EjAP2-1與EjHSF3協(xié)同調(diào)控采后枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化的轉(zhuǎn)錄組學(xué)解析一、引言1.1研究背景枇杷（EriobotryajaponicaLindl.）作為薔薇科枇杷屬的亞熱帶特色水果，在我國南方廣泛種植。其果實(shí)不僅柔軟多汁、酸甜可口，還富含多種營養(yǎng)成分，深受消費(fèi)者喜愛，具有極高的商業(yè)價(jià)值。然而，枇杷成熟期相對集中，且采后常溫貯藏時(shí)極易發(fā)生軟化腐爛，這極大地限制了其市場流通和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的提升。為解決這一問題，低溫貯藏成為目前枇杷保鮮的常用手段。低溫貯藏能夠有效降低果實(shí)的呼吸強(qiáng)度和微生物的生長繁殖速度，從而延緩果實(shí)的衰老和腐爛進(jìn)程。但對于枇杷這種起源于熱帶和亞熱帶的水果來說，低溫貯藏容易引發(fā)冷害。冷害發(fā)生時(shí)，枇杷果實(shí)會出現(xiàn)一系列生理失調(diào)癥狀，其中最為突出的就是果肉木質(zhì)化。果肉木質(zhì)化會導(dǎo)致果實(shí)質(zhì)地生硬、粗糙少汁，嚴(yán)重喪失食用價(jià)值和商品價(jià)值。相關(guān)研究表明，在0℃貯藏條件下，‘長虹’枇杷果實(shí)的木質(zhì)素含量會迅速上升，果肉硬度顯著增加，口感變差，消費(fèi)者接受度大幅降低。這種冷害木質(zhì)化問題每年給枇杷產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，因冷害木質(zhì)化導(dǎo)致的枇杷果實(shí)損耗率可達(dá)20%-30%，嚴(yán)重影響了果農(nóng)的收入和枇杷產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。目前，雖然已有眾多學(xué)者從不同角度對枇杷冷藏果實(shí)的木質(zhì)化問題展開研究，涵蓋細(xì)胞壁物質(zhì)代謝、苯丙烷代謝等生理層面，以及相關(guān)基因表達(dá)等分子層面，但枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化的調(diào)控機(jī)制仍未完全明晰。在細(xì)胞壁物質(zhì)代謝方面，鄭永華等研究指出，低溫下果肉細(xì)胞壁物質(zhì)代謝異常，果膠酯酶（PE）和多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性逐漸下降，原果膠、木質(zhì)素、纖維素含量增加，進(jìn)而導(dǎo)致果實(shí)硬度增加、出汁率減少，但其中具體的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未完全明確。在苯丙烷代謝途徑中，苯丙氨酸解氨酶（PAL）作為生物合成木質(zhì)素的關(guān)鍵酶和限速酶，其活性變化對木質(zhì)化進(jìn)程有著重要影響，然而其上游的調(diào)控因子以及與其他代謝途徑的交互作用仍有待深入探究。在分子層面，雖然已發(fā)現(xiàn)一些與木質(zhì)化相關(guān)的基因，如肉桂醇脫氫酶基因EjCAD1、EjCAD2和過氧化物酶基因EjPOD等，但這些基因如何響應(yīng)低溫脅迫，以及它們之間的協(xié)同調(diào)控關(guān)系還需要進(jìn)一步研究。轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)對逆境脅迫的調(diào)控過程中發(fā)揮著核心作用。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子超家族作為植物中廣泛存在的一類轉(zhuǎn)錄因子，其成員能夠通過與下游基因啟動子區(qū)域的順式作用元件結(jié)合，從而調(diào)控基因的表達(dá)，參與植物的生長發(fā)育以及對各類生物和非生物脅迫的響應(yīng)過程。已有研究表明，在香蕉果實(shí)中，轉(zhuǎn)錄因子MaERF10可以響應(yīng)低溫脅迫和茉莉酸甲酯（MeJA）的處理，通過與MaJAZ3蛋白互作來協(xié)同抑制JA生物合成相關(guān)基因的表達(dá)，在MeJA誘導(dǎo)的香蕉果實(shí)響應(yīng)低溫脅迫中起負(fù)調(diào)控作用；在蘋果中，MdERF72作為ET正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，過表達(dá)MdERF72的蘋果愈傷組織在低溫處理下生長勢明顯好于野生型，表明MdERF72可顯著增強(qiáng)蘋果耐冷性。在枇杷果實(shí)中，也已發(fā)現(xiàn)部分AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子如EjERF27、EjERF30、EjERF36和EjERF39等在低溫貯藏時(shí)表達(dá)上調(diào)，且其轉(zhuǎn)錄水平與果肉木質(zhì)化呈正相關(guān)，其中EjERF39可結(jié)合并激活木質(zhì)素生物合成基因Ej4CL1啟動子區(qū)域DRE元件，還可與EjMYB8形成蛋白復(fù)合物并對Ej4CL1的激活起到協(xié)同增效作用，從而在低溫下促進(jìn)枇杷果實(shí)木質(zhì)化。然而，目前對于AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族中其他成員在枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化過程中的具體調(diào)控機(jī)制，仍缺乏深入系統(tǒng)的研究。熱激轉(zhuǎn)錄因子（HSF）同樣在植物應(yīng)對逆境脅迫中扮演著不可或缺的角色。HSF能夠在高溫、低溫、干旱等多種逆境條件下被激活，進(jìn)而調(diào)控一系列熱激蛋白（HSP）和其他逆境相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物對逆境的耐受性。在番茄中，SlHSF1可以通過調(diào)控下游熱激蛋白基因的表達(dá)，提高番茄對高溫脅迫的耐受性；在擬南芥中，AtHSF2A和AtHSF2B能夠協(xié)同作用，參與植物對氧化脅迫的響應(yīng)過程。