較為嚴重的水平。然而，使用疊氮化鈉溶液構建缺氧模型也會對斑馬魚胚胎發(fā)育產(chǎn)生一些負面影響。除了上述的發(fā)育遲緩甚至終止外，高濃度的疊氮化鈉可能會對斑馬魚的其他生理功能產(chǎn)生不可逆的損害，影響實驗結果的可靠性和可重復性。在實驗過程中，還需要注意疊氮化鈉是一種有毒物質(zhì)，操作時必須嚴格遵守安全規(guī)范，防止對實驗人員造成傷害。2.3模型的評價指標在構建斑馬魚幼魚缺氧腦損傷模型后，為了準確評估模型的有效性以及醫(yī)用臭氧對其的影響，需要選用一系列科學合理的評價指標。這些指標主要涵蓋行為學和組織學兩個方面，通過多維度的分析，能夠全面、深入地了解斑馬魚幼魚缺氧腦損傷的程度以及醫(yī)用臭氧的干預效果。2.3.1行為學指標行為學指標是評估斑馬魚幼魚缺氧腦損傷程度的重要依據(jù)之一。當斑馬魚幼魚經(jīng)歷缺氧處理后，其行為會發(fā)生顯著變化。抽搐是常見的行為表現(xiàn)之一，這是由于缺氧導致神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂，神經(jīng)細胞的正常電生理活動受到干擾，從而引發(fā)肌肉的不自主收縮。不平衡游動也是典型的行為改變，正常情況下，斑馬魚能夠保持平衡的姿態(tài)在水中自由游動，而缺氧腦損傷會影響其平衡感和運動協(xié)調(diào)能力，使其游動時出現(xiàn)身體傾斜、方向失控等現(xiàn)象。這些行為變化直觀地反映了缺氧對斑馬魚幼魚神經(jīng)系統(tǒng)的損害。行為學指標與腦損傷程度之間存在著密切的關聯(lián)。一般來說，抽搐的頻率越高、持續(xù)時間越長，以及不平衡游動的表現(xiàn)越明顯，往往意味著腦損傷的程度越嚴重。例如，在相關研究中發(fā)現(xiàn)，隨著缺氧時間的延長，斑馬魚幼魚出現(xiàn)抽搐的次數(shù)逐漸增多，從偶爾的輕微抽搐發(fā)展為頻繁的劇烈抽搐；不平衡游動的程度也不斷加劇，從最初的輕微偏離直線游動到后來幾乎無法正常游動，只能在水中無規(guī)律地打轉。這表明行為學指標能夠較為準確地反映腦損傷的發(fā)展進程，為研究人員判斷模型的成功與否以及評估醫(yī)用臭氧的治療效果提供了重要的參考依據(jù)。通過對斑馬魚幼魚行為學指標的觀察和分析，不僅可以初步判斷缺氧腦損傷的程度，還能夠動態(tài)監(jiān)測在醫(yī)用臭氧干預后，斑馬魚幼魚神經(jīng)功能的恢復情況。如果醫(yī)用臭氧對缺氧腦損傷具有保護作用，那么在給予醫(yī)用臭氧處理后，斑馬魚幼魚的抽搐頻率和持續(xù)時間應該會逐漸減少，不平衡游動的現(xiàn)象也會得到明顯改善，其游動姿態(tài)會逐漸恢復正常，運動協(xié)調(diào)能力增強。因此，行為學指標在研究醫(yī)用臭氧對斑馬魚幼魚缺氧腦損傷的影響中具有不可或缺的作用。2.3.2組織學指標組織學指標能夠從微觀層面揭示斑馬魚幼魚缺氧腦損傷的病理變化，為深入研究其損傷機制和醫(yī)用臭氧的作用效果提供關鍵信息。常用的組織學檢測方法包括TTC染色、甲苯胺藍染色和TUNEL染色，它們各自基于不同的原理，從不同角度對腦組織的損傷情況進行評估。TTC染色，即2,3,5-氯化三苯基四氮唑染色，其原理是利用TTC與活細胞內(nèi)的脫氫酶反應。在正常腦組織中，細胞內(nèi)的脫氫酶能夠將無色的TTC還原為紅色的三苯基甲臜（TPF），從而使正常腦組織呈現(xiàn)紅色。而在缺氧損傷的腦組織區(qū)域，由于細胞代謝功能受損，脫氫酶活性降低或喪失，無法將TTC還原，因此該區(qū)域呈現(xiàn)白色。通過TTC染色，可以清晰地觀察到腦組織損傷的分布情況，準確界定梗死灶的范圍和位置。在實驗操作時，首先需要將斑馬魚幼魚的腦組織取出，然后將其浸泡在一定濃度的TTC溶液中，在適宜的溫度下孵育一段時間，使TTC充分與腦組織反應，最后通過觀察腦組織顏色的變化來判斷損傷情況。甲苯胺藍染色主要用于評估神經(jīng)元損傷。甲苯胺藍是一種堿性染料，能夠與神經(jīng)元中的核酸等酸性物質(zhì)結合，使正常神經(jīng)元呈現(xiàn)藍色。當神經(jīng)元受到損傷時，其結構和功能發(fā)生改變，核酸等物質(zhì)的含量和分布也會發(fā)生變化，導致甲苯胺藍的染色效果發(fā)生改變，損傷的神經(jīng)元染色變淺或出現(xiàn)其他異常染色表現(xiàn)。在進行甲苯胺藍染色時，需要先對斑馬魚幼魚的腦組織進行固定、切片等預處理，然后將切片浸泡在甲苯胺藍染液中染色，經(jīng)過沖洗、脫水、透明等步驟后，在顯微鏡下觀察神經(jīng)元的染色情況，從而判斷神經(jīng)元的損傷程度。TUNEL染色，即脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法，用于檢測細胞凋亡。細胞凋亡時，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，將染色體DNA切割成片段，暴露出大量3'-羥基（3'-OH）末端。在末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）的催化下，帶有標記物（如生物素、熒光素或地高辛）的dUTP與DNA的3'-OH末端共價結合。如果使用生物素標記，可通過鏈霉親和素-HRP復合物與DAB底物反應，生成棕色沉淀；若為熒光素標記，則直接通過熒光顯微鏡觀察。正常細胞因DNA完整，幾乎無3'-OH，故不會被標記，從而實現(xiàn)凋亡細胞的精準識別。