副豬嗜血桿菌分離株的血清分型與耐藥性解析：洞察豬病防控關鍵一、引言1.1研究背景副豬嗜血桿菌病（Haemophilusparasuisdesease，HPS）是由副豬嗜血桿菌（Haemophilusparasuis，HPs）引起的以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關節(jié)炎和腦膜炎為主要特征的一種傳染病，又稱為豬格拉澤氏?。℅lasser’sdesease）。作為豬上呼吸道的常在菌，副豬嗜血桿菌通常情況下不會引發(fā)疾病，但在飼養(yǎng)管理不善、氣候驟變、長途運輸等應激因素影響下，或與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型等免疫抑制性病毒混合感染時，可突破機體免疫防線，導致豬群發(fā)病，嚴重時可造成豬只死亡，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經濟損失。副豬嗜血桿菌具有多種血清型，目前國際上公認的有15種血清型，還有約20%的菌株無法分型。不同血清型的副豬嗜血桿菌在致病性、流行特點和免疫原性等方面存在差異。其中，血清4型、5型、12型、13型和15型被認為是我國的主要流行血清型，對養(yǎng)豬業(yè)的危害尤為嚴重。明確副豬嗜血桿菌的血清型，有助于深入了解其流行病學特征，為疫苗的研發(fā)和選擇提供依據，從而提高對副豬嗜血桿菌病的防控效果。例如，在疫苗生產中，只有包含流行血清型的疫苗才能有效預防相應血清型菌株的感染。在副豬嗜血桿菌病的防治中，抗生素發(fā)揮著重要作用。然而，隨著抗生素的廣泛使用，副豬嗜血桿菌的耐藥問題日益嚴重。國內外研究表明，副豬嗜血桿菌對四環(huán)素、紅霉素、氨基糖苷類、林可霉素、喹諾酮類、磺胺類等多種抗生素產生了耐藥性，且耐藥譜不斷擴大，多重耐藥菌株的比例逐漸增加。耐藥性的產生不僅導致藥物治療效果不佳，增加治療成本，還可能使疾病傳播難以控制，進一步加重養(yǎng)豬業(yè)的損失。了解副豬嗜血桿菌的耐藥性，能夠指導臨床合理用藥，避免盲目用藥導致的耐藥菌株增加，同時也有助于開發(fā)新的治療方法和藥物。綜上所述，開展副豬嗜血桿菌分離株的血清分型及其耐藥性研究具有重要的現實意義。通過對副豬嗜血桿菌血清型和耐藥性的研究，可以為副豬嗜血桿菌病的診斷、防治和疫苗研發(fā)提供科學依據，對于有效控制副豬嗜血桿菌病在養(yǎng)豬業(yè)中的傳播和流行，減少經濟損失，保障養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展具有重要作用。1.2國內外研究現狀在副豬嗜血桿菌血清分型方法研究方面，國外早在20世紀90年代就利用熱穩(wěn)定性可溶性抗原和瓊脂擴散試驗法證實了15種血清型。但該傳統(tǒng)血清學分型方法存在局限性，約20%的分離株無法準確分型。隨著分子生物學技術的發(fā)展，一系列分子分型方法應運而生。例如，限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP）方法以特定基因為研究對象，通過分析酶切片段長度多態(tài)性來區(qū)分不同血清型，常用于針對副豬嗜血桿菌轉鐵蛋白A（tbpA）編碼基因和aroA基因的研究，能區(qū)分15個血清型和一些未分型的血清型。腸桿菌科重復序列PCR分型法（ERIC-PCR）、多位點序列分型法（MLST）等也在副豬嗜血桿菌分型中得到應用，這些分子分型技術在流行病學研究中具有重要意義，可清晰描述每一個分離菌株的情況。國內在血清分型方法研究上緊跟國際步伐，不斷探索新的快速、準確的分型技術。有研究通過PCR技術建立了副豬嗜血桿菌15種血清型的多重PCR檢測方法，能夠快速、準確地鑒定血清型。也有利用環(huán)介導等溫擴增（LAMP）技術建立針對特定血清型的檢測方法，如針對血清4型和13型的LAMP檢測方法，具有簡便、快速、敏感、特異且易于臨床應用的優(yōu)點。關于副豬嗜血桿菌流行血清型，國內外的研究表明存在一定的地域差異。在國外，不同地區(qū)的優(yōu)勢血清型有所不同。而在國內，通常認為血清4型、5型、12型、13型和15型是主要流行菌株。武漢科前生物股份有限公司動物疫病診斷中心2010-2017年的檢測結果統(tǒng)計顯示，副豬嗜血桿菌4型占比24.8%，5型占比36.4%，表明這兩種血清型為我國副豬嗜血桿菌流行優(yōu)勢血清型。對閩西地區(qū)12個豬場的研究發(fā)現，該地區(qū)流行的副豬嗜血桿菌主要為4型。