運(yùn)用植物體細(xì)胞雜交技術(shù)，可以跨越不同種植之間生殖隔離的屏障，培育出新的作物類型。有沒有技術(shù)能讓不同種動物的體細(xì)胞進(jìn)行雜交，培育出集不同細(xì)胞的優(yōu)勢于一身的動物細(xì)胞呢？去除細(xì)胞壁雜種細(xì)胞再生

新細(xì)胞壁植物細(xì)胞融合脫

分化移

栽植物組織培養(yǎng)融合并篩選再

分化1970年人-鼠細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)滅活的仙臺病毒誘導(dǎo)第2章

細(xì)胞工程第2節(jié)

動物細(xì)胞工程二、動物細(xì)胞融合與單克隆抗體【本節(jié)聚焦】1.什么是動物細(xì)胞融合技術(shù)？2.單克隆抗體是如何制備的？在臨床上有哪些應(yīng)用？一、動物細(xì)胞融合技術(shù)閱讀P48-49，思考1.動物細(xì)胞融合技術(shù)的結(jié)果是？原理是？誘導(dǎo)方法有？意義是？應(yīng)用有哪些？2.早期人們用怎樣的方法獲得抗體？該方法制備的抗體特點(diǎn)有？3.如何獲得既能無限增殖又能產(chǎn)生抗體的細(xì)胞？4.結(jié)合圖2-16，分析單克隆抗體的制備過程是怎樣的？要經(jīng)過幾次篩選？一、動物細(xì)胞融合技術(shù)1.概念：2.結(jié)果：3.原理：4.方法：使兩個或多個動物細(xì)胞結(jié)合形成一個細(xì)胞的技術(shù)。融合后形成的雜交細(xì)胞就有原來兩個或多個細(xì)胞的遺傳信息。細(xì)胞膜具有一定的流動性。物理方法：電融合法等化學(xué)方法：聚乙二醇（PEG）融合法生物方法：滅活病毒誘導(dǎo)法生物方法：滅活病毒誘導(dǎo)法滅活：是指用物理或化學(xué)手段使病毒或細(xì)菌失去感染能力，但并不破壞它們的抗原結(jié)構(gòu)。原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細(xì)胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細(xì)胞相互凝集，細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合。P49思考：19世紀(jì)30年代，科學(xué)家曾在肺結(jié)核、天花和麻疹等疾病的病人的病理組織中觀察到多核細(xì)胞。如何解釋這一現(xiàn)象？病人體內(nèi)病毒等誘導(dǎo)多個體細(xì)胞融合形成了多核細(xì)胞。一、動物細(xì)胞融合技術(shù)5.意義：突破了有性雜交的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能。(1)已成為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和培育生物新品種等的重要手段。(2)利用動物細(xì)胞融合技術(shù)發(fā)展起來的雜交瘤技術(shù)，為制造單克隆抗體開辟了新途徑。6.應(yīng)用：人們可以按照預(yù)先的設(shè)計(jì)使不同細(xì)胞融合，至今，種間、屬間、科間，甚至動物和植物之間的細(xì)胞融合都已獲得了成功。植物體細(xì)胞雜交動物細(xì)胞融合原理細(xì)胞融合前的處理方法誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法細(xì)胞融合成功的標(biāo)志結(jié)果意義細(xì)胞膜具有一定的流動性、植物細(xì)胞的全能性細(xì)胞膜具有一定的流動性果膠酶和纖維素酶去除細(xì)胞壁胰蛋白酶或膠原蛋白酶使細(xì)胞分散成單個細(xì)胞電融合法、離心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導(dǎo)法再生出細(xì)胞壁細(xì)胞核的融合獲得完整的雜種植株得到雜交細(xì)胞打破生殖隔離，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交育種，培育植物新品種突破了有性雜交的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能7.動物細(xì)胞融合和植物體細(xì)胞雜交的比較(1)生產(chǎn)方法二、單克隆抗體及其應(yīng)用向動物反復(fù)注射某種抗原使動物產(chǎn)生抗體從動物血清中分離所需抗體產(chǎn)量低、純度低、特異性差1.傳統(tǒng)抗體產(chǎn)生（多克隆抗體的產(chǎn)生）(2)缺點(diǎn)某種抗原抗體【拓展1】對于一個抗原的刺激，每個B細(xì)胞只能合成并分泌一種識別抗原特定區(qū)域（抗原決定簇）的特異性抗體。只含有針對一個抗原決定簇的抗體稱為單克隆抗體（純度高，特異性強(qiáng)，能準(zhǔn)確識別抗原并與之特異性結(jié)合）一個抗原可有多個不同的抗原決定簇，因此一個抗原可刺激B細(xì)胞產(chǎn)生多種漿細(xì)胞，不同的漿細(xì)胞可產(chǎn)生針對不同抗原決定簇的多種抗體。