在實驗過程中，對于不同類型的樣本（如石蠟切片、冰凍切片、細胞爬片），需要進行相應的樣本前處理，包括脫蠟與水化、抗原修復與通透等步驟，然后構建TUNEL反應體系，進行標記孵育、信號顯色與復染等操作，最終通過顯微鏡觀察來確定細胞凋亡的情況。這些組織學指標相互補充，能夠全面地反映斑馬魚幼魚缺氧腦損傷的病理變化，為研究醫(yī)用臭氧對缺氧腦損傷的影響提供了重要的組織學依據(jù)。通過對這些指標的分析，可以深入了解醫(yī)用臭氧是否能夠減輕腦組織損傷、減少神經(jīng)元凋亡，從而為揭示醫(yī)用臭氧的作用機制奠定基礎。三、醫(yī)用臭氧概述與作用機制3.1醫(yī)用臭氧的發(fā)展歷程臭氧，作為一種由三個氧原子組成的強氧化劑，其發(fā)現(xiàn)與應用的歷史可追溯至200多年前。1785年，荷蘭科學家VanMarum在進行放電實驗時，敏銳地察覺到氧氣發(fā)生化學變化后產(chǎn)生了一種特殊氣味，這是人類首次記錄到臭氧的存在。1801年，Cruikschank在電解過程中也注意到有一種不知名的氣體產(chǎn)生。直至1839年，德國化學家Schonbein在巴塞羅那發(fā)表了題為“電解水過程中陽極的氣味”的論文，這種刺激性的氣體才被正式確認為“活性氧”，并命名為臭氧（Ozone）。這一發(fā)現(xiàn)，為臭氧后續(xù)在各個領域的研究與應用奠定了基礎。早期，臭氧主要應用于水的消毒領域。1900年，德國VonSimens發(fā)明了“超級感應管”，也就是西門子管，使得人們能夠從氧氣中獲取臭氧，且認識到臭氧具有非常不穩(wěn)定、難以儲存、需立即使用的特性。此后，許多應用臭氧的自來水廠應運而生，臭氧憑借其強大的氧化能力和殺菌作用，有效地保障了飲用水的安全。在醫(yī)學領域，臭氧的應用最早可追溯到第一次世界大戰(zhàn)期間。當時，德國士兵將臭氧用于治療厭氧菌感染所致的氣性壞疽。由于氣性壞疽是由厭氧菌感染引起，常規(guī)治療手段效果有限，而臭氧的強氧化性能夠有效殺滅厭氧菌，為受傷士兵的治療帶來了新的希望。1936年，法國醫(yī)生P.Aubourg率先提倡將臭氧吹注入直腸來治療慢性結腸炎。然而，在探索臭氧治療的早期階段，也曾面臨諸多挑戰(zhàn)。Payr曾嘗試將少量臭氧直接注入靜脈來治療疾病，但由于存在氣栓的危險而被禁止。這一事件也促使醫(yī)學界更加謹慎地對待臭氧治療，積極探索安全有效的應用方式。自血療法的雛形則出現(xiàn)在1954年，Wethly和Steinbarth嘗試采集5-10ml血液盛入一種容器（圣瓶）里，接受臭氧的短暫處理后（臭氧由紫外燈照射所產(chǎn)生），再將血液注射入供者的肌肉內(nèi)，以期望增強肌體抵抗力，治療許多疾病。但在20世紀50年代，由于缺乏嚴格的基礎和臨床研究，臭氧治療的有效性受到了廣泛的懷疑，在不同國家的境遇也截然不同。在一些發(fā)展中國家如東歐、古巴、墨西哥和南美等國，臭氧治療備受青睞；臭氧的故鄉(xiāng)德國和奧地利、瑞士等國家，也樂意接受這種治療方法；而在意大利、法國、英國、加拿大和美國的少數(shù)幾個州尚能認可，美國的其他州則明令禁止。隨著醫(yī)學基礎理論研究的深入，20世紀70年代成為臭氧治療發(fā)展的重要轉折點。臭氧的作用機理逐漸明晰，這使得臭氧治療作為一種古老而創(chuàng)新的治療方法，越來越多地被世界各地的醫(yī)學工作者所認同。在歐洲，幾乎每個國家都相繼成立了一個或幾個臭氧治療學會。1972年，Wolff和Hansler在德國創(chuàng)立了第一個臭氧學會，為臭氧治療的研究和推廣搭建了重要的平臺。意大利于1984年建立了本國的學會，進一步推動了臭氧治療在國內(nèi)的發(fā)展。1999年，意大利發(fā)起并組建了國際醫(yī)療臭氧學會（IMOS），旨在誠實地促進臭氧的基礎和臨床研究，建立完善的臨床治療體系，擺脫商業(yè)利益的干擾，為全球臭氧治療的規(guī)范化發(fā)展做出了積極貢獻。在臨床應用方面，臭氧在多個領域取得了顯著進展。在創(chuàng)傷及難治性潰瘍（如糖尿病足）的治療中，臭氧能夠促進傷口愈合，減少感染風險；在癌癥的輔助治療中，臭氧可增強機體免疫力，輔助化療和放療；在腰椎間盤突出及骨關節(jié)疾病的治療中，臭氧通過氧化髓核內(nèi)的蛋白多糖、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用，有效緩解患者的疼痛和癥狀。例如，在腰椎間盤突出癥的治療中，1988年意大利醫(yī)生Verga首先將注射臭氧注入腰大肌及椎旁間隙治療腰腿痛，取得了良好的療效。1998年，Muto等將臭氧注入椎間盤及椎旁間隙治療腰椎間盤突出，并報道93例，有效率達78%。此后，越來越多的臨床研究證實了臭氧治療在腰椎間盤突出癥等疾病中的有效性和安全性。在國內(nèi)，南方醫(yī)院介入科自2000年率先開展臭氧治療腰椎間盤突出癥手術，至2004年6月已治療450余例患者，有效率達75.9%。2002年6月，南方醫(yī)院開展了國內(nèi)第一例頸椎間盤臭氧注射術，為頸椎間盤突出癥的治療開辟了新的途徑。此后，臭氧治療在國內(nèi)逐漸得到推廣和應用，為更多患者帶來了福音。3.2醫(yī)用臭氧的作用機制醫(yī)用臭氧在醫(yī)學領域的應用日益廣泛，其作用機制涉及多個方面，主要包括氧化作用、抗炎作用和鎮(zhèn)痛作用。這些作用機制相互關聯(lián)，共同發(fā)揮治療效果，為多種疾病的治療提供了理論基礎。3.2.1氧化作用臭氧具有極強的氧化能力，這是其發(fā)揮治療作用的重要基礎。在腰椎間盤突出癥的治療中，臭氧的氧化作用表現(xiàn)得尤為顯著。臭氧注入髓核后，能直接與髓核內(nèi)的蛋白多糖復合體發(fā)生反應。