Ⅰ型單純皰疹病毒糖蛋白G表達(dá)與初步純化技術(shù)探究一、引言1.1研究背景與意義單純皰疹病毒（HerpesSimplexVirus，HSV）是一類對(duì)人類健康具有顯著威脅的病原體，其可分為Ⅰ型單純皰疹病毒（HSV-1）和Ⅱ型單純皰疹病毒（HSV-2）。HSV-1主要通過(guò)密切接觸傳播，如接吻、共用餐具等，常引發(fā)口唇皰疹、齦口炎、皰疹性角膜炎以及較為罕見(jiàn)但嚴(yán)重的皰疹性腦炎等疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球范圍內(nèi)HSV-1的感染率相當(dāng)高，大量人群在一生中至少感染過(guò)一次HSV-1。在一些地區(qū)，成年人血清中HSV-1抗體陽(yáng)性率高達(dá)85%以上，某些國(guó)家和地區(qū)甚至接近100%。HSV-1感染不僅會(huì)給患者帶來(lái)身體上的不適，如口唇部的疼痛性水皰、眼部的刺激與視力損害，嚴(yán)重的皰疹性腦炎還可能導(dǎo)致永久性神經(jīng)損傷甚至死亡。對(duì)于免疫功能低下的人群，如艾滋病患者、器官移植受者以及新生兒等，HSV-1感染可能引發(fā)更為嚴(yán)重的并發(fā)癥，病情往往難以控制，預(yù)后較差。此外，孕婦感染HSV-1還可能對(duì)胎兒造成不良影響，如導(dǎo)致胎兒畸形、流產(chǎn)、早產(chǎn)等。準(zhǔn)確檢測(cè)HSV-1在臨床診斷、疾病防控以及患者治療管理等方面都具有至關(guān)重要的意義。及時(shí)準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果能夠幫助醫(yī)生快速確診疾病，為患者制定個(gè)性化的治療方案，避免延誤病情。通過(guò)檢測(cè)還能有效監(jiān)測(cè)病毒的傳播途徑和范圍，為公共衛(wèi)生防控措施的制定提供科學(xué)依據(jù)。然而，目前臨床上用于檢測(cè)HSV-1的方法存在諸多局限性。病毒分離培養(yǎng)作為傳統(tǒng)的“金標(biāo)準(zhǔn)”檢測(cè)方法，雖然結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但存在操作繁瑣、細(xì)胞培養(yǎng)周期長(zhǎng)（通常需要數(shù)天至數(shù)周）的問(wèn)題，且對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和技術(shù)要求較高，難以在臨床快速診斷中廣泛應(yīng)用。血清學(xué)檢測(cè)方法，如檢測(cè)病原體特異性IgM抗體和IgG抗體，雖操作相對(duì)簡(jiǎn)便，但也存在明顯缺陷。IgM抗體檢測(cè)的假陽(yáng)性率較高，其他感染或免疫反應(yīng)可能導(dǎo)致IgM水平升高，從而出現(xiàn)誤診；IgG抗體檢測(cè)則無(wú)法區(qū)分近期感染與既往感染，對(duì)于判斷疾病的活動(dòng)性和指導(dǎo)治療的價(jià)值有限。HSV-1糖蛋白G（gG）作為一種重要的病毒表面蛋白，在病毒的感染、傳播以及免疫識(shí)別過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。gG具有高度免疫原性，當(dāng)機(jī)體感染HSV-1后，免疫系統(tǒng)會(huì)針對(duì)gG產(chǎn)生特異性抗體。這一特性使得gG在HSV-1的檢測(cè)和診斷領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力，通過(guò)檢測(cè)針對(duì)gG的抗體，能夠更準(zhǔn)確地判斷機(jī)體是否感染HSV-1以及感染的狀態(tài)。gG在疫苗研發(fā)方面也展現(xiàn)出重要價(jià)值，以gG為基礎(chǔ)研發(fā)的疫苗，有望誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，從而預(yù)防HSV-1的感染和復(fù)發(fā)。對(duì)HSV-1糖蛋白G進(jìn)行表達(dá)及初步純化的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。通過(guò)深入研究gG的表達(dá)和純化技術(shù)，能夠獲得高純度的gG蛋白，這將為開發(fā)更為準(zhǔn)確、靈敏的HSV-1檢測(cè)方法提供優(yōu)質(zhì)的抗原，有助于提高臨床檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性，減少誤診和漏診的發(fā)生。高純度的gG蛋白還能為基于gG的新型診斷試劑和疫苗的研發(fā)奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，推動(dòng)相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)進(jìn)步，為有效防控HSV-1感染提供新的手段和策略，最終降低HSV-1感染對(duì)人類健康的危害，改善患者的生活質(zhì)量。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在HSV-1糖蛋白G的研究領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外眾多科研團(tuán)隊(duì)已取得了一系列具有重要價(jià)值的成果。國(guó)外方面，早在20世紀(jì)90年代，就有研究聚焦于gG的基因序列解析，精準(zhǔn)確定了其在HSV-1基因組中的位置和核苷酸序列，為后續(xù)的蛋白表達(dá)和功能研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。隨著時(shí)間的推移，對(duì)于gG在病毒感染過(guò)程中作用機(jī)制的研究逐漸深入。有研究發(fā)現(xiàn)，gG能夠與宿主細(xì)胞表面的特定受體相互作用，從而介導(dǎo)病毒的吸附和侵入過(guò)程，這一發(fā)現(xiàn)揭示了HSV-1感染的關(guān)鍵起始步驟，為開發(fā)針對(duì)gG的抗病毒藥物提供了潛在的靶點(diǎn)。在gG的表達(dá)和純化技術(shù)方面，國(guó)外也進(jìn)行了大量的探索。通過(guò)不斷優(yōu)化表達(dá)系統(tǒng)，如采用不同的原核表達(dá)菌株和真核表達(dá)細(xì)胞系，以及改進(jìn)純化方法，如親和層析、離子交換層析等技術(shù)的組合應(yīng)用，成功獲得了高純度的gG蛋白，并將其應(yīng)用于免疫診斷試劑的研發(fā)，顯著提高了HSV-1檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度。在疫苗研發(fā)領(lǐng)域，以gG為基礎(chǔ)的亞單位疫苗研究也取得了一定進(jìn)展，部分疫苗在動(dòng)物模型中展現(xiàn)出了良好的免疫原性和保護(hù)效果，為人類HSV-1疫苗的開發(fā)帶來(lái)了新的希望。國(guó)內(nèi)的相關(guān)研究起步相對(duì)較晚，但近年來(lái)發(fā)展迅速。國(guó)內(nèi)科研人員在借鑒國(guó)外研究成果的基礎(chǔ)上，結(jié)合自身的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，在gG的克隆表達(dá)方面取得了顯著成果。通過(guò)對(duì)不同表達(dá)載體和宿主細(xì)胞的篩選與優(yōu)化，建立了高效穩(wěn)定的gG表達(dá)體系，實(shí)現(xiàn)了gG蛋白的大量表達(dá)。在純化工藝方面，國(guó)內(nèi)研究團(tuán)隊(duì)也進(jìn)行了深入研究，開發(fā)出了一系列適合國(guó)內(nèi)實(shí)際情況的純化方法，降低了生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率。在應(yīng)用研究方面，國(guó)內(nèi)學(xué)者利用表達(dá)和純化的gG蛋白，開展了多種新型檢測(cè)方法的研究，如基于化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的HSV-1檢測(cè)試劑盒的研發(fā)，這些方法在臨床樣本檢測(cè)中表現(xiàn)出了良好的性能，為HSV-1的早期診斷提供了有力的技術(shù)支持。國(guó)內(nèi)還在gG的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究方面取得了新的突破，發(fā)現(xiàn)gG能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答，促進(jìn)免疫細(xì)胞的活化和增殖，這一發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步理解HSV-1的致病機(jī)制和免疫逃逸機(jī)制提供了新的視角。盡管國(guó)內(nèi)外在HSV-1糖蛋白G的研究上取得了諸多成果，但仍存在一些不足之處。目前的研究主要集中在gG的結(jié)構(gòu)與功能、表達(dá)與純化以及在診斷和疫苗開發(fā)中的應(yīng)用等方面，對(duì)于gG在病毒潛伏感染和復(fù)發(fā)機(jī)制中的作用研究相對(duì)較少，這限制了對(duì)HSV-1感染全過(guò)程的深入理解。在gG的表達(dá)和純化過(guò)程中，仍存在表達(dá)量不穩(wěn)定、純化步驟繁瑣、成本較高等問(wèn)題，這些問(wèn)題制約了gG蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)有的基于gG的診斷試劑和疫苗在臨床應(yīng)用中還存在一定的局限性，如診斷試劑的靈敏度和特異性有待進(jìn)一步提高，疫苗的保護(hù)效果還不夠理想，需要進(jìn)一步優(yōu)化和改進(jìn)。本文正是基于當(dāng)前研究的這些不足，以優(yōu)化HSV-1糖蛋白G的表達(dá)及初步純化工藝為切入點(diǎn)，旨在通過(guò)對(duì)表達(dá)載體、宿主細(xì)胞以及純化方法的深入研究和優(yōu)化，建立一種高效、穩(wěn)定、低成本的gG蛋白表達(dá)和純化體系，為后續(xù)的診斷試劑研發(fā)、疫苗開發(fā)以及病毒致病機(jī)制研究提供高質(zhì)量的gG蛋白，推動(dòng)HSV-1相關(guān)研究的進(jìn)一步發(fā)展。二、Ⅰ型單純皰疹病毒及糖蛋白G概述2.1Ⅰ型單純皰疹病毒（HSV-1）Ⅰ型單純皰疹病毒（HSV-1）隸屬皰疹病毒科、單純皰疹病毒屬，是一種雙鏈DNA病毒。