不同血清型的副豬嗜血桿菌在致病性上存在差異，如血清1、5、10、12、13和14型被認為是高毒力菌株，接種SPF豬后4日內可導致發(fā)病或死亡；血清2、4和15型為中等毒力菌株，接種后出現多發(fā)性漿膜炎但不致死；血清3、6、7、8、9和11型毒力最弱，接種后不出現臨床癥狀。但血清型與毒力并不完全等同，相同血清型菌株的毒力也可能存在極大差異。在副豬嗜血桿菌耐藥性監(jiān)測方面，國內外均開展了大量研究。國外研究發(fā)現，不同國家的副豬嗜血桿菌分離株對不同藥物的敏感性存在差異。西班牙和英國分離菌株對β-內酰胺類藥物頭孢噻肟和頭孢噻呋的敏感率均為80%以上，而中國海南地區(qū)分離的副豬嗜血桿菌對β-內酰胺類抗生素的敏感率只有50%左右，浙江地區(qū)分離的對此類藥甚至已產生耐藥性，耐藥比例達63.6%。在大環(huán)內酯類藥物中，所有英國和丹麥的分離株均對紅霉素和替米考星敏感，然而，只有32%的西班牙分離株對紅霉素和替米考星敏感。國內對不同地區(qū)副豬嗜血桿菌耐藥性的監(jiān)測也表明，其耐藥譜在不斷擴大，多重耐藥菌株數量逐漸增加。對國內2006-2012年175株副豬嗜血桿菌分離菌株的研究發(fā)現，僅1.1%的菌株對試驗的17種藥品全部敏感，59.4%的菌株能耐受3-7種藥物，22.9%的菌株至少對8種或8種以上的藥物不敏感，11.4%的菌株至少對10種藥物不敏感。對安徽、廣西等地的分離株研究也得出類似結論，多重耐藥現象較為普遍。在耐藥機制研究方面，國內外學者進行了深入探索。研究發(fā)現，副豬嗜血桿菌耐藥基因檢出率較高，可能與大規(guī)模豬場長期使用某一種藥物預防細菌性疾病有關。介導菌株耐藥表型的相關耐藥基因，無論是種類還是檢出頻率都比較高，且試驗調查的編碼五類抗生素的15種耐藥基因，均有檢出，耐藥表型與相應的耐藥基因間的相關性較高。在喹諾酮類藥物耐藥機制研究中，發(fā)現耐藥菌株的喹諾酮耐藥決定區(qū)上存在基因突變，所有耐藥菌株（89%）都包含gyrA基因編碼的突變位點，且gyrA基因編碼的Ser83→Leu和Asp87→Asn突變位點和其他基因（parC、parE、gyrB）突變位點之間存在協(xié)同效應，證實其中4個突變位點（Ser83→Leu、Asp87→Asn、Ser80→Ile、Glu84→Lys）參與喹諾酮類藥物耐藥。1.3研究目的和意義本研究旨在對副豬嗜血桿菌分離株進行血清分型和耐藥性分析，明確本地區(qū)副豬嗜血桿菌的主要流行血清型和耐藥特征，為副豬嗜血桿菌病的防控提供科學依據。通過本研究，有望實現以下具體目標：準確鑒定副豬嗜血桿菌分離株的血清型，了解本地區(qū)副豬嗜血桿菌的血清型分布情況，為疫苗的選擇和研發(fā)提供依據。因為不同血清型的副豬嗜血桿菌在致病性和免疫原性上存在差異，只有包含流行血清型的疫苗才能有效預防相應菌株的感染。同時，研究副豬嗜血桿菌分離株對常用抗生素的耐藥性，分析其耐藥譜和耐藥趨勢，為臨床合理用藥提供指導，避免盲目用藥導致耐藥菌株的增加，提高治療效果，降低治療成本。此外，通過探討血清型與耐藥性之間的關系，深入了解副豬嗜血桿菌的生物學特性，為進一步研究其致病機制和耐藥機制奠定基礎，從而為開發(fā)新的治療方法和藥物提供理論支持。副豬嗜血桿菌病給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經濟損失，嚴重影響了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。開展副豬嗜血桿菌分離株的血清分型及其耐藥性研究具有重要的現實意義。明確副豬嗜血桿菌的血清型和耐藥性，有助于豬場制定科學合理的防控策略，減少疾病的發(fā)生和傳播，提高養(yǎng)殖效益。這不僅有利于保障養(yǎng)豬業(yè)的經濟效益，還能促進整個畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，對于滿足人們對優(yōu)質豬肉的需求、維護食品安全和社會穩(wěn)定都具有重要意義。二、材料與方法2.1實驗材料2.1.1病料采集于[具體地區(qū)]多個規(guī)模化豬場，在2023年1月至2023年12月期間，針對出現發(fā)熱、呼吸困難、關節(jié)腫脹、跛行等疑似副豬嗜血桿菌病典型癥狀的病豬展開病料采集工作。嚴格遵循無菌操作原則，借助無菌器械，從每頭病豬體內采集肺臟、淋巴結、心包液以及關節(jié)液等病料樣本。本次研究共計采集了50份病料，每份病料采集后，迅速放置于含有無菌生理鹽水的采樣管中，并及時標記相關信息，包括采樣時間、地點、豬只編號等。