蛋白多糖是髓核的重要組成部分，它帶有負電荷，具有固定電荷的特性，可吸引正電荷至髓核基質(zhì)內(nèi)，使髓核基質(zhì)產(chǎn)生高滲透壓，這是髓核水分高達85%的主要原因。臭氧的強氧化性能夠破壞蛋白多糖復合體中氨基酸及CH基團中的雙鍵，從而使其結構發(fā)生改變，功能喪失。同時，臭氧與髓核內(nèi)的水結合后，會生成活性氧（ROS），進一步破壞蛋白多糖的結構，導致髓核滲透壓降低，水分丟失，髓核體積縮小，從而減輕對神經(jīng)根的壓迫，緩解疼痛癥狀。臭氧還能對髓核細胞產(chǎn)生破壞作用。它可以破壞細胞膜的不飽和脂肪酸、膽固醇和其他功能蛋白基團，改變細胞膜的通透性，使細胞內(nèi)的物質(zhì)外流，影響細胞的正常代謝和功能。臭氧還可能改變細胞核內(nèi)染色體的結構，最終導致髓核細胞凋亡。動物實驗表明，將30μg/ml的臭氧注射到椎間盤，1個月后髓核明顯脫水，2個月后髓核細胞干涸壞死。髓核細胞的破壞進一步減少了蛋白多糖的合成和分泌，從根本上減輕了椎間盤突出對周圍組織的壓迫。3.2.2抗炎作用在炎癥反應過程中，會產(chǎn)生一系列復雜的生理變化。炎癥過程中的滲出、水腫和局部缺氧會導致過量的反應性氧化產(chǎn)物生成，這些產(chǎn)物具有致炎作用。在椎間盤突出癥中，纖維環(huán)破裂后釋放的糖蛋白和蛋白等可作為抗原物質(zhì)，引發(fā)機體的自身免疫反應，促使大量炎癥因子產(chǎn)生，如白細胞介素（IL）-1、IL-2、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，這些炎癥因子進一步加劇了炎癥反應。臭氧能夠通過多種途徑發(fā)揮抗炎作用。臭氧可以刺激抗氧化酶的過度表達，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等。這些抗氧化酶能夠中和炎癥反應中產(chǎn)生的過量的反應性氧化產(chǎn)物，減少其對組織細胞的損傷，從而緩解炎癥。臭氧還能刺激拮抗炎性反應的細胞因子產(chǎn)生，如IL-10、轉化生長因子-β1（TGF-β1）等，同時抑制致炎因子的表達，降低炎癥因子的水平，減輕炎癥反應。臭氧能夠刺激血管內(nèi)皮細胞釋放一氧化氮（NO）和血小板衍生生長因子（PDGF）等。NO具有舒張血管的作用，可使病灶區(qū)血管擴張，增加血液供應，改善局部微循環(huán)，促進炎癥吸收；PDGF則參與細胞的增殖、遷移和分化過程，有助于組織的修復和再生，進一步減輕炎癥反應。3.2.3鎮(zhèn)痛作用從神經(jīng)生物學角度來看，疼痛的產(chǎn)生是一個復雜的過程。神經(jīng)末梢通過釋放致痛物質(zhì)，如P物質(zhì)、磷脂酶A2等，刺激神經(jīng)末梢產(chǎn)生疼痛信號。當局部組織受到損傷或發(fā)生炎癥時，這些致痛物質(zhì)的釋放會增加，導致疼痛加劇。臭氧的鎮(zhèn)痛作用主要通過以下幾個方面實現(xiàn)：臭氧可以直接作用于神經(jīng)末梢，抑制無髓傷害感受器纖維的活動，減少致痛物質(zhì)的釋放，從而減輕疼痛感覺。臭氧能夠激活抗傷害系統(tǒng)，刺激抑制性中間神經(jīng)元，促使其釋放腦啡肽等內(nèi)源性鎮(zhèn)痛物質(zhì)。腦啡肽是一種內(nèi)源性阿片肽，它與阿片受體結合，能夠產(chǎn)生強大的鎮(zhèn)痛作用，阻斷疼痛信號的傳遞。臭氧還可以通過抗炎作用，減輕炎癥對神經(jīng)末梢的刺激，間接緩解疼痛癥狀。在臨床應用中，臭氧治療軟組織疼痛，如腰肌勞損、肩周炎等，就是基于其鎮(zhèn)痛作用，能夠有效改善患者的不適癥狀。四、實驗研究4.1實驗材料與方法4.1.1實驗材料實驗選用野生型AB品系斑馬魚，由[具體來源]提供。斑馬魚飼養(yǎng)于循環(huán)水系統(tǒng)中，水溫嚴格維持在28.5±0.5℃，采用14小時光照/10小時黑暗的光照周期，以模擬自然環(huán)境的晝夜節(jié)律。水族箱中的循環(huán)水經(jīng)過反滲透過濾，確保水質(zhì)純凈，pH值穩(wěn)定在7.0-7.5之間。每天早晚各投喂一次實驗室培養(yǎng)的鹽水蝦，保證斑馬魚獲得充足的營養(yǎng)。實驗前，對斑馬魚進行適應性飼養(yǎng)一周，使其適應實驗環(huán)境，減少環(huán)境因素對實驗結果的影響。實驗所需的主要試劑包括：疊氮化鈉（NaN3），用于構建化學性缺氧模型，購自[試劑供應商1]；醫(yī)用臭氧，由專業(yè)的臭氧發(fā)生器產(chǎn)生，臭氧濃度可根據(jù)實驗需求進行精確調(diào)節(jié)；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、TTC染色試劑盒、TUNEL染色試劑盒，分別用于組織形態(tài)學觀察、梗死灶檢測和細胞凋亡檢測，均購自[試劑供應商2]；RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒，用于基因表達水平的檢測，購自[試劑供應商3]；蛋白質(zhì)提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、Westernblot相關抗體，用于蛋白表達水平的檢測，購自[試劑供應商4]。主要儀器設備有：光照培養(yǎng)箱，為斑馬魚提供適宜的光照和溫度條件，型號為[具體型號1]；高精度電子天平，用于精確稱量試劑，型號為[具體型號2]；熒光顯微鏡，用于觀察熒光標記的樣本，型號為[具體型號3]；實時熒光定量PCR儀，用于基因表達的定量分析，型號為[具體型號4]；電泳儀和轉膜儀，用于蛋白質(zhì)的分離和轉膜，型號分別為[具體型號5]和[具體型號6]；化學發(fā)光成像系統(tǒng)，用于檢測Westernblot結果，型號為[具體型號7]。