這種由同一抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的針對多個抗原決定簇的抗體稱為多克隆抗體，即傳統(tǒng)抗體（產(chǎn)量低、純度低、特異性差）克隆B淋巴細(xì)胞不具有無限增殖的能力，因此上述方案不可行。如何獲得既能無限增殖又能產(chǎn)生抗體的細(xì)胞？一個B淋巴細(xì)胞B淋巴細(xì)胞群單克隆抗體產(chǎn)生動物體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體的種類超過百萬種，但每一個B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體。因此，要想獲得大量的單一抗體，必須克隆單一的B淋巴細(xì)胞，形成細(xì)胞群。思考：如何制備單克隆抗體如何獲得既能無限增殖又能產(chǎn)生抗體的細(xì)胞？1975年，英國科學(xué)家米爾斯坦和德國科學(xué)家科勒設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)獲得了單克隆抗體，因此獲得1984年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。實(shí)驗(yàn)：把一種B淋巴細(xì)胞與能在體外大量增殖的骨髓瘤細(xì)胞融合，所得到的融合細(xì)胞就可能大量增殖，產(chǎn)生足夠數(shù)量的特定抗體。二、單克隆抗體及其應(yīng)用2.單克隆抗體制備過程二、單克隆抗體及其應(yīng)用2.單克隆抗體制備過程二、單克隆抗體及其應(yīng)用2.單克隆抗體制備過程注射特定抗原免疫小鼠培養(yǎng)小鼠骨髓瘤細(xì)胞多種B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞多種細(xì)胞多種雜交瘤細(xì)胞抗體檢測呈陽性的雜交瘤細(xì)胞注射小鼠腹腔內(nèi)增殖體外培養(yǎng)小鼠腹水細(xì)胞培養(yǎng)液單克隆抗體誘導(dǎo)融合篩選1①未融合的、②融合的具有同種核的、③融合的雜交瘤細(xì)胞選擇培養(yǎng)基篩選2克隆化培養(yǎng)抗體檢測既能大量增殖，又能產(chǎn)生抗體分泌的抗體能與特定的抗原結(jié)合2.單克隆抗體制備過程二、單克隆抗體及其應(yīng)用多種細(xì)胞篩選1篩選2原因目的方法原理誘導(dǎo)融合后得到多種雜交細(xì)胞，未融合的細(xì)胞、同種細(xì)胞融合后形成的細(xì)胞。篩選出雜交瘤細(xì)胞特定的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選：未融合的細(xì)胞和同種細(xì)胞融合后形成的細(xì)胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細(xì)胞才能生長選擇培養(yǎng)由于特定抗原刺激產(chǎn)生多種B淋巴細(xì)胞，因此經(jīng)選擇培養(yǎng)獲得的雜交瘤細(xì)胞中有能產(chǎn)生其他抗體的細(xì)胞。篩選出能產(chǎn)生所需抗體（抗體檢測呈陽性）的雜交瘤細(xì)胞克隆化培養(yǎng)和抗體檢測，經(jīng)多次篩選用96孔板培養(yǎng)和篩選：在每一個孔中盡量只接種一個雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測，經(jīng)多次篩選，得到足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的細(xì)胞抗原與抗體特異性結(jié)合1.篩選1特定的選擇培養(yǎng)基，如HAT選擇培養(yǎng)基含次黃嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T）單克隆抗體制備中2次篩選的方法(1)細(xì)胞中合成DNA的2條途徑①D途徑：從頭合成途徑核苷酸某些氨基酸+CO2+葉酸+五碳糖+磷酸DNA合成堿基②S途徑：補(bǔ)救合成途徑利用非堿基成分合成DNA的過程利用核苷酸降解產(chǎn)物合成DNA的過程堿基+五碳糖+磷酸核苷酸DNA骨髓瘤細(xì)胞缺乏途徑S相關(guān)的酶。【拓展2】(2)HAT選擇培養(yǎng)基篩選原理未融合的B淋巴細(xì)胞融合的B淋巴細(xì)胞未融合的骨髓瘤細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞只能存活幾天，不能無限增殖而死亡骨髓瘤細(xì)胞本身缺乏補(bǔ)救途徑中相關(guān)酶，從頭合成途徑被氨基蝶呤阻斷，無法增殖而死亡。骨髓瘤細(xì)胞從B細(xì)胞那里獲得補(bǔ)救途徑中相關(guān)的酶，可以利用HAT培養(yǎng)基中的次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷經(jīng)過補(bǔ)救途徑合成DNA，從而可以生存并增殖。H次黃嘌呤A氨基蝶呤T胸腺嘧啶核苷D途徑：從頭合成途徑S途徑：補(bǔ)救合成途徑阻斷提供原料雜交瘤細(xì)胞懸液96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(克隆化培養(yǎng))稀釋加到抗體檢測選擇陽性克隆稀釋加到用96孔板培養(yǎng)和篩選

