實(shí)驗(yàn)室石蠟切片完整操作流程一、引言石蠟切片技術(shù)是組織學(xué)、病理學(xué)及分子生物學(xué)研究的核心技術(shù)之一，通過(guò)固定-脫水-浸蠟-包埋-切片-染色的標(biāo)準(zhǔn)化流程，將新鮮組織轉(zhuǎn)化為可長(zhǎng)期保存的薄切片，為細(xì)胞形態(tài)觀察、抗原定位（免疫組化）、基因表達(dá)（原位雜交）等實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。其優(yōu)勢(shì)在于形態(tài)保存完整、切片厚度均勻、可連續(xù)切片，是科研與臨床診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”技術(shù)。本文結(jié)合多年實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，詳細(xì)闡述石蠟切片的完整操作流程及關(guān)鍵技術(shù)要點(diǎn)，旨在為實(shí)驗(yàn)室人員提供標(biāo)準(zhǔn)化操作指南。二、材料與試劑準(zhǔn)備（一）核心器械取材工具：鋒利解剖刀、鑷子、剪刀（避免擠壓組織）；切片設(shè)備：石蠟切片機(jī)（如LeicaRM2235）、攤片機(jī)（40-45℃）、烤片機(jī)（37℃）；載玻片/蓋玻片：載玻片需經(jīng)多聚賴氨酸/APES防脫處理（防止切片脫落），蓋玻片選用24×50mm或24×60mm（無(wú)劃痕）；其他：包埋盒、恒溫箱（60℃）、通風(fēng)櫥、顯微鏡。（二）試劑配制1.10%中性緩沖福爾馬林（NBF）：40%甲醛100ml+0.1MPBS（pH7.4）900ml（最常用固定液，保存細(xì)胞形態(tài)與抗原性）；2.梯度乙醇：70%、80%、90%、95%、100%（無(wú)水乙醇需用分子篩干燥）；3.透明劑：二甲苯（分析純，需通風(fēng)櫥操作）；4.石蠟：熔點(diǎn)56-58℃（熔點(diǎn)過(guò)高導(dǎo)致組織收縮，過(guò)低則切片易碎）；5.HE染色液：Harris蘇木精（染細(xì)胞核）、0.5%水溶性伊紅（染細(xì)胞質(zhì)）；6.分化/返藍(lán)液：1%鹽酸乙醇（1ml濃鹽酸+99ml70%乙醇）、50℃溫水（返藍(lán)用）；7.封片劑：中性樹(shù)膠（或加拿大樹(shù)膠，需預(yù)熱避免氣泡）。三、完整操作流程（一）取材與固定：避免自溶的關(guān)鍵步驟1.取材時(shí)間：組織離體后30分鐘內(nèi)取材（代謝活躍組織如肝臟、腎臟需立即處理）；部位：選取病變典型區(qū)+正常對(duì)照區(qū)（如腫瘤取邊緣浸潤(rùn)區(qū)，避免壞死灶）；大?。航M織塊尺寸1-2cm3，厚度≤0.5cm（過(guò)厚導(dǎo)致固定液滲透不均）；操作：用鋒利器械快速切割，避免牽拉、擠壓（擠壓會(huì)破壞細(xì)胞形態(tài)，導(dǎo)致染色不均）。2.固定固定液選擇：10%NBF適用于大多數(shù)組織（如肝、腎、腫瘤）；如需保存糖原，用70%乙醇；固定方法：組織完全浸沒(méi)于固定液中，液量為組織體積5-10倍（過(guò)少導(dǎo)致固定不充分）；固定時(shí)間：根據(jù)組織大小調(diào)整（小組織如淋巴結(jié)12小時(shí)，大組織如心肌48小時(shí)）；固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致組織變硬、抗原丟失，需嚴(yán)格控制。