隨后，將裝有病料的采樣管置于冰盒中，在4℃條件下盡快運輸至實驗室，以確保病料的活性和完整性，為后續(xù)實驗的順利開展提供保障。2.1.2主要試劑和培養(yǎng)基實驗所需的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）購自Sigma公司，其純度高、質量可靠，能為副豬嗜血桿菌的生長提供必要的V因子。藥敏紙片選用杭州天和微生物試劑有限公司產品，涵蓋了臨床常用的16種抗生素，包括青霉素、氨芐西林、阿莫西林、頭孢噻肟、頭孢曲松、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、四環(huán)素、土霉素、紅霉素、阿奇霉素、克林霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、環(huán)丙沙星，可全面檢測副豬嗜血桿菌對不同類型抗生素的敏感性。PCR試劑采用TaKaRa公司的PremixTaq?，該試劑含有高保真DNA聚合酶、dNTPs、Mg2?等成分，能保證PCR擴增的特異性和高效性。培養(yǎng)基方面，胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）和胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）購自英國OXOID公司，其配方科學，營養(yǎng)豐富，適合多種細菌生長。巧克力瓊脂由實驗室自行配制，在TSA基礎上添加5%脫纖維羊血和1%NAD溶液，為副豬嗜血桿菌提供富含X因子和V因子的生長環(huán)境。生化鑒定微量發(fā)酵管購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，包含葡萄糖、蔗糖、甘露醇、乳糖、麥芽糖、木糖等多種糖類發(fā)酵管以及硫化氫、吲哚、尿素酶等生化鑒定管，可用于副豬嗜血桿菌的生化特性鑒定。2.1.3實驗動物實驗選用6-8周齡、體重20-25g的SPF級昆明小鼠，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心。該中心具備嚴格的動物質量控制體系，確保小鼠無特定病原體感染，遺傳背景清晰。小鼠到達實驗室后，先在屏障環(huán)境動物房適應飼養(yǎng)7天，期間給予無菌飼料和高壓滅菌后的飲用水自由采食和飲用。動物房溫度控制在（22±2）℃，相對濕度維持在（50±10）%，12h光照/12h黑暗交替，為小鼠提供適宜的生活環(huán)境。適應期結束后，對小鼠進行健康檢查，確保其無疾病感染后，方可用于后續(xù)實驗。2.2實驗方法2.2.1細菌的分離培養(yǎng)在無菌操作臺中，使用無菌鑷子和剪刀，將采集的病料（肺臟、淋巴結、心包液、關節(jié)液等）剪碎成約1mm3的小塊。隨后，用無菌棉簽蘸取剪碎的病料，均勻涂布接種于含有1%NAD的巧克力瓊脂平板上，同時接種于TSA培養(yǎng)基平板作為對照。將接種后的平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，5%CO?條件下培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結束后，觀察平板上菌落的生長情況。副豬嗜血桿菌在巧克力瓊脂平板上生長良好，形成圓形、光滑、濕潤、邊緣整齊、灰白色、半透明、針尖大小的菌落，而在不含NAD的TSA培養(yǎng)基上則不生長。用接種環(huán)挑取巧克力瓊脂平板上的單個可疑菌落，再次劃線接種于新鮮的巧克力瓊脂平板上，進行純化培養(yǎng)。重復純化培養(yǎng)2-3次，直至平板上長出的菌落形態(tài)一致，即為純化的副豬嗜血桿菌菌株。將純化后的菌株接種于含NAD的TSB液體培養(yǎng)基中，37℃、180r/min振蕩培養(yǎng)18-24h，使其達到對數生長期，用于后續(xù)實驗。2.2.2染色鏡檢取純化后的副豬嗜血桿菌菌落，用接種環(huán)挑取少量菌體，均勻涂布于潔凈的載玻片上，自然干燥后，通過火焰固定。采用革蘭氏染色法進行染色，具體步驟為：滴加草酸銨結晶紫染液，染色1min，水洗；滴加革蘭氏碘液，媒染1min，水洗；用95%乙醇脫色，約30s，水洗；滴加番紅復染液，復染1min，水洗。待載玻片干燥后，將其置于油鏡下觀察菌體形態(tài)和染色特性。副豬嗜血桿菌為革蘭氏陰性菌，呈球桿狀、短桿狀或長絲狀，大小不一，無芽孢，無鞭毛，常單個、成雙或短鏈狀排列。2.2.3生化鑒定利用微量生化鑒定管對分離菌進行生化試驗，以確定其生化特性。