其病毒粒子呈二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，直徑約為150-200納米，由核心、衣殼、被膜和包膜構(gòu)成。核心部分包含線性雙鏈DNA，基因組長(zhǎng)約152kb，編碼著超過(guò)80種蛋白質(zhì)，這些基因產(chǎn)物在病毒的復(fù)制、組裝、感染以及與宿主細(xì)胞的相互作用等過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用。衣殼由162個(gè)殼粒組成，呈二十面體對(duì)稱排列，為病毒的遺傳物質(zhì)提供了堅(jiān)實(shí)的保護(hù)。被膜位于衣殼和包膜之間，含有多種病毒蛋白，參與病毒的組裝和成熟過(guò)程。包膜則來(lái)源于宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜，其上鑲嵌著多種糖蛋白，如糖蛋白B（gB）、糖蛋白C（gC）、糖蛋白D（gD）、糖蛋白E（gE）和糖蛋白G（gG）等，這些糖蛋白在病毒的吸附、侵入宿主細(xì)胞以及免疫逃逸等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。HSV-1主要通過(guò)密切接觸傳播，如接吻、共用餐具、毛巾等個(gè)人物品，也可通過(guò)呼吸道飛沫傳播。病毒具有嗜神經(jīng)性，感染人體后，首先在皮膚或黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，引起局部的炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為皰疹、潰瘍等癥狀。隨后，病毒會(huì)沿著神經(jīng)軸突逆行進(jìn)入神經(jīng)節(jié)，如三叉神經(jīng)節(jié)、頸上神經(jīng)節(jié)等，并在神經(jīng)節(jié)內(nèi)潛伏下來(lái)。當(dāng)機(jī)體受到某些因素的刺激，如發(fā)熱、受涼、勞累、精神壓力、免疫系統(tǒng)受損等，潛伏的病毒會(huì)被激活，重新沿神經(jīng)纖維下行至皮膚或黏膜表面，引發(fā)皰疹的復(fù)發(fā)。HSV-1對(duì)人體組織具有廣泛的侵犯性，可累及口腔、口唇、眼部、皮膚、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多個(gè)部位。在口腔和口唇部位，常引發(fā)口唇皰疹和齦口炎，表現(xiàn)為口唇周圍出現(xiàn)成簇的小水皰，水皰破潰后形成潰瘍，伴有疼痛、灼熱感，嚴(yán)重時(shí)可影響進(jìn)食和說(shuō)話。眼部感染HSV-1可導(dǎo)致皰疹性角膜炎，出現(xiàn)眼紅、疼痛、畏光、流淚、視力下降等癥狀，若不及時(shí)治療，可能會(huì)導(dǎo)致角膜潰瘍、穿孔，甚至失明。皮膚感染HSV-1可引起皰疹性濕疹、皰疹性皮炎等，表現(xiàn)為皮膚出現(xiàn)紅斑、水皰、糜爛等。HSV-1感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)則可引發(fā)皰疹性腦炎，這是一種嚴(yán)重的疾病，雖然發(fā)病率相對(duì)較低，但病情兇險(xiǎn)，死亡率高，幸存者也常遺留嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，如智力障礙、癲癇、偏癱等。由于HSV-1感染引發(fā)的癥狀多樣，且部分癥狀與其他疾病相似，給臨床診斷帶來(lái)了一定的挑戰(zhàn)。例如，口唇皰疹需與口腔潰瘍、口角炎等疾病相鑒別；皰疹性角膜炎需與其他病原體引起的角膜炎相區(qū)分；皰疹性腦炎的癥狀與其他類型的腦炎也有相似之處，容易造成誤診。因此，準(zhǔn)確、快速的實(shí)驗(yàn)室診斷方法對(duì)于HSV-1感染的確診和治療至關(guān)重要。2.2糖蛋白G的結(jié)構(gòu)與功能HSV-1糖蛋白G（gG）是由病毒基因編碼合成的一種糖蛋白，在病毒的感染過(guò)程和免疫反應(yīng)中扮演著重要角色。從分子結(jié)構(gòu)上看，gG的氨基酸序列具有獨(dú)特的特征。其氨基酸殘基數(shù)在不同的研究報(bào)道中略有差異，但大致范圍在550-600個(gè)左右。通過(guò)對(duì)gG基因序列的分析可知，其開放閱讀框編碼的蛋白質(zhì)包含多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域。在gG的N端，存在一段信號(hào)肽序列，長(zhǎng)度約為15-30個(gè)氨基酸，這段信號(hào)肽在gG的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它能夠引導(dǎo)gG前體蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)行后續(xù)的修飾和加工。gG分子中還含有多個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)和O-糖基化位點(diǎn)。N-糖基化位點(diǎn)通常符合Asn-X-Thr/Ser（X代表除脯氨酸以外的任意氨基酸）的序列特征，gG中大約有5-8個(gè)這樣的N-糖基化位點(diǎn)。O-糖基化位點(diǎn)則主要位于富含絲氨酸（Ser）和蘇氨酸（Thr）的區(qū)域，數(shù)量較多，約為10-15個(gè)。糖基化修飾對(duì)gG的結(jié)構(gòu)和功能具有重要影響，一方面，糖基化可以增加gG的穩(wěn)定性，保護(hù)其免受蛋白酶的降解；另一方面，糖基化修飾還能夠影響gG與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合能力以及其免疫原性。gG在HSV-1感染宿主細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的功能。gG參與了病毒對(duì)宿主細(xì)胞的吸附過(guò)程。研究表明，gG能夠與宿主細(xì)胞表面的特定受體結(jié)合，從而介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的初始接觸。具體來(lái)說(shuō)，gG可以與宿主細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）結(jié)合，HSPG是一種廣泛存在于細(xì)胞表面的糖蛋白，其糖鏈部分含有大量的硫酸乙酰肝素基團(tuán)，gG通過(guò)與這些基團(tuán)的特異性相互作用，實(shí)現(xiàn)病毒在宿主細(xì)胞表面的吸附。這種吸附作用是病毒感染的第一步，為后續(xù)的病毒侵入和感染奠定了基礎(chǔ)。gG在病毒的免疫逃逸過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。HSV-1感染宿主后，宿主的免疫系統(tǒng)會(huì)啟動(dòng)免疫應(yīng)答來(lái)清除病毒。然而，gG能夠通過(guò)多種機(jī)制干擾宿主的免疫反應(yīng)，幫助病毒實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。gG可以抑制補(bǔ)體系統(tǒng)的激活，補(bǔ)體系統(tǒng)是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，能夠通過(guò)一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，對(duì)病原體進(jìn)行殺傷和清除。gG能夠與補(bǔ)體系統(tǒng)中的某些關(guān)鍵成分結(jié)合，阻斷補(bǔ)體激活的經(jīng)典途徑和旁路途徑，從而使病毒免受補(bǔ)體的攻擊。gG還能夠影響免疫細(xì)胞的功能，如抑制T細(xì)胞的活化和增殖，減少細(xì)胞因子的分泌，降低機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，使得病毒能夠在宿主體內(nèi)持續(xù)存在和復(fù)制。gG具有高度的型特異性，這一特性使其成為型特異性血清學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)抗原的重要依據(jù)。HSV-1和HSV-2的gG在氨基酸序列上存在顯著差異，兩者的同源性僅為30%-40%。這種差異導(dǎo)致它們?cè)诳乖砦簧弦泊嬖诿黠@的不同，針對(duì)HSV-1gG產(chǎn)生的抗體幾乎不會(huì)與HSV-2gG發(fā)生交叉反應(yīng)，反之亦然。利用這一特性，在血清學(xué)診斷中，通過(guò)檢測(cè)血清中針對(duì)HSV-1gG的特異性抗體，能夠準(zhǔn)確地區(qū)分HSV-1感染和HSV-2感染，大大提高了診斷的準(zhǔn)確性和特異性，為臨床診斷和治療提供了可靠的依據(jù)。三、糖蛋白G表達(dá)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料菌株與質(zhì)粒：大腸桿菌BL21（DE3）購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，該菌株遺傳背景清晰，具有高效表達(dá)外源蛋白的能力，常被廣泛應(yīng)用于原核表達(dá)系統(tǒng)中。含目的基因的工程菌為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建保存，其構(gòu)建過(guò)程包括從HSV-1病毒基因組中擴(kuò)增出糖蛋白G基因，將其克隆至合適的表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，最終獲得了能夠表達(dá)HSV-1糖蛋白G的工程菌。PBV220-HSV-1-gG質(zhì)粒同樣由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存，PBV220是一種常用的原核表達(dá)載體，具有溫度誘導(dǎo)表達(dá)的特性，在較低溫度下，質(zhì)粒處于低拷貝狀態(tài)，當(dāng)溫度升高至42℃時(shí)，可啟動(dòng)目的基因的高效表達(dá)。將HSV-1糖蛋白G基因插入PBV220載體中，使其在大腸桿菌中能夠在溫度誘導(dǎo)下表達(dá)糖蛋白G。試劑：氨芐青霉素（Ampicillin）購(gòu)自Sigma公司，它是一種廣譜抗生素，能夠抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，在本實(shí)驗(yàn)中用于篩選含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌，只有成功轉(zhuǎn)化了攜帶氨芐青霉素抗性基因的PBV220-HSV-1-gG質(zhì)粒的大腸桿菌才能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。