關(guān)鍵注意：固定不及時(shí)是切片質(zhì)量差的主要原因，需避免組織自溶（如離體后用生理鹽水紗布包裹，盡快轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室）。（二）脫水與透明：為浸蠟做準(zhǔn)備1.脫水脫水的目的是去除組織中的水分，使組織能被脂溶性石蠟滲透。需用梯度乙醇（低→高濃度）逐步脫水，避免組織劇烈收縮。流程：70%乙醇（2小時(shí)）→80%乙醇（2小時(shí)）→90%乙醇（2小時(shí)）→95%乙醇（2次，各1小時(shí)）→100%乙醇（2次，各1小時(shí)）；判斷標(biāo)準(zhǔn)：脫水徹底的組織呈半透明狀（如肝臟脫水后呈淡黃色透明）；注意事項(xiàng)：100%乙醇需定期更換（避免水分殘留），小組織（如小鼠脾臟）可縮短脫水時(shí)間（各步驟減少30分鐘）。2.透明透明的目的是用二甲苯置換組織中的乙醇，使組織變得透明，便于石蠟滲透。流程：100%乙醇:二甲苯（1:1）混合液（1小時(shí)）→二甲苯（2次，各1小時(shí)）；判斷標(biāo)準(zhǔn)：組織呈完全透明狀（如腎臟透明后可透過(guò)組織看到下面的文字）；注意事項(xiàng)：透明時(shí)間需適度（如腦組織透明時(shí)間縮短至30分鐘/次，過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致組織變脆）；二甲苯需在通風(fēng)櫥中操作，避免接觸皮膚（可戴手套、口罩）。（三）浸蠟與包埋：形成可切片的石蠟塊1.浸蠟浸蠟是用石蠟置換組織中的二甲苯，使組織變硬，便于切片。流程：將透明后的組織放入60℃恒溫箱中的石蠟中，浸蠟3次，每次1小時(shí)（首次浸蠟可加入少量二甲苯，促進(jìn)石蠟滲透）；注意事項(xiàng)：石蠟溫度需恒定（高于熔點(diǎn)10-15℃），過(guò)高會(huì)破壞細(xì)胞形態(tài)；浸蠟時(shí)間需足夠（如纖維組織需延長(zhǎng)至2小時(shí)/次），否則組織中殘留二甲苯，切片時(shí)易碎裂。2.包埋包埋是將浸蠟后的組織固定在石蠟塊中，決定切片方向的關(guān)鍵步驟。流程：（1）預(yù)熱包埋盒：在包埋機(jī)（60℃）中預(yù)熱包埋盒，避免石蠟?zāi)踢^(guò)快；（2）放置組織：將浸蠟后的組織放入包埋盒，調(diào)整組織方向（需切片的面朝下，如肝臟將切面朝下，便于觀察肝小葉結(jié)構(gòu)）；（3）倒入石蠟：緩慢倒入融化的石蠟，避免氣泡（可輕輕晃動(dòng)包埋盒，排出氣泡）；（4）冷卻凝固：將包埋盒放入冷水中（或冰袋上）快速冷卻，使石蠟?zāi)蹋ū苊饩徛鋮s導(dǎo)致組織收縮）。關(guān)鍵注意：組織方向需準(zhǔn)確（如腫瘤組織需將浸潤(rùn)邊緣朝下，否則切片無(wú)法觀察到病變結(jié)構(gòu)）；包埋時(shí)需避免氣泡（氣泡會(huì)導(dǎo)致切片出現(xiàn)孔洞）。（四）切片與貼片：制備薄切片的核心步驟1.切片切片的目的是獲得4-6μm厚的連續(xù)蠟帶（厚度均勻是染色均勻的前提）。流程：（1）固定蠟塊：將包埋好的石蠟塊固定在切片機(jī)夾頭上，調(diào)整角度（使切片面與切片刀平行）；（2）修蠟塊：用切片刀將蠟塊表面修平，露出組織（修蠟時(shí)避免損傷組織）；（3）調(diào)整厚度：根據(jù)組織類型調(diào)整（如腦組織3μm，纖維組織8μm）；（4）切片：轉(zhuǎn)動(dòng)切片機(jī)手柄，切出連續(xù)蠟帶（切片時(shí)保持勻速，避免用力過(guò)猛）。