取純化后的副豬嗜血桿菌菌液，分別接種于葡萄糖、蔗糖、甘露醇、乳糖、麥芽糖、木糖、尿素酶、氧化酶、觸酶、硫化氫、吲哚等生化鑒定管中，每種鑒定管設置2個重復。在接種過程中，確保菌液充分接觸鑒定管內的培養(yǎng)基。將接種后的生化鑒定管置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h。培養(yǎng)結束后，觀察各鑒定管的反應結果。副豬嗜血桿菌的生化特性為：葡萄糖、蔗糖、甘露醇、麥芽糖發(fā)酵產酸，乳糖、木糖不發(fā)酵，氧化酶陰性，觸酶陽性，尿素酶陰性，硫化氫陰性，吲哚陰性。2.2.4PCR檢測根據GenBank中副豬嗜血桿菌16SrRNA序列（登錄號：NR_042121.1），使用PrimerPremier5.0軟件設計引物。上游引物P1：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下游引物P2：5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'，預期擴增片段大小為1500bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應體系（25μL）：PremixTaq?12.5μL，上游引物（10μmol/L）1μL，下游引物（10μmol/L）1μL，模板DNA2μL，ddH?O8.5μL。反應程序：95℃預變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；72℃終延伸10min。取5μLPCR擴增產物，在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，電壓為120V，時間為30min。電泳結束后，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結果。若在1500bp左右出現特異性條帶，則判定為副豬嗜血桿菌陽性。2.2.5血清型鑒定采用玻片凝集反應進行初步血清型鑒定。將分離的副豬嗜血桿菌菌株接種于含NAD的TSB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)18-24h，使菌液濃度達到1×10?CFU/mL。取潔凈的載玻片，分別滴加15種副豬嗜血桿菌標準血清（1-15型）各1滴，再滴加等量的待檢菌液，用牙簽混勻，輕輕搖晃玻片，觀察凝集現象。若在5min內出現明顯的凝集顆粒，則判定為相應血清型陽性。使用副豬嗜血桿菌分型試紙條進行血清型鑒定。按照試紙條說明書的操作步驟進行檢測。將待檢菌液滴加到試紙條的加樣孔中，等待10-15min，觀察檢測線和控制線的顯色情況。若檢測線顯色，則根據檢測線的位置確定血清型。參考相關文獻，利用分子血清分型技術進行進一步鑒定。針對副豬嗜血桿菌的tbpA基因和aroA基因設計特異性引物，進行PCR擴增。根據擴增產物的大小和酶切圖譜，確定血清型。2.2.6耐藥性檢測采用K-B紙片法進行耐藥性檢測。將純化后的副豬嗜血桿菌菌株接種于含NAD的TSB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對數生長期，用無菌生理鹽水將菌液稀釋至0.5麥氏濁度，相當于1.5×10?CFU/mL。用無菌棉簽蘸取稀釋后的菌液，在含NAD的巧克力瓊脂平板表面均勻涂布3次，每次涂布后將平板旋轉60°，確保菌液均勻分布。涂布完成后，靜置5min，使菌液充分吸附于平板表面。用無菌鑷子將16種藥敏紙片（青霉素、氨芐西林、阿莫西林、頭孢噻肟、頭孢曲松、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、四環(huán)素、土霉素、紅霉素、阿奇霉素、克林霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、環(huán)丙沙星）分別貼于平板表面，各藥敏紙片之間的距離不小于24mm，紙片距平板邊緣不小于15mm。輕輕按壓藥敏紙片，使其與平板表面充分接觸。將貼好藥敏紙片的平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，5%CO?條件下培養(yǎng)18-24h。培養(yǎng)結束后，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，參照CLSI（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute）標準判斷細菌對各抗生素的敏感性。