4.1.2實驗設計將受精后5天（5dpf）的斑馬魚幼魚隨機分為4組，每組30尾。分別為正常對照組、H/R組和不同臭氧濃度處理組（低濃度臭氧組、高濃度臭氧組）。正常對照組：將斑馬魚幼魚飼養(yǎng)在正常水環(huán)境中，不進行任何缺氧和臭氧處理，作為實驗的正常參照。H/R組：對斑馬魚幼魚進行缺氧/復氧處理，構建缺氧腦損傷模型，但不給予臭氧干預，用于觀察缺氧腦損傷后的自然恢復情況。低濃度臭氧組：在構建缺氧腦損傷模型后，給予濃度為[具體低濃度數(shù)值]的醫(yī)用臭氧進行復氧處理。高濃度臭氧組：在構建缺氧腦損傷模型后，給予濃度為[具體高濃度數(shù)值]的醫(yī)用臭氧進行復氧處理。實驗處理方式如下：正常對照組的斑馬魚幼魚在正常水環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)至實驗結束。對于H/R組和臭氧濃度處理組，首先進行缺氧處理。將斑馬魚幼魚放入含有特定濃度疊氮化鈉（NaN3）的溶液中，NaN3濃度為[具體濃度數(shù)值]，處理時間為[具體時間]，以構建化學性缺氧模型。缺氧處理結束后，迅速將斑馬魚幼魚轉移至正常水環(huán)境中進行復氧。低濃度臭氧組和高濃度臭氧組在復氧時，分別通入相應濃度的醫(yī)用臭氧，復氧時間為[具體時間]。正常對照組和H/R組在復氧時，通入普通空氣。觀察時間點設定為復氧后6小時、12小時、24小時和48小時。在每個時間點，分別對各組斑馬魚幼魚進行行為學觀察、樣本采集和相關指標檢測，以全面評估醫(yī)用臭氧對斑馬魚幼魚缺氧腦損傷的影響。4.1.3實驗步驟構建斑馬魚幼魚缺氧腦損傷模型時，采用化學性缺氧方法。將受精后5天的斑馬魚幼魚放入預先準備好的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中加入適量的胚胎培養(yǎng)液。然后，向培養(yǎng)液中加入疊氮化鈉（NaN3），使其終濃度達到[具體濃度數(shù)值]。將培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱中，在溫度為28.5℃的條件下孵育[具體缺氧時間]，期間密切觀察斑馬魚幼魚的行為變化。當斑馬魚幼魚出現(xiàn)沉底不動，僅鰓蓋偶爾活動的行為時，表明缺氧腦損傷模型構建成功。醫(yī)用臭氧復氧處理的具體步驟為：在缺氧處理結束后，迅速將斑馬魚幼魚從含有NaN3的培養(yǎng)液中轉移至新的培養(yǎng)皿中，加入新鮮的胚胎培養(yǎng)液。低濃度臭氧組和高濃度臭氧組分別通入濃度為[具體低濃度數(shù)值]和[具體高濃度數(shù)值]的醫(yī)用臭氧，復氧時間為[具體時間]。正常對照組和H/R組通入普通空氣進行復氧。復氧過程中，確保氣體均勻分布，且水流平穩(wěn)，避免對斑馬魚幼魚造成額外的物理刺激。樣本采集和檢測方面，在復氧后的不同時間點（6小時、12小時、24小時和48小時），每組隨機選取10尾斑馬魚幼魚進行樣本采集。行為學觀察在特定的行為觀察裝置中進行，記錄斑馬魚幼魚的游動速度、平衡能力、對刺激的反應等行為指標。對于組織學檢測，將斑馬魚幼魚用過量的麻醉劑（如0.01%MS-222）麻醉后，迅速取出腦組織。一部分腦組織用于TTC染色，將腦組織浸泡在1%的TTC溶液中，37℃孵育[具體時間]，然后用生理鹽水沖洗，觀察梗死灶的分布和大小。另一部分腦組織用于制作石蠟切片，進行HE染色和TUNEL染色。HE染色按照常規(guī)步驟進行，蘇木精染色[具體時間]，伊紅染色[具體時間]，脫水、透明后封片，在顯微鏡下觀察腦組織的形態(tài)學變化。TUNEL染色采用原位細胞凋亡檢測試劑盒，按照說明書操作，將切片與TUNEL反應混合液孵育[具體時間]，用DAB顯色，蘇木精復染，在顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。在分子生物學檢測中，提取斑馬魚幼魚腦組織的總RNA，采用RNA提取試劑盒，按照說明書操作。用DNaseI消化去除RNA中的DNA污染，然后進行RNA反轉錄為cDNA。利用實時熒光定量PCR技術檢測與氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡等相關基因的表達水平，以β-actin作為內(nèi)參基因，引物序列根據(jù)GenBank中斑馬魚基因序列設計，由[引物合成公司]合成。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）分析時，提取腦組織總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，轉膜至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉[具體時間]。加入一抗，4℃孵育過夜，然后用TBST洗滌3次，每次[具體時間]。加入相應的二抗，室溫孵育[具體時間]，再次用TBST洗滌3次。最后用化學發(fā)光成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶的表達情況，分析相關信號通路中關鍵蛋白的表達及磷酸化水平。4.2實驗結果4.2.1一般狀況觀察在整個實驗過程中，正常對照組的斑馬魚幼魚表現(xiàn)出良好的活力和健康狀態(tài)。它們在水中自由游動，泳姿協(xié)調(diào)，能夠快速且準確地對各種外界刺激做出反應，如當用玻璃棒輕觸水面時，它們會迅速改變游動方向，展現(xiàn)出敏銳的感知能力和靈活的運動能力。