注意事項(xiàng)：切片厚度需均勻（可通過(guò)觀察蠟帶透明度判斷，均勻蠟帶呈半透明狀）；蠟塊溫度需適宜（如蠟塊過(guò)軟，可放在冰袋上冷卻10-15分鐘，使蠟塊變硬）；切片刀需鋒利（鈍刀會(huì)導(dǎo)致切片褶皺或碎裂，可使用磨刀石磨刀）。2.貼片貼片是將蠟帶固定在載玻片上，防止后續(xù)流程中脫落。流程：（1）攤片：將切好的蠟帶放入40-45℃溫水（攤片機(jī)）中，待蠟帶完全展開(kāi)（避免褶皺）；（2）撈片：用防脫載玻片輕輕撈起蠟帶（組織面朝下），調(diào)整位置（使組織位于載玻片中央）；（3）烤片：將載玻片放入37℃烤片機(jī)中烤1-2小時(shí)（或45℃烤30分鐘），使蠟帶完全粘在載玻片上。注意事項(xiàng)：溫水溫度需適宜（過(guò)高會(huì)導(dǎo)致組織變形，過(guò)低則蠟帶不展開(kāi)）；載玻片需干凈（可先用乙醇擦拭，再用蒸餾水沖洗，晾干后使用）；烤片時(shí)間需足夠（如烤片不充分，脫蠟時(shí)蠟帶易脫落）。（五）脫蠟與染色：顯示組織形態(tài)的關(guān)鍵1.脫蠟脫蠟是去除組織中的石蠟，使組織暴露，便于染色。流程：二甲苯（2次，各10分鐘）→100%乙醇（2次，各5分鐘）→95%乙醇（5分鐘）→80%乙醇（5分鐘）→70%乙醇（5分鐘）→蒸餾水（5分鐘）；判斷標(biāo)準(zhǔn)：脫蠟徹底的切片呈透明狀（無(wú)石蠟殘留）；注意事項(xiàng)：二甲苯時(shí)間需適度（過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致組織變脆），從二甲苯到乙醇需梯度進(jìn)行（避免組織收縮）。2.HE染色（最常用的形態(tài)學(xué)染色）HE染色的原理是蘇木精（堿性染料）染細(xì)胞核（藍(lán)色），伊紅（酸性染料）染細(xì)胞質(zhì)（紅色），可清晰顯示組織形態(tài)。流程：（1）蘇木精染色：將切片放入Harris蘇木精染液中5-10分鐘（年輕組織5分鐘，老年組織10分鐘）；（2）水洗：用自來(lái)水沖洗1分鐘，去除excess蘇木精；（3）分化：將切片放入1%鹽酸乙醇中1-2秒（分化的目的是去除細(xì)胞質(zhì)中的蘇木精，使細(xì)胞核染色更清晰；過(guò)度分化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞核染色淺，需顯微鏡下觀察調(diào)整）；（4）返藍(lán)：用50℃溫水沖洗1-2分鐘（或放入碳酸氫鈉溶液中），使細(xì)胞核呈深藍(lán)色（返藍(lán)不充分會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞核染色淺）；（5）伊紅染色：將切片放入0.5%水溶性伊紅染液中1-2分鐘（伊紅染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)染色過(guò)深，影響細(xì)胞核觀察）；（6）脫水透明：梯度乙醇脫水（70%→80%→90%→95%→100%，各1分鐘）→二甲苯透明（2次，各5分鐘）。