PCR試劑（包括TaqDNA聚合酶、dNTPs、10×PCRBuffer等）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，這些試劑是PCR擴(kuò)增反應(yīng)的關(guān)鍵組成部分，TaqDNA聚合酶具有高效的DNA合成能力，能夠在引物的引導(dǎo)下，以模板DNA為基礎(chǔ)，合成新的DNA鏈；dNTPs為PCR反應(yīng)提供了合成DNA所需的原料；10×PCRBuffer則為反應(yīng)提供了合適的緩沖環(huán)境，保證酶的活性和反應(yīng)的順利進(jìn)行。限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ購(gòu)自NEB公司，這兩種限制性內(nèi)切酶能夠特異性地識(shí)別DNA序列中的特定位點(diǎn)，并在該位點(diǎn)切割DNA，在本實(shí)驗(yàn)中用于對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，通過(guò)酶切后的片段大小來(lái)判斷目的基因是否正確插入到質(zhì)粒中。DNAMarker購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，它包含了一系列已知大小的DNA片段，在瓊脂糖凝膠電泳中作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，用于判斷PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物的大小。蛋白Marker購(gòu)自ThermoFisherScientific公司，同樣作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，用于在SDS-PAGE電泳中判斷蛋白質(zhì)的分子量大小，以便確定表達(dá)的糖蛋白G是否正確。IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，它是一種乳糖類似物，能夠誘導(dǎo)原核表達(dá)系統(tǒng)中乳糖操縱子的表達(dá)，在本實(shí)驗(yàn)中用于誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)重組糖蛋白G。儀器：PCR儀為Bio-Rad公司的T100ThermalCycler，該儀器具有精確的溫度控制能力，能夠快速、準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)所需的變性、退火和延伸三個(gè)溫度步驟，保證PCR擴(kuò)增的效率和特異性。高速冷凍離心機(jī)為Eppendorf公司的5424R型，它能夠在低溫條件下對(duì)樣品進(jìn)行高速離心，可用于收集細(xì)菌菌體、分離蛋白質(zhì)等操作，低溫環(huán)境能夠有效避免蛋白質(zhì)的變性和降解。恒溫?fù)u床為上海智城分析儀器制造有限公司的ZQZY-100型，能夠?yàn)榧?xì)菌培養(yǎng)提供恒定的溫度和振蕩條件，使細(xì)菌在培養(yǎng)過(guò)程中能夠充分接觸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，保證細(xì)菌的正常生長(zhǎng)和代謝。電泳儀為Bio-Rad公司的PowerPacBasic型，可提供穩(wěn)定的電場(chǎng)，用于核酸和蛋白質(zhì)的電泳分離。凝膠成像系統(tǒng)為上海天能科技有限公司的Tanon5200型，能夠?qū)﹄娪竞蟮哪z進(jìn)行成像和分析，通過(guò)檢測(cè)凝膠上DNA或蛋白質(zhì)條帶的亮度和位置，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行定量和定性分析。3.2表達(dá)方法3.2.1質(zhì)粒提取與轉(zhuǎn)化從實(shí)驗(yàn)室保存的工程菌PBV220-HSV-1-gG/E.coliBL21中重新提取質(zhì)粒，采用經(jīng)典的堿裂解法。將保存的工程菌接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，使細(xì)菌充分生長(zhǎng)繁殖。取適量過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6-0.8，此時(shí)細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞代謝活躍，質(zhì)?？截悢?shù)較高。將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、5000g離心10分鐘，收集菌體沉淀。向沉淀中加入適量預(yù)冷的溶液Ⅰ（含葡萄糖、Tris-HCl和EDTA），充分懸浮菌體，使細(xì)胞處于等滲環(huán)境，維持細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定。加入等體積的溶液Ⅱ（含NaOH和SDS），輕柔顛倒混勻，室溫放置3-5分鐘，使細(xì)胞裂解，釋放出質(zhì)粒DNA和染色體DNA等物質(zhì)，其中SDS能夠破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，NaOH則使DNA變性。迅速加入等體積預(yù)冷的溶液Ⅲ（含醋酸鉀和冰醋酸），輕柔顛倒混勻，冰浴10分鐘，此時(shí)溶液中的鉀離子與SDS結(jié)合形成不溶性沉淀，同時(shí)使變性的質(zhì)粒DNA復(fù)性，而染色體DNA和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)則與SDS-鉀鹽共沉淀。4℃、12000g離心15分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，其中含有質(zhì)粒DNA。向上清中加入2倍體積的無(wú)水乙醇，混勻后室溫放置5-10分鐘，使質(zhì)粒DNA沉淀析出，然后4℃、12000g離心10分鐘，棄上清。用70%乙醇洗滌沉淀2-3次，去除殘留的鹽離子等雜質(zhì)，最后將沉淀晾干，加入適量的TE緩沖液（含Tris-HCl和EDTA）溶解質(zhì)粒DNA，得到高純度的PBV220-HSV-1-gG質(zhì)粒。制備感受態(tài)細(xì)胞采用CaCl?法。從LB平板上挑取新鮮的大腸桿菌BL21單菌落，接種于5mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取1ml過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至100mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃劇烈振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.3-0.4，此時(shí)細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期，細(xì)胞生理狀態(tài)適合轉(zhuǎn)化。將培養(yǎng)物迅速置于冰上冷卻10-15分鐘，使細(xì)胞代謝活動(dòng)減緩，細(xì)胞膜流動(dòng)性降低。將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管中，4℃、4000g離心10分鐘，收集菌體沉淀。棄上清，用10ml預(yù)冷的0.1mol/LCaCl?溶液輕輕懸浮沉淀，冰浴30分鐘，使Ca2?與細(xì)胞膜結(jié)合，增加細(xì)胞膜的通透性。4℃、4000g離心10分鐘，棄上清，再用2ml預(yù)冷的0.1mol/LCaCl?溶液懸浮沉淀，即為感受態(tài)細(xì)胞，可立即使用或分裝后置于-80℃保存。將提取的PBV220-HSV-1-gG質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至制備好的感受態(tài)細(xì)胞中。取100μl感受態(tài)細(xì)胞，加入1-5μl質(zhì)粒DNA，輕輕混勻，冰浴30分鐘，使質(zhì)粒DNA與感受態(tài)細(xì)胞充分接觸。將離心管置于42℃水浴中熱激90秒，迅速促進(jìn)細(xì)胞膜對(duì)質(zhì)粒DNA的攝取，然后立即冰浴2-3分鐘，使細(xì)胞膜恢復(fù)穩(wěn)定。向離心管中加入800μl不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃、150rpm振蕩培養(yǎng)45-60分鐘，使轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞復(fù)蘇并表達(dá)質(zhì)粒上的抗性基因。取適量培養(yǎng)物涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16小時(shí)，篩選出轉(zhuǎn)化成功的菌落。通過(guò)PCR和雙酶切鑒定轉(zhuǎn)化是否成功。PCR鑒定時(shí)，根據(jù)HSV-1-gG基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物的5'端和3'端分別與目的基因兩端的序列互補(bǔ)，且在引物的5'端引入合適的酶切位點(diǎn)，以便后續(xù)的雙酶切鑒定。以轉(zhuǎn)化后的菌落為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系包括模板DNA、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和10×PCRBuffer。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘，使模板DNA完全變性；然后進(jìn)行30-35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性30秒，使DNA雙鏈解開；55-60℃退火30秒，引物與模板DNA互補(bǔ)配對(duì)；72℃延伸1-2分鐘，在TaqDNA聚合酶的作用下，合成新的DNA鏈；最后72℃延伸10分鐘，使擴(kuò)增產(chǎn)物充分延伸。