雜交瘤細(xì)胞（每一個孔中盡量只接種一個雜交瘤細(xì)胞）2.篩選2---克隆化培養(yǎng)和抗體檢測將處于對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞用培養(yǎng)液充分稀釋，使分配到96孔板每個孔中的細(xì)胞數(shù)不超過1，通過培養(yǎng)讓它增殖為單克隆。稀釋加到克隆化培養(yǎng)放大雜交瘤細(xì)胞一般培養(yǎng)4~5d后，如果在倒置顯微鏡下見到一簇緊密生長的細(xì)胞，可認(rèn)為這是單一克隆。經(jīng)過一次克隆化培養(yǎng)的細(xì)胞不能保證其來自單個細(xì)胞，一般經(jīng)過3~4次培養(yǎng)才可以獲得穩(wěn)定的單克隆?？贵w檢測選擇陽性克隆重復(fù)以上操作不斷純化這時候，如果再次檢測抗體為陽性，就可以進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)了。資料1:用抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體做成的“早早孕診斷試劑盒”在妊娠第8天就可以做出診斷，這比原來的診斷方法提前了10d左右。單克隆抗體的應(yīng)用思考·討論在受精后不久，胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞就會分泌人絨毛膜促性腺激素(HCG)，一種糖蛋白類激素，在孕婦的尿液中大量存在。而在非妊娠婦女尿液中幾乎不含有。單克隆抗體【思考】正常的性成熟女性每個月都會排卵，最佳受精時間為排卵后24-36小時。在女性的月經(jīng)周期中，尿液中的促黃體生成素會在排卵前24小時左右出現(xiàn)高峰值。據(jù)此可推測，排卵試紙起核心作用的物質(zhì)是