幼魚的外觀形態(tài)正常，身體呈半透明狀，體表光滑，無任何損傷或異常斑紋，魚鰭完整且舒展，各鰭的擺動有力，表明其肌肉和神經(jīng)系統(tǒng)功能正常。其鰓蓋有規(guī)律地開合，頻率穩(wěn)定，約為每分鐘[X]次，這反映出它們的呼吸功能正常，能夠有效地從水中攝取氧氣，維持生命活動的正常進行。H/R組的斑馬魚幼魚在缺氧處理后，行為和外觀發(fā)生了顯著變化。行為方面，幼魚出現(xiàn)了明顯的抽搐癥狀，身體不自主地抖動，抽搐頻率可達每分鐘[X]次，這是由于缺氧導致神經(jīng)系統(tǒng)受損，神經(jīng)信號傳遞異常，引發(fā)肌肉的異常收縮。它們的游動變得不平衡，難以保持直線游動，常常出現(xiàn)左右搖擺、打轉的現(xiàn)象，運動協(xié)調(diào)性明顯下降，這表明缺氧對其平衡感和運動控制能力造成了嚴重影響。對刺激的反應也變得遲鈍，當給予同樣的玻璃棒輕觸刺激時，它們的反應時間明顯延長，平均反應時間為[X]秒，且反應幅度較小，部分幼魚甚至對較強的刺激也無明顯反應，這進一步證實了其神經(jīng)系統(tǒng)功能的受損。外觀上，幼魚的體色逐漸變淺，失去了正常的光澤，呈現(xiàn)出一種蒼白的色澤，這可能是由于缺氧導致血液循環(huán)不暢，組織器官得不到充足的氧氣和營養(yǎng)供應。魚鰭也出現(xiàn)了不同程度的收縮，不再像正常幼魚那樣舒展，鰭條之間的間隙變小，這可能影響了它們的游動效率和靈活性。鰓蓋開合頻率明顯加快，可達每分鐘[X]次，這是身體為了攝取更多氧氣而做出的代償性反應，但由于缺氧嚴重，這種代償往往難以滿足身體的需求。低濃度臭氧組和高濃度臭氧組的斑馬魚幼魚在經(jīng)過醫(yī)用臭氧復氧處理后，與H/R組相比，行為和外觀有了明顯的改善。行為上，抽搐癥狀得到了顯著緩解，抽搐頻率大幅降低，低濃度臭氧組幼魚的抽搐頻率降至每分鐘[X]次，高濃度臭氧組降至每分鐘[X]次，表明醫(yī)用臭氧能夠有效減輕缺氧對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，恢復神經(jīng)信號的正常傳遞。不平衡游動的現(xiàn)象也有所改善，幼魚能夠逐漸保持較為穩(wěn)定的游動姿態(tài)，游動軌跡更加規(guī)則，運動協(xié)調(diào)性得到一定程度的恢復，這說明醫(yī)用臭氧有助于改善幼魚的平衡感和運動控制能力。對刺激的反應也逐漸恢復靈敏，平均反應時間縮短至[X]秒，接近正常對照組的反應水平，這顯示出醫(yī)用臭氧能夠促進神經(jīng)系統(tǒng)功能的恢復。外觀上，幼魚的體色逐漸恢復，變得更加鮮艷，接近正常對照組的色澤，這表明醫(yī)用臭氧能夠改善血液循環(huán)，使組織器官得到充足的氧氣和營養(yǎng)供應。魚鰭也逐漸舒展，鰭條之間的間隙恢復正常，游動時更加靈活，這有助于提高幼魚的游動效率和生存能力。鰓蓋開合頻率逐漸趨于正常，低濃度臭氧組和高濃度臭氧組的鰓蓋開合頻率分別降至每分鐘[X]次和[X]次，這表明醫(yī)用臭氧能夠緩解缺氧引起的呼吸代償，使呼吸功能恢復正常。在復氧后的不同時間點，這種改善趨勢持續(xù)存在，且高濃度臭氧組的改善效果在多數(shù)時間點上優(yōu)于低濃度臭氧組，說明醫(yī)用臭氧對斑馬魚幼魚缺氧腦損傷的保護作用具有一定的濃度依賴性。4.2.2組織學檢測結果通過甲苯胺藍染色，能夠清晰地觀察到各組斑馬魚幼魚腦組織神經(jīng)元的形態(tài)變化。在正常對照組中，神經(jīng)元形態(tài)飽滿，細胞核大且呈圓形，位于細胞中央，核仁清晰可見，細胞質(zhì)均勻分布，尼氏體豐富且均勻地分布在細胞質(zhì)中，這表明神經(jīng)元的結構完整，功能正常。神經(jīng)元之間的連接清晰有序，神經(jīng)網(wǎng)絡結構完整，能夠有效地傳遞神經(jīng)信號。H/R組的神經(jīng)元則出現(xiàn)了明顯的損傷。神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生改變，細胞體皺縮變小，細胞核固縮，染色質(zhì)凝聚，核仁不清晰，這是神經(jīng)元受損的典型表現(xiàn)。細胞質(zhì)中的尼氏體減少，分布不均勻，部分區(qū)域甚至出現(xiàn)尼氏體消失的現(xiàn)象，這表明神經(jīng)元的蛋白質(zhì)合成功能受到抑制，細胞代謝活動紊亂。神經(jīng)元之間的連接也變得模糊不清，神經(jīng)網(wǎng)絡結構受到破壞，神經(jīng)信號的傳遞受到阻礙。與正常對照組相比，H/R組神經(jīng)元損傷的比例顯著增加，達到了[X]%，這進一步證實了缺氧對神經(jīng)元的嚴重損害。低濃度臭氧組和高濃度臭氧組在經(jīng)過醫(yī)用臭氧復氧處理后，神經(jīng)元損傷得到了不同程度的改善。神經(jīng)元形態(tài)有所恢復，細胞體逐漸變得飽滿，細胞核的形態(tài)逐漸恢復正常，染色質(zhì)凝聚現(xiàn)象減輕，核仁清晰可見，細胞質(zhì)中的尼氏體增多，分布也更加均勻，這表明神經(jīng)元的結構和功能在逐漸恢復。神經(jīng)元之間的連接也逐漸清晰，神經(jīng)網(wǎng)絡結構得到一定程度的修復，神經(jīng)信號的傳遞功能有所改善。低濃度臭氧組神經(jīng)元損傷比例降低至[X]%，高濃度臭氧組降低至[X]%，且高濃度臭氧組的改善效果更為顯著，說明醫(yī)用臭氧對神經(jīng)元損傷具有明顯的保護作用，且這種保護作用與濃度密切相關。TUNEL染色結果顯示，正常對照組中幾乎沒有凋亡細胞，凋亡細胞的陽性率極低，僅為[X]%，這表明正常情況下斑馬魚幼魚腦組織細胞的凋亡處于極低水平，細胞生長和死亡保持平衡。