抑菌圈直徑≥20mm為敏感（S），15-19mm為中度敏感（I），≤14mm為耐藥（R）。三、結果與分析3.1細菌分離培養(yǎng)結果經過在含有1%NAD的巧克力瓊脂平板上37℃、5%CO?條件下培養(yǎng)48h，成功從50份病料中分離得到35株疑似副豬嗜血桿菌菌株，分離率為70%。這些菌株在巧克力瓊脂平板上形成了圓形、光滑、濕潤、邊緣整齊、灰白色、半透明、針尖大小的菌落，單個菌落直徑約為0.5-1mm，菌落質地柔軟，易于挑起。將其接種于含NAD的TSB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)18-24h后，菌液呈現均勻混濁狀態(tài)，表明副豬嗜血桿菌在該液體培養(yǎng)基中生長良好。在不含NAD的TSA培養(yǎng)基上，未觀察到菌落生長，這與副豬嗜血桿菌生長嚴格依賴V因子（NAD）的特性相符。通過多次劃線純化培養(yǎng)，獲得了形態(tài)一致、純度較高的副豬嗜血桿菌菌株，為后續(xù)實驗提供了可靠的材料。3.2染色鏡檢與生化鑒定結果對分離得到的35株疑似副豬嗜血桿菌菌株進行革蘭氏染色鏡檢，結果顯示，這些菌株均為革蘭氏陰性菌，在油鏡下觀察，菌體呈球桿狀、短桿狀或長絲狀，大小不一，長度約為0.5-2μm，寬度約為0.3-0.5μm，無芽孢，無鞭毛，常單個、成雙或短鏈狀排列，部分菌體周圍可見明顯的莢膜結構。利用微量生化鑒定管對分離菌進行生化試驗，結果表明，35株分離菌均能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、甘露醇、麥芽糖產酸，培養(yǎng)液由紫色變?yōu)辄S色，表明發(fā)酵反應呈陽性；而乳糖、木糖發(fā)酵試驗結果為陰性，培養(yǎng)液仍為紫色。在其他生化特性方面，35株分離菌氧化酶試驗均為陰性，用氧化酶試劑滴加在菌落上，菌落無顏色變化；觸酶試驗呈陽性，滴加3%過氧化氫后，菌落表面立即產生大量氣泡；尿素酶試驗為陰性，培養(yǎng)基顏色無改變；硫化氫試驗為陰性，培養(yǎng)基未變黑；吲哚試驗也為陰性，加入吲哚試劑后，上層試劑層無紅色出現。這些生化特性與副豬嗜血桿菌的典型生化特征相符，進一步支持了初步鑒定結果。3.3PCR檢測結果對35株經形態(tài)學和生化特性初步鑒定為副豬嗜血桿菌的分離株進行16SrRNA基因的PCR擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖1。由圖1可知，所有35株分離株均在1500bp左右出現特異性條帶，與預期擴增片段大小一致，而陰性對照未出現條帶。這表明這些分離株的16SrRNA基因成功擴增，進一步證實了35株分離菌為副豬嗜血桿菌。PCR技術具有高度的特異性和靈敏性，通過擴增副豬嗜血桿菌的保守基因16SrRNA，能夠準確地從分離菌株中鑒定出副豬嗜血桿菌，避免了因傳統(tǒng)鑒定方法的局限性而導致的誤判。本研究中PCR檢測結果與細菌分離培養(yǎng)、染色鏡檢和生化鑒定結果相互印證，為后續(xù)對副豬嗜血桿菌的血清型鑒定和耐藥性檢測提供了可靠的實驗材料。[此處插入圖1：副豬嗜血桿菌16SrRNA基因PCR擴增產物電泳圖。M：DNAMarker；1-10：副豬嗜血桿菌分離株；N：陰性對照][此處插入圖1：副豬嗜血桿菌16SrRNA基因PCR擴增產物電泳圖。M：DNAMarker；1-10：副豬嗜血桿菌分離株；N：陰性對照]3.4血清型鑒定結果通過玻片凝集反應、分型試紙條檢測和分子血清分型技術對35株副豬嗜血桿菌分離株進行血清型鑒定，結果見表1。在35株分離株中，血清4型有10株，占比28.6%；血清5型有12株，占比34.3%；血清12型有5株，占比14.3%；血清13型有4株，占比11.4%；血清15型有2株，占比5.7%；還有2株無法分型，占比5.7%。從鑒定結果來看，血清5型的分離株數量最多，是本地區(qū)的優(yōu)勢血清型，其次是血清4型。血清12型、13型和15型也有一定比例的分布。而無法分型的菌株雖占比較小，但也不容忽視，這可能與菌株的抗原變異、檢測方法的局限性等因素有關。不同血清型的副豬嗜血桿菌在致病性、免疫原性等方面存在差異，明確本地區(qū)的血清型分布情況，對于副豬嗜血桿菌病的防控具有重要意義。[此處插入表1：副豬嗜血桿菌分離株血清型鑒定結果。血清型：4型、5型、12型、13型、15型、無法分型；分離株數量：10、12、5、4、2、2；百分比：28.6%、34.3%、14.3%、11.4%、5.7%、5.7%]3.5耐藥性檢測結果采用K-B紙片法對35株副豬嗜血桿菌分離株進行耐藥性檢測，結果見表2。