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5-10μl擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察是否出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶，若出現(xiàn)，則初步證明轉(zhuǎn)化成功。雙酶切鑒定時(shí)，將PCR鑒定為陽(yáng)性的菌落提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，這兩種酶能夠識(shí)別PBV220載體和HSV-1-gG基因上特定的酶切位點(diǎn)，并在該位點(diǎn)切割DNA。酶切反應(yīng)體系包括質(zhì)粒DNA、BamHⅠ、HindⅢ、10×Buffer和ddH?O，37℃水浴反應(yīng)2-3小時(shí)。酶切結(jié)束后，取酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察是否出現(xiàn)兩條與預(yù)期大小相符的條帶，一條為PBV220載體片段，另一條為HSV-1-gG基因片段，若出現(xiàn)，則進(jìn)一步證明轉(zhuǎn)化成功。通過(guò)PCR和雙酶切鑒定，能夠準(zhǔn)確判斷質(zhì)粒是否成功轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，以及目的基因是否正確插入到質(zhì)粒載體中，為后續(xù)的蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)提供可靠的保障。3.2.2搖瓶培養(yǎng)與溫控誘導(dǎo)表達(dá)利用工程菌的氨芐青霉素抗性進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)。將轉(zhuǎn)化成功的單菌落接種于含有5mlLB液體培養(yǎng)基（含100μg/ml氨芐青霉素）的試管中，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，使細(xì)菌適應(yīng)培養(yǎng)基環(huán)境并開始生長(zhǎng)繁殖。次日，取1ml過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至含有100mlLB液體培養(yǎng)基（含100μg/ml氨芐青霉素）的500ml三角瓶中，繼續(xù)37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中，定期（每1-2小時(shí)）測(cè)定菌液的OD600值，以監(jiān)測(cè)細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。當(dāng)OD600值達(dá)到0.6-0.8時(shí)，表明細(xì)菌已進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)細(xì)胞代謝旺盛，適合進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。溫控誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白HSV-1-gG。PBV220載體是一種溫度誘導(dǎo)型表達(dá)載體，其啟動(dòng)子在較低溫度（30℃）下受到抑制，目的基因表達(dá)水平較低；當(dāng)溫度升高至42℃時(shí)，啟動(dòng)子被激活，目的基因開始高效表達(dá)。在菌液OD600值達(dá)到0.6-0.8后，將搖瓶迅速轉(zhuǎn)移至42℃恒溫?fù)u床中，220rpm繼續(xù)振蕩培養(yǎng)。誘導(dǎo)時(shí)間根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定為4-6小時(shí)，在此時(shí)間范圍內(nèi)，目的蛋白的表達(dá)量較高且蛋白穩(wěn)定性較好。誘導(dǎo)過(guò)程中，每隔1小時(shí)取1ml菌液，12000g離心1分鐘，收集菌體沉淀，用于后續(xù)的蛋白表達(dá)分析。選擇42℃作為誘導(dǎo)溫度是因?yàn)樵谠摐囟认?，PBV220載體的啟動(dòng)子能夠被充分激活，從而啟動(dòng)目的基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，實(shí)現(xiàn)重組蛋白的高效表達(dá)。同時(shí)，42℃也是大腸桿菌能夠耐受的較高溫度，在短時(shí)間內(nèi)不會(huì)對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)和代謝造成嚴(yán)重影響。誘導(dǎo)時(shí)間選擇4-6小時(shí)是經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)摸索確定的。在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中，分別設(shè)置了不同的誘導(dǎo)時(shí)間（2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)、5小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)），通過(guò)SDS-PAGE電泳分析目的蛋白的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)時(shí)間為2-3小時(shí)時(shí)，目的蛋白表達(dá)量較低；誘導(dǎo)時(shí)間為4-6小時(shí)時(shí)，目的蛋白表達(dá)量逐漸增加并達(dá)到較高水平；誘導(dǎo)時(shí)間超過(guò)6小時(shí)后，目的蛋白表達(dá)量不再明顯增加，且由于長(zhǎng)時(shí)間高溫培養(yǎng)，細(xì)菌開始出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制和蛋白降解現(xiàn)象。因此，綜合考慮目的蛋白表達(dá)量和細(xì)菌生長(zhǎng)情況，選擇4-6小時(shí)作為最佳誘導(dǎo)時(shí)間。3.2.3表達(dá)產(chǎn)物鑒定-WesternblottingWesternblotting實(shí)驗(yàn)鑒定表達(dá)產(chǎn)物的原理基于抗原-抗體特異性結(jié)合。蛋白質(zhì)樣品經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳分離后，不同分子量的蛋白質(zhì)在凝膠上形成不同的條帶。通過(guò)轉(zhuǎn)膜技術(shù)，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜（如PVDF膜或硝酸纖維素膜）上，使蛋白質(zhì)固定在膜上。然后用封閉液（如5%脫脂牛奶或3%BSA）封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，防止后續(xù)抗體的非特異性吸附。接著將膜與特異性識(shí)別目的蛋白的一抗孵育，一抗與目的蛋白上的抗原表位特異性結(jié)合。洗膜去除未結(jié)合的一抗后，再與標(biāo)記有酶（如辣根過(guò)氧化物酶，HRP）或熒光基團(tuán)的二抗孵育，二抗與一抗特異性結(jié)合。最后加入相應(yīng)的底物（如化學(xué)發(fā)光底物或顯色底物），在酶的催化作用下，底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)（如化學(xué)發(fā)光信號(hào)或顯色信號(hào)），從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目的蛋白的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)步驟如下：蛋白樣品制備：將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液12000g離心1分鐘，收集菌體沉淀。向沉淀中加入適量的細(xì)菌裂解液（如含蛋白酶抑制劑的PBS緩沖液），充分懸浮菌體，然后進(jìn)行超聲破碎。超聲條件設(shè)置為功率200-300W，超聲3秒，間隔5秒，共超聲10-15分鐘，使細(xì)菌細(xì)胞充分裂解，釋放出細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。超聲破碎后，12000g離心15分鐘，取上清作為蛋白樣品。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白樣品的濃度，按照試劑盒說(shuō)明書操作，將蛋白樣品稀釋至合適濃度，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。電泳：根據(jù)目的蛋白的分子量大小，選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳。一般來(lái)說(shuō)，目的蛋白分子量在20-50kDa時(shí)，分離膠濃度選擇12%；分子量在50-100kDa時(shí)，分離膠濃度選擇10%；分子量大于100kDa時(shí)，分離膠濃度選擇8%。濃縮膠濃度均為5%。將制備好的蛋白樣品與上樣緩沖液（含SDS、β-巰基乙醇、溴酚藍(lán)等）按一定比例混合，100℃煮沸5分鐘，使蛋白質(zhì)變性。取適量變性后的蛋白樣品加入到凝膠加樣孔中，同時(shí)加入蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。電泳時(shí)，先在80V電壓下電泳30分鐘，使蛋白樣品在濃縮膠中充分濃縮；然后將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部，結(jié)束電泳。轉(zhuǎn)膜：電泳結(jié)束后，將凝膠從電泳槽中取出，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液（含Tris、甘氨酸、甲醇等）中浸泡10-15分鐘，使凝膠充分浸潤(rùn)。準(zhǔn)備PVDF膜和濾紙，將PVDF膜在甲醇中浸泡1-2分鐘進(jìn)行活化，然后放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡10分鐘；濾紙也在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡備用。按照“負(fù)極-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-正極”的順序組裝轉(zhuǎn)膜裝置，確保各層之間緊密貼合，無(wú)氣泡產(chǎn)生。