。抗促黃體生成素單克隆抗體排卵試紙資料2：使用高效的細(xì)胞毒素類藥物進(jìn)行化療可以有效殺傷腫瘤細(xì)胞。ADC示意圖問題：細(xì)胞毒素沒有特異性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時還會對健康細(xì)胞造成傷害。解決方法：抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)，將細(xì)胞毒素與能特異性識別腫瘤抗原的單克隆抗體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷。抗體藥物接頭ADC的作用機(jī)制示意圖①ADC②③④溶酶體裂解釋放藥物⑤細(xì)胞凋亡抗體藥物接頭抗體-藥物偶聯(lián)物抗原ADC被細(xì)胞吞噬優(yōu)點(diǎn)：不損傷正常細(xì)胞用藥量小毒副作用小腫瘤細(xì)胞討論1.ADC的抗體和藥物各具有什么作用？①抗體主要發(fā)揮靶向運(yùn)輸作用，即通過特異性結(jié)合靶細(xì)胞表面的抗原，將連接的藥物輸送到靶細(xì)胞。②藥物發(fā)揮治療效應(yīng)。如殺傷靶細(xì)胞。2.除了細(xì)胞毒素，還有哪些物質(zhì)理論上可以作為ADC偶聯(lián)的藥物？①用放射性同位素標(biāo)記單克隆抗體進(jìn)行靶向放療。②一些作用于細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的藥物可以通過阻斷腫瘤細(xì)胞的信號通路來抑制其生長，理論上也可以將這些藥物與單克隆抗體結(jié)合進(jìn)行治療。討論3.單克隆抗體診斷試劑盒和ADC在臨床上各具有什么優(yōu)勢？①單克隆抗體診斷試劑盒中的單克隆抗體只與特定的抗原反應(yīng)，因此檢測的特異性和靈敏度大大提高；②生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞可以傳代培養(yǎng)、冷凍保存和復(fù)蘇利用,有利于控制產(chǎn)品的質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)診斷試劑盒。③ADC能夠協(xié)同發(fā)揮抗體特異性識別的靶向作用和細(xì)胞毒素對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，因此它在臨床上具有靶點(diǎn)清楚、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)。討論4.單克隆抗體在臨床上還有哪些應(yīng)用？①治療方面：用于腫瘤、自身免疫病等疾病的治療，如利妥昔單抗被用于治療復(fù)發(fā)難治的低分化B細(xì)胞淋巴瘤；曲妥珠單抗被用于治療乳腺癌等。②診斷方面：一些感染性疾病的檢測、腫瘤的診斷、激素和細(xì)胞因子的測定等。甲胎蛋白(AFP)是一種特異性較強(qiáng)的腫瘤標(biāo)志物，用甲胎蛋白作為

免疫小鼠，制備

，并與含有放射性同位素的標(biāo)記物連接，單克隆抗體攜帶放射性標(biāo)記物通過血液可到達(dá)全身幾乎所有組織。由于腫瘤細(xì)胞表面的

會和單克隆抗體特異性的結(jié)合，所以放射性同位素標(biāo)記物就不斷積累在

上。通過一定的顯影技術(shù)就可以發(fā)現(xiàn)腫瘤所在。抗原抗AFP單克隆抗體AFP腫瘤二、單克隆抗體及其應(yīng)用3.單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)(1)能準(zhǔn)確識別抗原的細(xì)微差異，與特定抗原發(fā)生特異性結(jié)合。(特異性強(qiáng)，靈敏度高）(2)可大量制備。(1)運(yùn)載藥物(2)作診斷試劑(3)治療疾病如將細(xì)胞毒素與能特異性識別腫瘤抗原的單克隆抗體結(jié)合(抗體—藥物偶聯(lián)物)，可選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞。利用同位素或熒光標(biāo)記的單克隆抗體在特定組織中成像的技術(shù)，可定位診斷腫瘤、心血管畸形等疾病。2015年，全球銷售額排名前十位的藥物中，單克隆抗體藥物就有5種。同年，我國的單克隆抗體藥物市場規(guī)模已達(dá)72億元。4.單克隆抗體的應(yīng)用排名藥物中文名銷售額(億美元)適應(yīng)癥類型1Humria修美樂199.36自身免疫疾病單抗6Herceptin赫賽汀70.32乳腺癌等多種癌癥單抗7Avastin安維汀68.98結(jié)腸癌等多中癌癥單抗8Rituxan美羅華68.01白血病單抗9Opdivo納武單抗67.35多種腫瘤單抗2018年全球藥物銷售額排名前1