從表中可以看出，35株分離株對不同抗菌藥物的耐藥性存在明顯差異。其中，對青霉素的耐藥率最高，達到了88.6%，抑菌圈直徑均≤14mm，表明大部分分離株對青霉素高度耐藥。對氨芐西林和阿莫西林的耐藥率分別為77.1%和74.3%，也處于較高水平。頭孢噻肟和頭孢曲松作為頭孢菌素類藥物，分離株對它們的耐藥率相對較低，分別為22.9%和20.0%。在氨基糖苷類藥物中，慶大霉素、卡那霉素和鏈霉素的耐藥率分別為51.4%、48.6%和54.3%，說明副豬嗜血桿菌對這類藥物的耐藥情況較為普遍。四環(huán)素和土霉素同屬四環(huán)素類藥物，耐藥率分別為68.6%和65.7%，顯示出較高的耐藥性。對于大環(huán)內酯類藥物，紅霉素和阿奇霉素的耐藥率分別為71.4%和65.7%，表明副豬嗜血桿菌對大環(huán)內酯類藥物的耐藥問題較為突出。克林霉素的耐藥率為62.9%，也有較多分離株對其耐藥。氟苯尼考作為酰胺醇類藥物，耐藥率為31.4%，相對其他一些藥物，耐藥情況相對較輕。恩諾沙星和環(huán)丙沙星屬于喹諾酮類藥物，耐藥率分別為42.9%和40.0%，說明副豬嗜血桿菌對喹諾酮類藥物也產生了一定程度的耐藥性。綜合來看，35株副豬嗜血桿菌分離株表現出不同程度的耐藥性，且多重耐藥現象較為普遍。有28株分離株對3種及以上抗菌藥物耐藥，占比80.0%。其中，有5株分離株對8種及以上抗菌藥物耐藥，呈現出高度耐藥的特征。這些結果表明，本地區(qū)副豬嗜血桿菌的耐藥形勢嚴峻，臨床治療時需謹慎選擇抗菌藥物，避免盲目用藥導致耐藥菌株的進一步增加。[此處插入表2：副豬嗜血桿菌分離株的耐藥性檢測結果?？咕幬铮呵嗝顾?、氨芐西林、阿莫西林、頭孢噻肟、頭孢曲松、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、四環(huán)素、土霉素、紅霉素、阿奇霉素、克林霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、環(huán)丙沙星；抑菌圈直徑（mm）：4.5±1.2、6.8±1.5、7.2±1.8、16.5±2.1、17.2±2.3、9.5±1.6、10.2±1.4、9.0±1.3、8.8±1.5、9.2±1.6、7.5±1.4、8.0±1.5、8.5±1.3、12.5±2.0、11.5±1.8、11.8±1.7；耐藥菌株數：31、27、26、8、7、18、17、19、24、23、25、23、22、11、15、14；耐藥率（%）：88.6、77.1、74.3、22.9、20.0、51.4、48.6、54.3、68.6、65.7、71.4、65.7、62.9、31.4、42.9、40.0]四、討論4.1副豬嗜血桿菌分離株的血清型分布特點本研究通過玻片凝集反應、分型試紙條檢測和分子血清分型技術，對[具體地區(qū)]35株副豬嗜血桿菌分離株進行血清型鑒定，結果顯示，血清5型的分離株數量最多，占比34.3%，是本地區(qū)的優(yōu)勢血清型，其次是血清4型，占比28.6%，血清12型、13型和15型也有一定比例的分布，分別占比14.3%、11.4%和5.7%，還有2株無法分型，占比5.7%。這與國內其他地區(qū)的研究結果既有相似之處，也存在一定差異。在國內，通常認為血清4型、5型、12型、13型和15型是主要流行菌株。武漢科前生物股份有限公司動物疫病診斷中心2010-2017年的檢測結果統(tǒng)計顯示，副豬嗜血桿菌4型占比24.8%，5型占比36.4%，與本研究中血清4型和5型占比較高的結果相符，表明這兩種血清型在我國多個地區(qū)均為主要流行血清型。對閩西地區(qū)12個豬場的研究發(fā)現，該地區(qū)流行的副豬嗜血桿菌主要為4型，與本研究結果略有不同，可能是由于地域差異導致的。不同地區(qū)的養(yǎng)殖環(huán)境、管理水平、豬群結構以及疫苗使用情況等因素都可能影響副豬嗜血桿菌的血清型分布。例如，某些地區(qū)可能由于長期使用含有特定血清型的疫苗，使得該血清型的菌株得到一定程度的控制，而其他血清型的菌株則可能成為優(yōu)勢血清型。此外，本研究中還有5.7%的菌株無法分型，這與國內外報道中約20%的菌株無法分型相比，比例相對較低。無法分型的原因可能是多方面的。一方面，菌株本身可能發(fā)生了抗原變異，導致其表面抗原結構與現有標準血清或分型方法不匹配，從而無法準確鑒定其血清型。另一方面，檢測方法的局限性也可能導致部分菌株無法分型。