H/R組的凋亡細胞數(shù)量明顯增多，在腦組織的多個區(qū)域，如大腦皮層、海馬區(qū)等，都能觀察到大量的凋亡細胞，凋亡細胞陽性率高達[X]%。這些凋亡細胞的細胞核被染成棕黃色，形態(tài)不規(guī)則，呈現(xiàn)出典型的凋亡特征，如細胞核固縮、碎裂等。這表明缺氧導致了大量細胞凋亡，嚴重影響了腦組織的正常結構和功能。低濃度臭氧組和高濃度臭氧組的凋亡細胞數(shù)量顯著減少。低濃度臭氧組凋亡細胞陽性率降至[X]%，高濃度臭氧組降至[X]%，且高濃度臭氧組的凋亡細胞減少更為明顯。這說明醫(yī)用臭氧能夠有效抑制細胞凋亡，對斑馬魚幼魚缺氧腦損傷后的腦組織具有保護作用，且隨著臭氧濃度的增加，抑制細胞凋亡的效果更加顯著。通過對不同時間點的觀察發(fā)現(xiàn)，隨著復氧時間的延長，低濃度臭氧組和高濃度臭氧組的凋亡細胞數(shù)量進一步減少，這表明醫(yī)用臭氧的保護作用在復氧過程中持續(xù)發(fā)揮，且時間越長，效果越明顯。4.2.3氧化應激指標檢測結果超氧化物歧化酶（SOD）作為一種重要的抗氧化酶，在維持細胞內(nèi)氧化還原平衡中起著關鍵作用。正常對照組斑馬魚幼魚腦組織中SOD活性維持在相對穩(wěn)定的水平，為[X]U/mgprot，這表明其體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)能夠有效地清除自由基，維持細胞的正常生理功能。H/R組在缺氧/復氧處理后，SOD活性顯著降低，降至[X]U/mgprot，這是由于缺氧導致大量自由基產(chǎn)生，超出了SOD的清除能力，使得SOD在清除自由基的過程中被大量消耗，同時其合成可能也受到了抑制，從而導致SOD活性下降。SOD活性的降低使得細胞內(nèi)自由基積累，進一步加劇了氧化應激損傷，對細胞的結構和功能造成嚴重破壞。低濃度臭氧組和高濃度臭氧組在經(jīng)過醫(yī)用臭氧復氧處理后，SOD活性明顯升高。低濃度臭氧組SOD活性升高至[X]U/mgprot，高濃度臭氧組升高至[X]U/mgprot，且高濃度臭氧組的SOD活性升高更為顯著。這說明醫(yī)用臭氧能夠誘導SOD的表達和活性增強，提高細胞的抗氧化能力，有效清除體內(nèi)過多的自由基，減輕氧化應激損傷。隨著復氧時間的延長，低濃度臭氧組和高濃度臭氧組的SOD活性持續(xù)上升，表明醫(yī)用臭氧對SOD活性的促進作用在復氧過程中持續(xù)存在，且時間越長，效果越明顯。丙二醛（MDA）作為脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其含量能夠直接反映細胞受到氧化損傷的程度。正常對照組斑馬魚幼魚腦組織中MDA含量較低，為[X]nmol/mgprot，這表明其細胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化水平較低，細胞膜等生物膜結構完整，細胞功能正常。H/R組在缺氧/復氧處理后，MDA含量顯著升高，達到[X]nmol/mgprot，這是由于缺氧引發(fā)的氧化應激導致細胞膜中的不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應，生成大量的MDA。MDA含量的升高進一步破壞了細胞膜的結構和功能，導致細胞通透性增加，細胞內(nèi)物質(zhì)外流，影響細胞的正常代謝和生理功能。低濃度臭氧組和高濃度臭氧組在經(jīng)過醫(yī)用臭氧復氧處理后，MDA含量明顯降低。低濃度臭氧組MDA含量降至[X]nmol/mgprot，高濃度臭氧組降至[X]nmol/mgprot，且高濃度臭氧組的MDA含量降低更為顯著。這說明醫(yī)用臭氧能夠減輕脂質(zhì)過氧化反應，降低MDA的生成，從而保護細胞膜等生物膜結構，減少氧化應激對細胞的損傷。在復氧后的不同時間點，低濃度臭氧組和高濃度臭氧組的MDA含量持續(xù)下降，表明醫(yī)用臭氧對脂質(zhì)過氧化的抑制作用在復氧過程中持續(xù)發(fā)揮，且時間越長，效果越明顯?？偪寡趸椒从沉藱C體抗氧化防御系統(tǒng)的綜合能力。正常對照組斑馬魚幼魚腦組織具有較高的總抗氧化水平，為[X]mmol/L，這表明其體內(nèi)的抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶共同作用，能夠有效地抵御氧化應激的損傷。H/R組在缺氧/復氧處理后，總抗氧化水平顯著降低，降至[X]mmol/L，這是由于缺氧導致抗氧化物質(zhì)的消耗增加，同時抗氧化酶的活性受到抑制，使得機體的抗氧化防御系統(tǒng)功能下降，無法有效清除自由基，導致氧化應激損傷加劇。低濃度臭氧組和高濃度臭氧組在經(jīng)過醫(yī)用臭氧復氧處理后，總抗氧化水平明顯升高。低濃度臭氧組總抗氧化水平升高至[X]mmol/L，高濃度臭氧組升高至[X]mmol/L，且高濃度臭氧組的總抗氧化水平升高更為顯著。這說明醫(yī)用臭氧能夠增強機體的抗氧化防御系統(tǒng)功能，提高總抗氧化水平，有效清除體內(nèi)過多的自由基，減輕氧化應激損傷。隨著復氧時間的延長，低濃度臭氧組和高濃度臭氧組的總抗氧化水平持續(xù)上升，表明醫(yī)用臭氧對總抗氧化水平的提升作用在復氧過程中持續(xù)存在，且時間越長，效果越明顯。4.2.4SODmRNA表達水平檢測結果實時熒光定量PCR檢測結果顯示，正常對照組斑馬魚幼魚腦組織中SODmRNA表達水平保持在相對穩(wěn)定的狀態(tài)，以β-actin為內(nèi)參基因進行標準化后，其相對表達量為[X]。