轉(zhuǎn)膜條件為恒流200mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間根據(jù)目的蛋白分子量大小確定，一般分子量小于100kDa的蛋白，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為1-2小時(shí)；分子量大100kDa的蛋白，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為2-3小時(shí)。轉(zhuǎn)膜過(guò)程中需在冰浴中進(jìn)行，以防止轉(zhuǎn)膜過(guò)程中產(chǎn)生的熱量導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。抗體孵育：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜從轉(zhuǎn)膜裝置中取出，放入封閉液中，室溫下?lián)u床振蕩封閉1-2小時(shí)，封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，將膜放入一抗稀釋液（用封閉液按一定比例稀釋特異性識(shí)別HSV-1-gG的一抗）中，4℃孵育過(guò)夜，使一抗與目的蛋白充分結(jié)合。次日，將膜從一抗稀釋液中取出，用TBST緩沖液（含Tris、NaCl、Tween-20）洗滌3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的一抗。然后將膜放入二抗稀釋液（用封閉液按一定比例稀釋標(biāo)記有HRP的二抗）中，室溫下?lián)u床振蕩孵育1-2小時(shí)，使二抗與一抗結(jié)合。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的二抗。顯色：將洗滌后的PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光底物（如ECL試劑）中，室溫下反應(yīng)1-2分鐘，使底物與HRP發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)。將膜放入凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行曝光和成像，在成像結(jié)果中，若在與目的蛋白分子量對(duì)應(yīng)的位置出現(xiàn)明顯的條帶，則表明目的蛋白成功表達(dá)。通過(guò)Westernblotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷目的蛋白的表達(dá)情況。如果在預(yù)期分子量位置出現(xiàn)特異性條帶，且條帶清晰、明亮，說(shuō)明目的蛋白成功表達(dá)且表達(dá)量較高；若條帶較弱或不明顯，可能是目的蛋白表達(dá)量較低，需要進(jìn)一步優(yōu)化表達(dá)條件，如調(diào)整誘導(dǎo)溫度、時(shí)間、IPTG濃度等；若未出現(xiàn)條帶，則可能是目的蛋白未表達(dá)，需要檢查實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程是否存在問(wèn)題，如質(zhì)粒轉(zhuǎn)化是否成功、誘導(dǎo)表達(dá)條件是否合適等，或者目的蛋白可能發(fā)生了降解，需要在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中加強(qiáng)對(duì)蛋白的保護(hù)，如加入蛋白酶抑制劑、在低溫下操作等。四、糖蛋白G表達(dá)條件優(yōu)化4.1發(fā)酵條件優(yōu)化4.1.1培養(yǎng)基成分優(yōu)化培養(yǎng)基成分對(duì)工程菌的生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)起著關(guān)鍵作用，不同的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等成分會(huì)顯著影響工程菌的代謝途徑和蛋白合成能力。為了確定最佳培養(yǎng)基成分，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了一系列對(duì)比研究。首先，考察不同碳源對(duì)工程菌生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)的影響。分別選用葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘油等作為單一碳源，配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其他成分保持一致。將工程菌接種于各培養(yǎng)基中，在相同條件下進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，定期測(cè)定菌液的OD600值以監(jiān)測(cè)工程菌的生長(zhǎng)情況，誘導(dǎo)表達(dá)后通過(guò)SDS-PAGE電泳分析蛋白表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以葡萄糖為碳源時(shí)，工程菌生長(zhǎng)速度較快，在培養(yǎng)初期，菌液OD600值增長(zhǎng)迅速，在誘導(dǎo)表達(dá)后，蛋白表達(dá)量也相對(duì)較高，在SDS-PAGE膠上出現(xiàn)明顯的目的蛋白條帶；以蔗糖為碳源時(shí)，工程菌生長(zhǎng)較為緩慢，在培養(yǎng)前期，OD600值上升緩慢，蛋白表達(dá)量較低，目的蛋白條帶較淺；乳糖作為碳源時(shí)，工程菌生長(zhǎng)情況一般，蛋白表達(dá)量也處于中等水平；甘油為碳源時(shí)，工程菌生長(zhǎng)緩慢，蛋白表達(dá)量最低。這是因?yàn)槠咸烟鞘谴竽c桿菌最易利用的碳源，能夠快速為細(xì)胞提供能量和碳骨架，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝，從而有利于蛋白的表達(dá)。接著，研究不同氮源對(duì)工程菌的影響。選取牛肉膏、蛋白胨、酵母提取物、硫酸銨、硝酸銨等作為氮源，同樣配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以牛肉膏和蛋白胨為氮源時(shí)，工程菌生長(zhǎng)良好，蛋白表達(dá)量較高。牛肉膏和蛋白胨中含有豐富的氨基酸、多肽等有機(jī)氮源，這些物質(zhì)能夠?yàn)楣こ叹峁┤娴臓I(yíng)養(yǎng)，滿足其生長(zhǎng)和蛋白合成的需求。以硫酸銨和硝酸銨等無(wú)機(jī)氮源時(shí)，工程菌生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，蛋白表達(dá)量較低。這是因?yàn)闊o(wú)機(jī)氮源的利用需要工程菌通過(guò)一系列復(fù)雜的代謝過(guò)程將其轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮，增加了代謝負(fù)擔(dān)，不利于工程菌的快速生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)。無(wú)機(jī)鹽在培養(yǎng)基中也起著不可或缺的作用，它們參與細(xì)胞的多種生理過(guò)程，如酶的激活、滲透壓的調(diào)節(jié)等。本實(shí)驗(yàn)研究了MgSO?、K?HPO?、NaCl等無(wú)機(jī)鹽對(duì)工程菌生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明，適量的MgSO?和K?HPO?能夠促進(jìn)工程菌的生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)。Mg2?是許多酶的激活劑，能夠參與細(xì)胞內(nèi)的多種代謝反應(yīng)，促進(jìn)蛋白質(zhì)和核酸的合成；K?HPO?不僅為細(xì)胞提供磷元素，還能調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，維持細(xì)胞生長(zhǎng)的適宜環(huán)境。而NaCl的濃度對(duì)工程菌的影響較為復(fù)雜，低濃度的NaCl能夠維持細(xì)胞的滲透壓，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，但高濃度的NaCl會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，影響蛋白表達(dá)。通過(guò)綜合比較不同碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等成分對(duì)工程菌生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)的影響，最終確定了最佳培養(yǎng)基成分。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基，能夠顯著提高工程菌的生長(zhǎng)速度和蛋白表達(dá)量，為后續(xù)的蛋白純化和應(yīng)用研究奠定了良好的基礎(chǔ)。4.1.2培養(yǎng)溫度和時(shí)間優(yōu)化培養(yǎng)溫度和時(shí)間是影響工程菌生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)的重要因素，合適的培養(yǎng)溫度和時(shí)間能夠使工程菌處于最佳的生長(zhǎng)狀態(tài)，從而實(shí)現(xiàn)蛋白的高效表達(dá)。不同培養(yǎng)溫度對(duì)工程菌的生長(zhǎng)和代謝具有顯著影響。在較低溫度下，如30℃，工程菌生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞代謝活動(dòng)較弱，這是因?yàn)榈蜏貢?huì)降低酶的活性，減緩細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)速率，從而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂。但在這種條件下，目的蛋白的可溶性表達(dá)可能會(huì)有所提高，因?yàn)檩^低的溫度可以減少蛋白的錯(cuò)誤折疊和聚集，有利于形成正確的蛋白質(zhì)構(gòu)象。