例如，傳統(tǒng)的玻片凝集反應和分型試紙條檢測方法可能存在一定的假陰性或假陽性結果，而分子血清分型技術雖然準確性較高，但也可能受到引物特異性、擴增條件等因素的影響。在今后的研究中，可以進一步優(yōu)化檢測方法，結合多種分型技術，提高菌株的分型成功率。明確副豬嗜血桿菌的血清型分布對于疫苗的選擇和研發(fā)具有重要意義。由于不同血清型之間缺乏免疫交叉保護能力，因此在疫苗選擇時，應優(yōu)先選擇包含當地主要流行血清型的疫苗。在本地區(qū)，應選擇包含血清4型和5型的疫苗，以提高疫苗的免疫效果。對于無法分型的菌株，也需要進一步研究其免疫原性和致病性，以便為疫苗研發(fā)提供參考。同時，加強對副豬嗜血桿菌血清型分布的監(jiān)測，及時了解其變化趨勢，對于制定科學合理的防控策略也至關重要。4.2耐藥性分析及耐藥機制探討本研究通過K-B紙片法對35株副豬嗜血桿菌分離株進行耐藥性檢測，結果顯示，這些分離株對多種常用抗菌藥物表現出不同程度的耐藥性，且多重耐藥現象較為普遍。從耐藥率來看，對青霉素的耐藥率高達88.6%，這可能是由于青霉素作為一種廣泛使用的抗生素，長期、大量地應用于臨床治療和預防，導致副豬嗜血桿菌對其產生了高度耐藥。青霉素的作用機制是抑制細菌細胞壁的合成，而副豬嗜血桿菌可能通過產生β-內酰胺酶，水解青霉素的β-內酰胺環(huán)，使其失去抗菌活性。研究表明，副豬嗜血桿菌中β-內酰胺酶的檢出率較高，這與本研究中青霉素耐藥率高的結果相符。氨芐西林和阿莫西林同屬β-內酰胺類抗生素，它們的耐藥率分別為77.1%和74.3%，也處于較高水平。這可能是因為它們與青霉素具有相似的作用機制和化學結構，副豬嗜血桿菌對青霉素的耐藥機制同樣適用于它們。此外，長期使用這類抗生素也可能導致細菌細胞壁上青霉素結合蛋白（PBPs）的結構發(fā)生改變，降低其與抗生素的親和力，從而產生耐藥性。頭孢噻肟和頭孢曲松作為第三代頭孢菌素，分離株對它們的耐藥率相對較低，分別為22.9%和20.0%。這可能是由于它們對β-內酰胺酶相對穩(wěn)定，能夠在一定程度上抵抗副豬嗜血桿菌產生的β-內酰胺酶的水解作用。然而，隨著頭孢菌素類藥物的廣泛使用，也不能忽視副豬嗜血桿菌對它們耐藥性逐漸增加的風險。在氨基糖苷類藥物中，慶大霉素、卡那霉素和鏈霉素的耐藥率分別為51.4%、48.6%和54.3%，耐藥情況較為普遍。氨基糖苷類藥物主要通過與細菌核糖體30S亞基結合，干擾細菌蛋白質的合成。副豬嗜血桿菌對這類藥物產生耐藥的機制可能是產生氨基糖苷類鈍化酶，如乙酰轉移酶、磷酸轉移酶和核苷轉移酶等，這些酶能夠修飾氨基糖苷類藥物的結構，使其失去與核糖體結合的能力，從而產生耐藥性。四環(huán)素和土霉素同屬四環(huán)素類藥物，耐藥率分別為68.6%和65.7%，顯示出較高的耐藥性。四環(huán)素類藥物的作用機制是與細菌核糖體30S亞基的A位結合，阻止氨基酰-tRNA進入A位，從而抑制細菌蛋白質的合成。副豬嗜血桿菌對四環(huán)素類藥物產生耐藥的原因可能是細胞膜通透性改變，減少藥物進入菌體；或者通過外排泵將藥物排出菌體；還可能是核糖體保護蛋白的表達增加，使四環(huán)素類藥物無法與核糖體結合。對于大環(huán)內酯類藥物，紅霉素和阿奇霉素的耐藥率分別為71.4%和65.7%，耐藥問題較為突出。大環(huán)內酯類藥物主要通過與細菌核糖體50S亞基的23SrRNA結合，抑制細菌蛋白質的合成。副豬嗜血桿菌對大環(huán)內酯類藥物產生耐藥的機制可能是核糖體靶位改變，即23SrRNA上的腺嘌呤殘基發(fā)生甲基化，導致藥物與核糖體的親和力降低；也可能是產生外排泵，將藥物排出菌體?？肆置顾氐哪退幝蕿?2.9%，也有較多分離株對其耐藥。克林霉素屬于林可酰胺類抗生素，作用機制與大環(huán)內酯類藥物相似，都是作用于細菌核糖體50S亞基。因此，副豬嗜血桿菌對克林霉素的耐藥機制可能與大環(huán)內酯類藥物類似。氟苯尼考作為酰胺醇類藥物，耐藥率為31.4%，相對其他一些藥物，耐藥情況相對較輕。但近年來，隨著氟苯尼考在獸醫(yī)臨床上的廣泛應用，也出現了氟苯尼考耐藥株。研究發(fā)現，外排泵基因floR是介導副豬嗜血桿菌對氟苯尼考耐藥的分子機制之一，攜帶耐藥基因floR的質粒通過發(fā)生重組，使副豬嗜血桿菌進化出氟苯尼考耐藥株。恩諾沙星和環(huán)丙沙星屬于喹諾酮類藥物，耐藥率分別為42.9%和40.0%，說明副豬嗜血桿菌對喹諾酮類藥物也產生了一定程度的耐藥性。喹諾酮類藥物的作用機制是抑制細菌DNA旋轉酶（gyrA和gyrB基因編碼）和拓撲異構酶Ⅳ（parC和parE基因編碼），從而阻礙細菌DNA的復制和轉錄。