這表明在正常生理條件下，SOD基因的轉錄處于穩(wěn)定水平，能夠維持細胞內(nèi)SOD的正常合成，以滿足機體抗氧化的需求。H/R組在缺氧/復氧處理后，SODmRNA表達水平顯著降低，相對表達量降至[X]。這是由于缺氧對細胞的基因轉錄過程產(chǎn)生了負面影響，可能抑制了SOD基因的轉錄因子活性，或者影響了轉錄相關的信號通路，導致SOD基因的轉錄水平下降，進而使SOD的合成減少，細胞的抗氧化能力降低。低濃度臭氧組和高濃度臭氧組在經(jīng)過醫(yī)用臭氧復氧處理后，SODmRNA表達水平明顯升高。低濃度臭氧組SODmRNA相對表達量升高至[X]，高濃度臭氧組升高至[X]，且高濃度臭氧組的SODmRNA表達水平升高更為顯著。這說明醫(yī)用臭氧能夠促進SOD基因的轉錄，增加SODmRNA的表達量，從而為SOD的合成提供更多的模板，使細胞內(nèi)SOD的含量增加，增強細胞的抗氧化能力。通過對不同時間點的檢測發(fā)現(xiàn)，隨著復氧時間的延長，低濃度臭氧組和高濃度臭氧組的SODmRNA表達水平持續(xù)上升，表明醫(yī)用臭氧對SOD基因轉錄的促進作用在復氧過程中持續(xù)存在，且時間越長，效果越明顯。這進一步證實了醫(yī)用臭氧通過調(diào)節(jié)SOD基因的表達，在減輕斑馬魚幼魚缺氧腦損傷的氧化應激損傷中發(fā)揮著重要作用，且這種作用與臭氧濃度和復氧時間密切相關。五、結果討論5.1醫(yī)用臭氧對斑馬魚幼魚缺氧腦損傷的保護作用本研究結果表明，醫(yī)用臭氧對斑馬魚幼魚缺氧腦損傷具有顯著的保護作用。在一般狀況觀察中，H/R組斑馬魚幼魚在缺氧/復氧后出現(xiàn)明顯的抽搐、不平衡游動、對刺激反應遲鈍、體色變淺、魚鰭收縮、鰓蓋開合頻率加快等癥狀，而低濃度臭氧組和高濃度臭氧組在經(jīng)過醫(yī)用臭氧復氧處理后，這些癥狀得到了明顯改善，且高濃度臭氧組的改善效果在多數(shù)時間點上優(yōu)于低濃度臭氧組。這直觀地顯示出醫(yī)用臭氧能夠減輕缺氧對斑馬魚幼魚行為和外觀的負面影響，促進其生理狀態(tài)的恢復。從組織學檢測結果來看，H/R組斑馬魚幼魚腦組織神經(jīng)元出現(xiàn)明顯損傷，表現(xiàn)為細胞體皺縮、細胞核固縮、尼氏體減少、神經(jīng)網(wǎng)絡結構破壞，凋亡細胞數(shù)量顯著增加。而低濃度臭氧組和高濃度臭氧組在醫(yī)用臭氧處理后，神經(jīng)元損傷得到不同程度的改善，凋亡細胞數(shù)量顯著減少，且高濃度臭氧組的改善效果更為顯著。這進一步證實了醫(yī)用臭氧對斑馬魚幼魚缺氧腦損傷后的腦組織具有保護作用，能夠減輕神經(jīng)元損傷，抑制細胞凋亡，維持腦組織的正常結構和功能。在氧化應激指標檢測方面，H/R組在缺氧/復氧后，SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高，總抗氧化水平顯著降低，表明其體內(nèi)氧化應激損傷嚴重。低濃度臭氧組和高濃度臭氧組在醫(yī)用臭氧復氧處理后，SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低，總抗氧化水平明顯升高，且高濃度臭氧組的變化更為顯著。這說明醫(yī)用臭氧能夠通過增強抗氧化酶活性、降低脂質(zhì)過氧化水平，提高機體的總抗氧化能力，從而減輕氧化應激對斑馬魚幼魚腦組織的損傷。SODmRNA表達水平檢測結果也顯示，H/R組在缺氧/復氧后，SODmRNA表達水平顯著降低，而低濃度臭氧組和高濃度臭氧組在醫(yī)用臭氧處理后，SODmRNA表達水平明顯升高，且高濃度臭氧組升高更為顯著。這表明醫(yī)用臭氧能夠在基因轉錄水平上促進SOD的表達，為增強SOD活性提供更多的模板，進一步提高細胞的抗氧化能力，從而對斑馬魚幼魚缺氧腦損傷發(fā)揮保護作用。綜合以上實驗結果，醫(yī)用臭氧對斑馬魚幼魚缺氧腦損傷的保護作用主要表現(xiàn)在以下幾個方面：一是改善斑馬魚幼魚的行為學表現(xiàn)，減輕缺氧對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，恢復神經(jīng)功能；二是減輕腦組織神經(jīng)元損傷，抑制細胞凋亡，維持腦組織的正常結構；三是增強機體的抗氧化能力，減輕氧化應激損傷，保護細胞免受自由基的攻擊。這些保護作用的實現(xiàn)可能與醫(yī)用臭氧的氧化、抗炎和鎮(zhèn)痛等作用機制密切相關。醫(yī)用臭氧的氧化作用能夠調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的氧化還原平衡，激活抗氧化防御系統(tǒng)；抗炎作用可以減輕炎癥反應對腦組織的損傷；鎮(zhèn)痛作用則有助于緩解缺氧引起的疼痛，減少對神經(jīng)系統(tǒng)的刺激，從而綜合發(fā)揮對斑馬魚幼魚缺氧腦損傷的保護作用。5.2作用機制探討綜合本研究的氧化應激指標和基因表達結果，醫(yī)用臭氧對斑馬魚幼魚缺氧腦損傷發(fā)揮保護作用的潛在機制主要涉及抗氧化和抗炎等方面。在抗氧化方面，醫(yī)用臭氧能夠顯著提升SOD活性并上調(diào)SODmRNA表達水平。SOD作為抗氧化防御系統(tǒng)的關鍵酶，可催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應，生成氧氣和過氧化氫，從而有效清除體內(nèi)過多的自由基，減輕氧化應激損傷。當斑馬魚幼魚遭受缺氧腦損傷時，體內(nèi)氧化應激水平急劇升高，大量自由基產(chǎn)生，導致SOD消耗增加且合成受到抑制，SOD活性和mRNA表達水平顯著降低。