在較高溫度下，如42℃，工程菌生長(zhǎng)速度加快，細(xì)胞代謝旺盛，這是因?yàn)檩^高的溫度能夠提高酶的活性，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)合成和能量代謝。對(duì)于本實(shí)驗(yàn)中的工程菌，當(dāng)溫度升高到42℃時(shí)，PBV220載體的啟動(dòng)子被激活，目的基因開始高效表達(dá)。過(guò)高的溫度也可能導(dǎo)致蛋白的降解和包涵體的形成增加，因?yàn)楦邷貢?huì)使蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性下降，容易發(fā)生變性和聚集。為了確定最佳培養(yǎng)溫度，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了多個(gè)溫度梯度進(jìn)行研究。將工程菌分別在30℃、37℃、42℃下進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，定期測(cè)定菌液的OD600值，觀察工程菌的生長(zhǎng)情況，誘導(dǎo)表達(dá)后通過(guò)SDS-PAGE電泳分析蛋白表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在30℃下培養(yǎng)時(shí)，工程菌生長(zhǎng)緩慢，誘導(dǎo)表達(dá)后蛋白表達(dá)量較低，但蛋白的可溶性較好；在37℃下培養(yǎng)時(shí)，工程菌生長(zhǎng)速度適中，蛋白表達(dá)量有所提高，但仍不如42℃下的表達(dá)量；在42℃下培養(yǎng)時(shí)，工程菌生長(zhǎng)迅速，蛋白表達(dá)量最高，但蛋白的可溶性相對(duì)較低，包涵體形成較多。綜合考慮蛋白表達(dá)量和可溶性，選擇42℃作為誘導(dǎo)表達(dá)溫度，但在誘導(dǎo)過(guò)程中需要采取適當(dāng)?shù)拇胧﹣?lái)提高蛋白的可溶性，如添加適量的分子伴侶或降低誘導(dǎo)時(shí)間。培養(yǎng)時(shí)間同樣對(duì)工程菌的生長(zhǎng)狀態(tài)和蛋白表達(dá)有著重要影響。在培養(yǎng)初期，工程菌處于適應(yīng)期，細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)緩慢，此時(shí)細(xì)胞主要進(jìn)行生理調(diào)整，適應(yīng)新的培養(yǎng)環(huán)境。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，工程菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)增長(zhǎng)，代謝活動(dòng)旺盛，此時(shí)是細(xì)胞生長(zhǎng)和物質(zhì)合成的關(guān)鍵時(shí)期。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期，工程菌的生長(zhǎng)速度逐漸減緩，進(jìn)入穩(wěn)定期，此時(shí)細(xì)胞數(shù)量基本保持不變，代謝產(chǎn)物的積累達(dá)到一定水平。如果培養(yǎng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，工程菌會(huì)進(jìn)入衰亡期，細(xì)胞開始死亡，代謝活動(dòng)逐漸停止。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析不同培養(yǎng)時(shí)間下工程菌的生長(zhǎng)狀態(tài)和蛋白表達(dá)變化趨勢(shì)，確定最佳培養(yǎng)時(shí)間。在42℃誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程中，分別在誘導(dǎo)1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)、5小時(shí)、6小時(shí)后取樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)1-2小時(shí)時(shí)，蛋白表達(dá)量較低；誘導(dǎo)3-4小時(shí)時(shí)，蛋白表達(dá)量迅速增加；誘導(dǎo)5-6小時(shí)時(shí)，蛋白表達(dá)量繼續(xù)增加，但增加幅度逐漸減小，且此時(shí)由于長(zhǎng)時(shí)間高溫培養(yǎng)，部分蛋白開始出現(xiàn)降解現(xiàn)象。綜合考慮，選擇誘導(dǎo)4小時(shí)作為最佳培養(yǎng)時(shí)間，此時(shí)蛋白表達(dá)量較高，且蛋白質(zhì)量較好。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)溫度和時(shí)間的優(yōu)化，能夠使工程菌在最適宜的條件下生長(zhǎng)和表達(dá)蛋白，提高蛋白的表達(dá)量和質(zhì)量，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供了更有利的條件。4.1.3誘導(dǎo)條件優(yōu)化誘導(dǎo)條件的優(yōu)化對(duì)于提高蛋白表達(dá)量和質(zhì)量至關(guān)重要，不同的誘導(dǎo)劑種類、濃度以及誘導(dǎo)時(shí)機(jī)都會(huì)對(duì)蛋白表達(dá)產(chǎn)生顯著影響。在原核表達(dá)系統(tǒng)中，常用的誘導(dǎo)劑有IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）、乳糖等。IPTG是一種常用的乳糖操縱子誘導(dǎo)劑，它能夠與阻遏蛋白結(jié)合，解除阻遏蛋白對(duì)操縱子的抑制作用，從而啟動(dòng)目的基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。乳糖則是天然的誘導(dǎo)劑，它可以被大腸桿菌中的β-半乳糖苷酶分解為葡萄糖和半乳糖，半乳糖作為誘導(dǎo)劑發(fā)揮作用。為了探究不同誘導(dǎo)劑對(duì)蛋白表達(dá)的影響，本實(shí)驗(yàn)分別使用IPTG和乳糖作為誘導(dǎo)劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將工程菌培養(yǎng)至OD600值為0.6-0.8時(shí)，分別加入不同濃度的IPTG和乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)結(jié)束后，通過(guò)SDS-PAGE電泳分析蛋白表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用IPTG誘導(dǎo)時(shí)，蛋白表達(dá)量較高，在SDS-PAGE膠上出現(xiàn)明顯的目的蛋白條帶；使用乳糖誘導(dǎo)時(shí)，蛋白表達(dá)量相對(duì)較低，目的蛋白條帶較淺。這是因?yàn)镮PTG是一種高效的誘導(dǎo)劑，它能夠快速啟動(dòng)目的基因的表達(dá)，而乳糖的誘導(dǎo)作用相對(duì)較弱，且受到大腸桿菌中β-半乳糖苷酶活性的影響。因此，選擇IPTG作為本實(shí)驗(yàn)的誘導(dǎo)劑。確定誘導(dǎo)劑種類后，進(jìn)一步探索不同IPTG濃度對(duì)蛋白表達(dá)的影響。設(shè)置IPTG濃度梯度為0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM，在相同條件下對(duì)工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著IPTG濃度的增加，蛋白表達(dá)量逐漸增加。當(dāng)IPTG濃度為0.3mM時(shí)，蛋白表達(dá)量達(dá)到較高水平；繼續(xù)增加IPTG濃度，蛋白表達(dá)量雖然仍有增加，但增加幅度不明顯，且高濃度的IPTG可能會(huì)對(duì)工程菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的抑制作用。綜合考慮，選擇0.3mM作為最佳IPTG誘導(dǎo)濃度。誘導(dǎo)時(shí)機(jī)也是影響蛋白表達(dá)的重要因素。在工程菌生長(zhǎng)的不同階段進(jìn)行誘導(dǎo)，會(huì)導(dǎo)致蛋白表達(dá)量和質(zhì)量的差異。本實(shí)驗(yàn)研究了在工程菌OD600值分別為0.4、0.6、0.8、1.0時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)對(duì)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明，當(dāng)OD600值為0.6-0.8時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)，蛋白表達(dá)量較高。在OD600值為0.4時(shí)誘導(dǎo)，工程菌生長(zhǎng)尚未達(dá)到最佳狀態(tài)，細(xì)胞代謝能力較弱，不利于蛋白的大量表達(dá)；在OD600值為1.0時(shí)誘導(dǎo)，工程菌可能已經(jīng)進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期，細(xì)胞活力開始下降，蛋白表達(dá)量也會(huì)受到影響。因此，選擇在工程菌OD600值為0.6-0.8時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)。通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)劑種類、濃度和誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的優(yōu)化，確定了最佳誘導(dǎo)方案，即使用0.3mM的IPTG在工程菌OD600值為0.6-0.8時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)。在該誘導(dǎo)方案下，能夠顯著提高蛋白表達(dá)量，同時(shí)保證蛋白的質(zhì)量，為后續(xù)的蛋白純化和應(yīng)用研究提供了高質(zhì)量的蛋白樣品。4.2發(fā)酵罐放大培養(yǎng)發(fā)酵罐放大培養(yǎng)是實(shí)現(xiàn)糖蛋白G大規(guī)模生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其工藝流程包括多個(gè)關(guān)鍵步驟。在使用發(fā)酵罐前，需進(jìn)行嚴(yán)格的清洗與滅菌操作。