副豬嗜血桿菌對喹諾酮類藥物產生耐藥的機制主要是喹諾酮耐藥決定區(qū)（QRDR）上的基因突變，導致DNA旋轉酶和拓撲異構酶Ⅳ的結構改變，降低藥物與靶位的親和力。研究表明，gyrA基因編碼的Ser83→Leu和Asp87→Asn突變位點以及parC基因編碼的Ser80→Ile和Glu84→Lys突變位點與喹諾酮類藥物耐藥密切相關。綜合來看，本地區(qū)副豬嗜血桿菌的耐藥形勢嚴峻，多重耐藥現象普遍。這不僅與抗生素的濫用有關，還與耐藥基因的傳播密切相關。細菌之間可以通過可移動基因元件，如質粒、轉座子和整合子等，傳播耐藥基因，使耐藥基因在不同菌株之間擴散，從而導致耐藥性的廣泛流行。此外，養(yǎng)豬場的飼養(yǎng)管理水平、衛(wèi)生條件以及豬群的健康狀況等因素也會影響副豬嗜血桿菌的耐藥性。在飼養(yǎng)管理不善、衛(wèi)生條件差的豬場，豬群容易感染各種病原體，為了控制疾病，往往會大量使用抗生素，這進一步加劇了耐藥性的產生。本地區(qū)副豬嗜血桿菌分離株的耐藥性問題亟待解決。在臨床治療中，應根據藥敏試驗結果合理選擇抗菌藥物，避免濫用抗生素，減少耐藥菌株的產生。同時，加強對養(yǎng)豬場的管理，改善飼養(yǎng)環(huán)境，提高豬群的免疫力，也是控制副豬嗜血桿菌病和耐藥性的重要措施。此外，深入研究副豬嗜血桿菌的耐藥機制，開發(fā)新的抗菌藥物和治療方法，對于解決耐藥性問題具有重要意義。4.3研究結果對副豬嗜血桿菌病防控的指導意義本研究的血清分型和耐藥性檢測結果，為副豬嗜血桿菌病的防控提供了重要的科學依據，在疫苗選擇、藥物使用和綜合防控措施制定等方面具有重要的指導意義。在疫苗選擇方面，本地區(qū)副豬嗜血桿菌的優(yōu)勢血清型為血清5型和血清4型，同時血清12型、13型和15型也有一定比例的分布。由于不同血清型之間缺乏免疫交叉保護能力，因此在選擇疫苗時，應優(yōu)先選擇包含本地區(qū)主要流行血清型的疫苗。例如，可選擇含有血清4型、5型的二價疫苗，或包含血清4型、5型、12型、13型、15型的多價疫苗，以提高疫苗的免疫效果，增強豬群對副豬嗜血桿菌的抵抗力。同時，對于無法分型的菌株，雖然占比較小，但也需要進一步研究其免疫原性和致病性，以便在疫苗研發(fā)中考慮這些因素，確保疫苗能夠覆蓋更多的菌株，提供更全面的保護。在藥物使用方面，本研究中副豬嗜血桿菌分離株對多種常用抗菌藥物表現出不同程度的耐藥性，且多重耐藥現象較為普遍。因此，在臨床治療中，應避免盲目使用抗生素，而是根據藥敏試驗結果合理選擇抗菌藥物。對于本地區(qū)的副豬嗜血桿菌感染，由于對青霉素、氨芐西林、阿莫西林等耐藥率較高，應盡量避免使用這些藥物。而頭孢噻肟和頭孢曲松的耐藥率相對較低，可以作為治療的選擇之一。對于氨基糖苷類、四環(huán)素類、大環(huán)內酯類等藥物，也應根據藥敏結果謹慎使用。同時，為了減少耐藥菌株的產生，應嚴格控制抗生素的使用劑量和療程，避免長期、大量使用同一類抗生素。還可以采用聯(lián)合用藥的方式，提高治療效果，降低耐藥性的產生風險。在綜合防控措施制定方面，除了疫苗接種和合理用藥外，還應加強飼養(yǎng)管理，改善豬群的生活環(huán)境。保持豬舍的清潔衛(wèi)生，定期進行消毒，減少病原體的滋生和傳播。合理控制飼養(yǎng)密度，避免豬只過度擁擠，減少應激因素。提供營養(yǎng)均衡的飼料，增強豬群的免疫力，提高豬只對疾病的抵抗力。加強豬群的健康監(jiān)測，及時發(fā)現和隔離病豬，防止疾病的傳播和擴散。同時，應避免豬群與其他病原體的混合感染，如豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型等，減少副豬嗜血桿菌病的發(fā)生誘因。通過本研究的血清分型和耐藥性檢測結果，我們可以有針對性地制定副豬嗜血桿菌病的防控策略，提高防控效果，減少疾病對養(yǎng)豬業(yè)的危害，保障養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。五、結論與展望5.1研究結論本研究成功從[具體地區(qū)]多個規(guī)模化豬場的50份疑似病豬病料中，通過嚴格的細菌分離培養(yǎng)、染色鏡檢、生化鑒定以及PCR檢測等方法，分離得到35株副豬嗜血桿菌。利用玻片凝集反應、分型試紙條檢測和分子血清分型技術，對這35株分離株進行血清型鑒定，明確了本地區(qū)副豬嗜血桿菌的血清型分布情況。其中，血清5型為優(yōu)勢血清型，占比34.3%，血清4型次之，占比28.6%，血清12型、13型和15型也有一定比例的分布，分別占比14.3%、11.