而醫(yī)用臭氧的干預能夠促進SOD基因的轉錄，增加SODmRNA的表達量，為SOD的合成提供更多模板，進而提高SOD活性。這一系列作用使得細胞內(nèi)的自由基水平得以有效控制，減少了自由基對細胞膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的氧化損傷，保護了細胞的正常結構和功能。醫(yī)用臭氧可能通過激活相關的信號通路來實現(xiàn)對SOD基因表達的調(diào)控。已有研究表明，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路在氧化應激反應中發(fā)揮著重要作用，醫(yī)用臭氧或許能夠激活MAPK信號通路中的關鍵蛋白，如細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等，這些激活的蛋白進一步作用于SOD基因的啟動子區(qū)域，促進其轉錄，從而提高SOD的表達水平和活性。從脂質(zhì)過氧化角度來看，醫(yī)用臭氧能明顯降低MDA含量。MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其含量的升高反映了細胞膜中不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應的程度，會導致細胞膜結構和功能受損。在缺氧腦損傷過程中，由于自由基的大量產(chǎn)生，細胞膜的脂質(zhì)過氧化作用加劇，MDA含量顯著上升。醫(yī)用臭氧通過增強抗氧化酶活性，如SOD等，有效清除自由基，抑制了脂質(zhì)過氧化反應的發(fā)生，從而降低了MDA含量。醫(yī)用臭氧可能直接與過氧化脂質(zhì)反應，阻斷脂質(zhì)過氧化的鏈式反應，減少MDA的生成。這一作用保護了細胞膜的完整性，維持了細胞的正常生理功能，減少了因細胞膜損傷導致的細胞凋亡和壞死。在抗炎方面，雖然本研究未直接檢測炎癥因子的表達水平，但結合醫(yī)用臭氧在其他研究中的抗炎作用機制以及本研究中組織學檢測和氧化應激指標的結果，可以推測醫(yī)用臭氧在斑馬魚幼魚缺氧腦損傷中也發(fā)揮了抗炎作用。在炎癥反應中，會產(chǎn)生一系列炎癥因子，如白細胞介素（IL）-1、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，這些炎癥因子會進一步加劇炎癥反應，導致組織損傷。醫(yī)用臭氧能夠刺激抗氧化酶的過度表達，中和炎癥反應中產(chǎn)生的過量的反應性氧化產(chǎn)物，減少其對組織細胞的損傷，從而緩解炎癥。醫(yī)用臭氧還可能刺激拮抗炎性反應的細胞因子產(chǎn)生，如IL-10、轉化生長因子-β1（TGF-β1）等，同時抑制致炎因子的表達，降低炎癥因子的水平，減輕炎癥反應。在本研究中，醫(yī)用臭氧處理后，斑馬魚幼魚腦組織神經(jīng)元損傷減輕，凋亡細胞數(shù)量減少，這可能與醫(yī)用臭氧的抗炎作用密切相關。炎癥的減輕有助于減少對神經(jīng)元的損傷，抑制細胞凋亡，促進腦組織的修復和功能恢復。醫(yī)用臭氧對斑馬魚幼魚缺氧腦損傷的保護作用是通過多種機制協(xié)同發(fā)揮作用的，主要包括抗氧化和抗炎等方面。這些機制相互關聯(lián)，共同減輕了氧化應激和炎癥反應對腦組織的損傷，為新生兒缺氧缺血性腦病的治療提供了潛在的理論依據(jù)和治療靶點。未來的研究可以進一步深入探討醫(yī)用臭氧在斑馬魚幼魚缺氧腦損傷中的具體信號通路和分子機制，以及其與其他治療方法的聯(lián)合應用效果，為臨床治療提供更全面、更有效的治療策略。5.3不同濃度醫(yī)用臭氧的干預效果差異本研究設置了低濃度臭氧組和高濃度臭氧組，旨在探究不同濃度醫(yī)用臭氧對斑馬魚幼魚缺氧腦損傷的干預效果差異。從實驗結果來看，不同濃度的醫(yī)用臭氧在改善斑馬魚幼魚的行為學表現(xiàn)、減輕腦組織損傷以及調(diào)節(jié)氧化應激和基因表達等方面均呈現(xiàn)出不同程度的作用。在行為學表現(xiàn)方面，低濃度臭氧組和高濃度臭氧組在經(jīng)過醫(yī)用臭氧復氧處理后，均表現(xiàn)出抽搐癥狀緩解、不平衡游動現(xiàn)象改善以及對刺激反應恢復靈敏的情況。但高濃度臭氧組的改善效果更為顯著，抽搐頻率降低幅度更大，運動協(xié)調(diào)性恢復更快，對刺激的反應時間更短。這表明高濃度的醫(yī)用臭氧在恢復斑馬魚幼魚神經(jīng)功能方面具有更強的作用，能夠更有效地減輕缺氧對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。組織學檢測結果顯示，低濃度臭氧組和高濃度臭氧組在醫(yī)用臭氧處理后，神經(jīng)元損傷均得到不同程度的改善，凋亡細胞數(shù)量顯著減少。然而，高濃度臭氧組在減輕神經(jīng)元損傷和抑制細胞凋亡方面的效果明顯優(yōu)于低濃度臭氧組。高濃度臭氧組的神經(jīng)元形態(tài)恢復更接近正常狀態(tài)，尼氏體分布更均勻，神經(jīng)網(wǎng)絡結構修復更完善，凋亡細胞陽性率更低。這說明高濃度的醫(yī)用臭氧能夠更有效地保護腦組織，維持其正常結構和功能。氧化應激指標檢測結果進一步證實了不同濃度醫(yī)用臭氧的干預效果差異。在SOD活性方面，高濃度臭氧組升高更為顯著，表明高濃度醫(yī)用臭氧能夠更有效地誘導SOD的表達和活性增強，提高細胞的抗氧化能力。在MDA含量方面，高濃度臭氧組降低幅度更大，說明高濃度醫(yī)用臭氧在減輕脂質(zhì)過氧化反應、保護細胞膜結構方面具有更強的作用。總抗氧化水平的變化也呈現(xiàn)出類似的趨勢，高濃度臭氧組的總抗氧化水平升高更為明顯，表明