關(guān)鍵注意：蘇木精染色時(shí)間需根據(jù)染液濃度調(diào)整（如染液老化，需延長(zhǎng)染色時(shí)間）；分化步驟是HE染色的核心（可通過(guò)顯微鏡觀察：細(xì)胞核呈深藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈淡紅色為宜）；伊紅染色后需徹底脫水（否則二甲苯透明時(shí)會(huì)出現(xiàn)云霧狀，影響切片透明度）。（六）封片與保存：長(zhǎng)期保存的關(guān)鍵1.封片封片是用封片劑將切片固定，防止切片氧化褪色。流程：（1）取1-2滴中性樹(shù)膠（或加拿大樹(shù)膠）滴在切片中央（樹(shù)膠量需適宜，過(guò)多會(huì)溢出，過(guò)少則蓋玻片粘不牢）；（2）用鑷子夾取蓋玻片，傾斜45°緩慢蓋上（避免氣泡；如出現(xiàn)氣泡，可輕輕按壓蓋玻片或用針挑破）；（3）將切片放在通風(fēng)處晾干（或放入37℃烤片機(jī)中烤30分鐘），使樹(shù)膠凝固。注意事項(xiàng)：中性樹(shù)膠需提前預(yù)熱（60℃恒溫箱中），避免有氣泡；蓋玻片需干凈（可先用乙醇擦拭，再用蒸餾水沖洗，晾干后使用）。2.保存封好的切片需存放在陰涼、干燥、避光的地方（如切片盒中），避免：陽(yáng)光直射（會(huì)導(dǎo)致染色褪色）；潮濕（會(huì)導(dǎo)致切片發(fā)霉）；高溫（會(huì)導(dǎo)致樹(shù)膠融化）。四、關(guān)鍵技術(shù)要點(diǎn)總結(jié)1.取材固定：新鮮組織需及時(shí)取材、固定，避免自溶；組織塊大小和厚度需適宜（1-2cm3，≤0.5cm）；2.脫水透明：梯度乙醇脫水需徹底（半透明狀），透明時(shí)間需適度（完全透明狀）；3.浸蠟包埋：浸蠟溫度（60℃）和時(shí)間（3次×1小時(shí)）需恒定，組織方向需準(zhǔn)確（切片面朝下）；4.切片貼片：切片厚度（4-6μm）需均勻，蠟塊溫度需適宜（冰袋冷卻）；貼片時(shí)溫水溫度（40-45℃）需合適，載玻片需防脫處理；5.染色封片：蘇木精染色時(shí)間（5-10分鐘）和分化時(shí)間（1-2秒）需調(diào)整，伊紅染色時(shí)間（1-2分鐘）需控制；封片時(shí)需避免氣泡，樹(shù)膠量需適宜。五、常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法常見(jiàn)問(wèn)題原因分析解決方法切片碎裂浸蠟不充分、蠟塊過(guò)硬延長(zhǎng)浸蠟時(shí)間（2小時(shí)/次）；用冰袋冷卻蠟塊10-15分鐘切片褶皺貼片時(shí)溫水溫度過(guò)低提高溫水溫度（45℃左右）；重新展開(kāi)蠟帶切片脫落載玻片未做防脫處理使用多聚賴氨酸或APES處理載玻片染色不均脫蠟不徹底延長(zhǎng)二甲苯脫蠟時(shí)間（各15分鐘）細(xì)胞核染色淺分化過(guò)度縮短鹽酸乙醇分化時(shí)間（1秒）細(xì)胞質(zhì)染色深伊紅染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)縮短伊紅染色時(shí)間（30秒-1分鐘）切片有氣泡包埋時(shí)混入氣泡包埋時(shí)輕輕晃動(dòng)包埋盒，排出氣泡切片透明度差脫水不徹底延長(zhǎng)100%乙醇脫水時(shí)間（各1.5小時(shí)）六、結(jié)論石蠟切片技術(shù)是組織學(xué)研究的基礎(chǔ)，其質(zhì)量直接影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。掌握標(biāo)準(zhǔn)化操