先用清水沖洗發(fā)酵罐內(nèi)部，去除殘留雜質(zhì)，再用氫氧化鈉溶液浸泡，以徹底清除油污和微生物，之后用大量清水沖洗至中性。滅菌采用高壓蒸汽滅菌法，將發(fā)酵罐及其附屬設(shè)備（如管道、閥門、攪拌槳等）在121℃、15-20分鐘的條件下進(jìn)行滅菌，以確保整個(gè)發(fā)酵系統(tǒng)處于無(wú)菌狀態(tài)，避免雜菌污染對(duì)發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生不良影響。接種過(guò)程需嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作原則。將搖瓶培養(yǎng)獲得的種子液按照一定比例（通常為5%-10%）接入發(fā)酵罐中。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用無(wú)菌移液管準(zhǔn)確吸取種子液，通過(guò)無(wú)菌接種口迅速接入發(fā)酵罐，盡量縮短接種時(shí)間，減少污染風(fēng)險(xiǎn)。在培養(yǎng)過(guò)程中，需對(duì)多個(gè)參數(shù)進(jìn)行精確控制。通氣量的控制至關(guān)重要，它直接影響菌體的生長(zhǎng)和代謝。根據(jù)搖瓶培養(yǎng)優(yōu)化結(jié)果，一般將通氣量控制在1-2vvm（體積空氣/體積發(fā)酵液/分鐘）。例如，對(duì)于5L的發(fā)酵罐，通氣量可設(shè)置為5-10L/min。通過(guò)調(diào)節(jié)空氣壓縮機(jī)的輸出壓力和流量，確保發(fā)酵液中溶解氧水平維持在合適范圍，滿足菌體對(duì)氧氣的需求。攪拌速度也是關(guān)鍵參數(shù)之一，它能夠促進(jìn)氣液混合、菌體與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的充分接觸。根據(jù)搖瓶培養(yǎng)時(shí)的攪拌效果，發(fā)酵罐攪拌速度可設(shè)置在200-500rpm。較低的攪拌速度可能導(dǎo)致氣液混合不均勻，菌體生長(zhǎng)受限；而過(guò)高的攪拌速度則可能產(chǎn)生過(guò)大的剪切力，損傷菌體細(xì)胞。pH值的控制對(duì)菌體生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)也有重要影響。通過(guò)在線pH電極實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)發(fā)酵液的pH值，當(dāng)pH值偏離設(shè)定范圍時(shí)，自動(dòng)添加酸堿溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。根據(jù)前期優(yōu)化結(jié)果，將pH值控制在7.0-7.5之間。例如，當(dāng)pH值低于7.0時(shí)，自動(dòng)添加1M的氫氧化鈉溶液；當(dāng)pH值高于7.5時(shí)，添加1M的鹽酸溶液。在放大培養(yǎng)過(guò)程中，可能會(huì)出現(xiàn)一些問(wèn)題。如染菌問(wèn)題，一旦發(fā)生染菌，雜菌會(huì)與目標(biāo)工程菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生有害代謝產(chǎn)物，影響目標(biāo)蛋白的表達(dá)。染菌可能是由于滅菌不徹底、接種過(guò)程操作不當(dāng)或空氣過(guò)濾器失效等原因引起。解決措施包括加強(qiáng)滅菌操作，確保所有設(shè)備和培養(yǎng)基滅菌徹底；嚴(yán)格規(guī)范接種流程，在無(wú)菌環(huán)境下操作；定期檢查和更換空氣過(guò)濾器，保證進(jìn)氣的無(wú)菌性。若發(fā)現(xiàn)染菌，應(yīng)立即停止發(fā)酵，對(duì)發(fā)酵罐及相關(guān)設(shè)備進(jìn)行徹底清洗和滅菌后再重新進(jìn)行發(fā)酵。泡沫過(guò)多也是常見(jiàn)問(wèn)題，泡沫會(huì)占據(jù)發(fā)酵罐空間，影響通氣和攪拌效果，甚至可能導(dǎo)致染菌。這可能是由于培養(yǎng)基成分、通氣量過(guò)大或攪拌速度過(guò)快等因素引起。解決方法包括優(yōu)化培養(yǎng)基配方，減少易起泡成分；適當(dāng)降低通氣量和攪拌速度；添加消泡劑，如有機(jī)硅消泡劑或聚醚類消泡劑，但要注意消泡劑的添加量，避免對(duì)菌體生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)產(chǎn)生負(fù)面影響。通過(guò)采取這些措施，能夠有效解決放大培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)的問(wèn)題，確保發(fā)酵過(guò)程的順利進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)糖蛋白G的高效表達(dá)和大規(guī)模生產(chǎn)。五、糖蛋白G初步純化方法與結(jié)果5.1初步純化方法5.1.1超聲裂解法破裂菌體超聲裂解法是一種廣泛應(yīng)用于細(xì)胞破碎的技術(shù)，其原理基于超聲波的機(jī)械振動(dòng)作用。當(dāng)超聲波在液體介質(zhì)中傳播時(shí)，會(huì)產(chǎn)生交替的壓縮和拉伸應(yīng)力。在拉伸階段，液體中的微小氣泡會(huì)迅速膨脹，而在壓縮階段，這些氣泡又會(huì)突然破裂，這一過(guò)程被稱為空化效應(yīng)。空化效應(yīng)產(chǎn)生的瞬間高溫、高壓以及強(qiáng)烈的剪切力，能夠有效地破壞菌體細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)，包括目的蛋白，釋放到溶液中。在本實(shí)驗(yàn)中，超聲裂解的具體操作條件如下：將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液離心收集菌體，用PBS緩沖液洗滌菌體兩次后，重懸于適量的PBS緩沖液中，使菌體濃度達(dá)到合適水平。將裝有菌懸液的離心管置于冰浴中，以防止超聲過(guò)程中產(chǎn)生的熱量導(dǎo)致蛋白變性。使用超聲破碎儀進(jìn)行裂解，設(shè)置超聲功率為300W，超聲時(shí)間為3秒，間歇時(shí)間為5秒，如此反復(fù)進(jìn)行，總超聲時(shí)間為10分鐘。選擇300W的超聲功率是因?yàn)樵谇捌陬A(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，低于此功率時(shí)，菌體破碎不完全，目的蛋白釋放量較低；而高于此功率時(shí)，雖然菌體破碎效果較好，但容易導(dǎo)致蛋白變性，影響蛋白的活性和結(jié)構(gòu)。超聲時(shí)間設(shè)置為3秒，間歇時(shí)間為5秒，是為了在保證菌體充分破碎的同時(shí)，避免因長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)超聲產(chǎn)生過(guò)多熱量，對(duì)蛋白造成損害?？偝晻r(shí)間10分鐘也是經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)優(yōu)化確定的，在此時(shí)間內(nèi)，既能實(shí)現(xiàn)菌體的有效破碎，又能最大程度地保護(hù)目的蛋白的活性和結(jié)構(gòu)。超聲裂解對(duì)目的蛋白活性和結(jié)構(gòu)可能產(chǎn)生一定的影響。過(guò)高的超聲功率和過(guò)長(zhǎng)的超聲時(shí)間可能導(dǎo)致蛋白的變性和聚集。當(dāng)超聲功率過(guò)高時(shí)，空化效應(yīng)產(chǎn)生的強(qiáng)大剪切力可能會(huì)破壞蛋白的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)，使蛋白的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而失去活性。長(zhǎng)時(shí)間的超聲還可能導(dǎo)致蛋白分子之間相互碰撞加劇，引發(fā)蛋白的聚集，形成不溶性的包涵體。在超聲裂解過(guò)程中，采取了一系列措施來(lái)減少對(duì)目的蛋白的影響。將菌懸液置于冰浴中，通過(guò)低溫環(huán)境降低蛋白變性的風(fēng)險(xiǎn)；采用間歇式超聲方式，避免連續(xù)超聲產(chǎn)生過(guò)多熱量。通過(guò)這些措施的實(shí)施，能夠在保證菌體有效破碎的前提下，最大程度地保護(hù)目的蛋白的活性和結(jié)構(gòu)，為后續(xù)的蛋白純化和分析提供良好的基礎(chǔ)。5.1.2SDS-PAGE電泳檢測(cè)SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）檢測(cè)目的蛋白的原理基于蛋白質(zhì)分子在電場(chǎng)中的遷移行為。SDS是一種陰離子去污劑，它能夠與蛋白質(zhì)分子按一定比例結(jié)合，使蛋白質(zhì)分子帶上大量的負(fù)電荷。在樣品處理過(guò)程中，通常還會(huì)加入強(qiáng)還原劑，如β-巰基乙醇，它能夠斷開蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵，使蛋白亞基充分解聚。經(jīng)過(guò)這樣的處理，蛋白質(zhì)分子被完全變性，并形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。在聚丙烯酰胺凝膠電泳中，這種復(fù)合物在電場(chǎng)的作用下向正極移動(dòng)，其遷移速度主要取決于蛋白質(zhì)分子的大小，而與蛋白質(zhì)原有的電荷和形狀無(wú)關(guān)。這是因?yàn)镾DS使蛋白質(zhì)分子帶上了均勻的負(fù)電荷，掩蓋了不同蛋白質(zhì)分子間原有的電荷差異，同時(shí)聚丙烯酰胺凝膠具有分子篩效應(yīng)，能夠根據(jù)分子大小對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。分子較小的蛋白質(zhì)能夠在凝膠的小孔中快速遷移，而分子較大的蛋白質(zhì)則受到較大的阻力，遷移速度較慢，從而實(shí)現(xiàn)了不同分子量蛋白質(zhì)的分離。實(shí)驗(yàn)步驟如下：制膠：根據(jù)目的蛋白的分子量大小，選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠。對(duì)于本實(shí)驗(yàn)中的糖蛋白G，其分子量約為60kDa，因此選擇10%的分離膠和5%的濃縮膠。分離膠的配制過(guò)程如下：依次加入適量的30%丙烯酰胺溶液、1.5MTris-HCl（pH8.8）緩沖液、10%SDS、10%過(guò)硫酸銨和TEMED（四甲基乙二胺），迅速混勻后，將混合液倒入凝膠模具中，留出足夠的空間用于加入濃縮膠。在分離膠溶液表面輕輕覆蓋一層水飽和正丁醇，以隔絕空氣，促進(jìn)凝膠聚合。待分離膠聚合完全后，倒去正丁醇，用去離子水沖洗凝膠表面，去除殘留的正丁醇。濃縮膠的配制方法與分離膠類似，只是將1.5MTris-HCl（pH8.8）緩沖液換成1.0MTris-HCl（pH6.8）緩沖液。將濃縮膠溶液倒入分離膠上方，插入梳子，待濃縮膠聚合后，小心拔出梳子，形成加樣孔。加樣：將超聲裂解后的菌體上清液與5×上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5分鐘，使蛋白質(zhì)充分變性。取適量變性后的樣品加入到凝膠的加樣孔中，同時(shí)在相鄰的加樣孔中加入蛋白Marker，作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。蛋白Marker包含了一系列已知分子量的蛋白質(zhì)，通過(guò)與蛋白Marker的條帶進(jìn)行對(duì)比，可以確定目的蛋白的分子量。電泳：將凝膠放入電泳槽中，加入適量的1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液。連接電源，設(shè)置電壓為80V，電泳30分鐘，使樣品在濃縮膠中充分濃縮。然后將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部，結(jié)束電泳。在低電壓下進(jìn)行濃縮膠電泳，能夠使樣品中的蛋白質(zhì)在濃縮膠中堆積成一條狹窄的區(qū)帶，提高分離效果；而在高電壓下進(jìn)行分離膠電泳，則可以加快電泳速度，提高實(shí)驗(yàn)效率。染色：電泳結(jié)束后，將凝膠從電泳槽中取出，放入考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中，室溫下振蕩染色1-2小時(shí)?？捡R斯亮藍(lán)R-250能夠與蛋白質(zhì)分子結(jié)合，使蛋白質(zhì)條帶呈現(xiàn)出藍(lán)色。染色過(guò)程中，染料分子通過(guò)范德華力和疏水作用與蛋白質(zhì)分子相互作用，從而使蛋白質(zhì)條帶在凝膠上可視化。脫色：染色結(jié)束后，將凝膠取出，用去離子水沖洗數(shù)次，去除表面多余的染色液。然后將凝膠放入脫色液（乙醇：水:冰乙酸=5:85:10，v/v/v）中，室溫下振蕩脫色，期間更換脫色液2-3次，直至背景清晰，蛋白質(zhì)條帶清晰可見(jiàn)。脫色的目的是去除凝膠中未與蛋白質(zhì)結(jié)合的染色液，使蛋白質(zhì)條帶更加清晰，便于觀察和分析。通過(guò)電泳結(jié)果判斷目的蛋白的純度和含量。在SDS-PAGE凝膠上，若目的蛋白條帶單一、清晰，且沒(méi)有明顯的雜蛋白條帶，說(shuō)明目的蛋白的純度較高；反之，若在目的蛋白條帶附近或其他位置出現(xiàn)多條雜蛋白條帶，則表明目的蛋白純度較低，需要進(jìn)一步優(yōu)化純化方法。對(duì)于目的蛋白含量的判斷，可以通過(guò)比較目的蛋白條帶與蛋白Marker中已知含量的條帶的亮度來(lái)進(jìn)行半定量分析。也可以使用圖像分析軟件，如ImageJ，對(duì)凝膠圖像進(jìn)行分析，通過(guò)計(jì)算目的蛋白條帶的灰度值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對(duì)比，實(shí)現(xiàn)對(duì)目的蛋白含量的定量分析。5.1.3DEAE離子交換凝膠柱純化DEAE離子交換凝膠柱的工作原理基于離子交換作用。DEAE（二乙氨基乙基）是一種弱堿性陰離子交換基團(tuán)，其載體通常為葡聚糖凝膠或瓊脂糖凝膠。在合適的pH條件下，DEAE基團(tuán)帶正電荷，能夠與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)分子通過(guò)靜電相互作用結(jié)合。不同蛋白質(zhì)分子由于其氨基酸組成和結(jié)構(gòu)的差異，所帶電荷的數(shù)量和分布也不同，因此與DEAE凝膠的結(jié)合能力存在差異。在洗脫過(guò)程中，通過(guò)改變洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度或pH值，可以使與凝膠結(jié)合的蛋白質(zhì)分子按照結(jié)合能力的強(qiáng)弱依次被洗脫下來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)不同蛋白質(zhì)的分離。具體操作過(guò)程如下：平衡：將DEAE離子交換凝膠柱用適量的平衡緩沖液（20mMTris-HCl，pH8.0）平衡，使凝膠柱內(nèi)的緩沖液與后續(xù)上樣和洗脫所需的緩沖液環(huán)境一致。平衡過(guò)程中，以0.5-1.0ml/min的流速使平衡緩沖液流過(guò)凝膠柱，直至流出液的pH值和電導(dǎo)率與平衡緩沖液基本相同。平衡緩沖液的選擇至關(guān)重要，其pH值和離子強(qiáng)度應(yīng)能夠使目的蛋白與DEAE凝膠充分結(jié)合，同時(shí)避免其他雜質(zhì)蛋白的非特異性結(jié)合。在本實(shí)驗(yàn)中，選擇pH8.0的Tris-HCl緩沖液，是因?yàn)樵谠損H條件下，糖蛋白G帶負(fù)電荷，能夠與帶正電荷的DEAE基團(tuán)結(jié)合。上樣：將超聲裂解后經(jīng)過(guò)初步離心去除細(xì)胞碎片的上清液緩慢加入到平衡好的DEAE凝膠柱中，控制上樣流速為0.2-0.3ml/min，使樣品能夠充分與凝膠接觸并結(jié)合。上樣量應(yīng)根據(jù)凝膠柱的載量和樣品中目的蛋白的含量進(jìn)行合理調(diào)整，避免上樣量過(guò)大導(dǎo)致目的蛋白無(wú)法完全結(jié)合在凝膠上，影響純化效果。在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)前期的小試實(shí)驗(yàn)，確定了合適的上樣量，以保證目的蛋白能夠有效地結(jié)合在凝膠柱上。洗脫：上樣結(jié)束后，先用平衡緩沖液沖洗凝膠柱，去除未結(jié)合的雜質(zhì)蛋白，直至流出液在280nm處的吸光度基本穩(wěn)定。然后采用線性梯度洗脫的方式，使用含有不同濃度NaCl的洗脫緩沖液（20mMTris-HCl，pH8.0，含0-1MNaCl）進(jìn)行洗脫。隨著洗脫緩沖液中NaCl濃度的逐漸增加，離子強(qiáng)度增大，與DEAE凝膠結(jié)合的蛋白質(zhì)分子會(huì)因?yàn)殪o電相互作用的減弱而依次被洗脫下來(lái)。洗脫流速控制在0.5-1.0ml/min，收集洗脫液，每管收集1-2ml，并使用紫外分光光度計(jì)在280nm處測(cè)定各管洗脫液的吸光度，繪制洗脫曲線。在洗脫過(guò)程中，根據(jù)洗脫曲線和SDS-PAGE電泳分析結(jié)果，確定目的蛋白的洗脫峰位置，收集含有目的蛋白的洗脫液。該方法對(duì)目的蛋白的純化效果較為顯著，通過(guò)DEAE離子交換凝膠柱純化后，在SDS-PAGE電泳圖上，目的蛋白條帶更加清晰，雜蛋白條帶明顯減少，表明目的蛋白的純度得到了有效提高。這種方法也可能存在一些問(wèn)題。在洗脫過(guò)程中，可能會(huì)出現(xiàn)目的蛋白與雜質(zhì)蛋白分離不完全的情況，導(dǎo)致目的蛋白中仍含有少量雜質(zhì)。這可能是由于洗脫條件（如洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度、pH值、洗脫流速等）設(shè)置不合理，或者凝膠柱的性能不佳等原因引起的。為了解決這些問(wèn)題，可以進(jìn)一步優(yōu)化洗脫條件，如調(diào)整洗脫緩沖液的組成和濃度梯度，改變洗脫流速等；也可以對(duì)凝膠柱進(jìn)行預(yù)處理或再生處理，提高凝膠柱的性能和使用壽命。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，還可以結(jié)合其他純化方法，如凝膠過(guò)濾層析、親和層析等，進(jìn)一步提高目的蛋白的純度，滿足實(shí)驗(yàn)和應(yīng)用的需求。5.2純化結(jié)果分析純化前后的蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。泳道M為蛋白Marker，泳道1為純化前的蛋白樣品，泳道2為經(jīng)過(guò)DEAE離子交換凝膠柱純化后的蛋白樣品。從圖中可以清晰地看出，純化前的樣品在SDS-PAGE膠上呈現(xiàn)出多條蛋白條帶，這表明樣品中含有多種雜質(zhì)蛋白，目的蛋白糖蛋白G的條帶并不明顯，難以與其他雜蛋白區(qū)分開來(lái)。經(jīng)過(guò)DEAE離子交換凝膠柱純化后，雜蛋白條帶顯著減少，在與預(yù)期分子量（約60kDa）相對(duì)應(yīng)的位置出現(xiàn)了一條清晰且較濃的條帶，該條帶即為目的蛋白糖蛋白G，說(shuō)明經(jīng)過(guò)純化，目的蛋白的純度得到了顯著提高。[此處插入SDS-PAGE電泳圖][此處插入SDS-PAGE電泳圖]為了進(jìn)一步分析純化后蛋白的質(zhì)量和純度，采用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)純化前后的蛋白樣品進(jìn)行蛋白含量測(cè)定。結(jié)果顯示，純化前蛋白樣品的濃度為1.2mg/ml，純化后蛋白樣品的濃度為0.8mg/ml。雖然純化后蛋白濃度有所降低，但這是由于在純化過(guò)程中去除了大量的雜質(zhì)蛋白所致。通過(guò)計(jì)算純度，純化前目的蛋白的純度約為20%，而純化后目的蛋白的純度提高到了70%左右，表明純化過(guò)程有效地去除了雜質(zhì)，提高了目的蛋白的純度。對(duì)純化后蛋白的活性進(jìn)行檢測(cè)，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)其與特異性抗體的結(jié)合活性。結(jié)果表明，純化后的蛋白能夠與HSV-1糖蛋白G特異性抗體發(fā)生特異性結(jié)合，且結(jié)合活性較強(qiáng)，說(shuō)明純化后的蛋白保持了良好的免疫活性，其結(jié)構(gòu)和功能未受到明顯影響。在純化過(guò)程中，也出現(xiàn)了一些問(wèn)題。在洗脫過(guò)程中，目的蛋白的洗脫峰不夠尖銳，存在拖尾現(xiàn)象，這可能導(dǎo)致目的蛋白與部分雜質(zhì)蛋白分離不完全。分析原因可能是洗脫流速過(guò)快，