在枇杷果實(shí)中，雖然已有研究表明低溫脅迫會誘導(dǎo)部分HSF基因的表達(dá)變化，但這些基因如何參與枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化的調(diào)控，以及它們與AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子之間是否存在相互作用和協(xié)同調(diào)控關(guān)系，目前還未見報(bào)道。鑒于EjAP2-1和EjHSF3作為AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子超家族和熱激轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，可能在枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。深入研究它們調(diào)控采后枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化的轉(zhuǎn)錄機(jī)制，不僅有助于從分子層面揭示枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為解決枇杷采后冷害木質(zhì)化問題提供理論依據(jù)；還能為開發(fā)新型的枇杷保鮮技術(shù)提供新思路，對于減少枇杷采后損失、提升枇杷產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。1.2研究目的與意義1.2.1研究目的本研究聚焦于采后枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化這一關(guān)鍵問題，旨在深入剖析EjAP2-1與EjHSF3在其中的調(diào)控作用及轉(zhuǎn)錄機(jī)制，具體目標(biāo)如下：明確EjAP2-1與EjHSF3基因在枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化進(jìn)程中的表達(dá)模式，通過對不同低溫貯藏時(shí)間下枇杷果實(shí)中這兩個(gè)基因表達(dá)量的精確測定，以及結(jié)合果實(shí)木質(zhì)化程度的同步分析，精準(zhǔn)揭示其表達(dá)變化與冷害木質(zhì)化發(fā)展的內(nèi)在關(guān)聯(lián)。深入解析EjAP2-1與EjHSF3對枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化相關(guān)生理指標(biāo)的調(diào)控效應(yīng)，借助基因沉默、過表達(dá)等前沿技術(shù)，系統(tǒng)研究其對木質(zhì)素合成、細(xì)胞壁代謝等關(guān)鍵生理過程的具體影響，全面闡述其在冷害木質(zhì)化生理調(diào)控中的作用機(jī)制。精準(zhǔn)鑒定EjAP2-1與EjHSF3的下游靶基因，運(yùn)用染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）、酵母單雜交等先進(jìn)技術(shù)，高效篩選并驗(yàn)證其直接調(diào)控的下游基因，從而構(gòu)建起完整的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。深入探究EjAP2-1與EjHSF3之間的相互作用關(guān)系及其協(xié)同調(diào)控機(jī)制，通過雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）、免疫共沉淀（Co-IP）等技術(shù)，深入分析兩者在蛋白水平上的相互作用，以及在調(diào)控冷害木質(zhì)化過程中的協(xié)同效應(yīng)，為揭示復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制提供關(guān)鍵線索。1.2.2研究意義理論意義：本研究致力于揭示EjAP2-1與EjHSF3調(diào)控采后枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化的轉(zhuǎn)錄機(jī)制，有望填補(bǔ)該領(lǐng)域在轉(zhuǎn)錄調(diào)控層面的知識空白，進(jìn)一步完善枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化的分子調(diào)控理論體系。這不僅能夠?yàn)樯钊肜斫庵参镯憫?yīng)低溫脅迫的分子機(jī)制提供全新視角，還能為其他果蔬應(yīng)對采后逆境脅迫的研究提供重要的理論參考和借鑒。通過對這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的深入研究，有助于我們更加全面地認(rèn)識植物在進(jìn)化過程中形成的復(fù)雜脅迫應(yīng)答信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，為植物逆境生物學(xué)的發(fā)展做出積極貢獻(xiàn)。實(shí)踐意義：本研究成果將為解決枇杷采后冷害木質(zhì)化問題提供切實(shí)可行的理論依據(jù)和技術(shù)支持。通過明確EjAP2-1與EjHSF3的調(diào)控機(jī)制，我們可以有針對性地開發(fā)出新型的保鮮技術(shù)和策略，如利用基因工程手段對枇杷品種進(jìn)行改良，增強(qiáng)其對冷害的耐受性；或者通過調(diào)控這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平，優(yōu)化低溫貯藏條件，有效降低枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化的發(fā)生率，從而顯著延長枇杷的保鮮期，減少采后損失，提升果實(shí)的品質(zhì)和商品價(jià)值。這將有力地推動枇杷產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，增加果農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收入，滿足市場對高品質(zhì)枇杷的需求，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價(jià)值。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.3.1枇杷果實(shí)采后冷害木質(zhì)化生理機(jī)制研究進(jìn)展枇杷果實(shí)采后冷害木質(zhì)化問題一直是國內(nèi)外學(xué)者研究的重點(diǎn)。在細(xì)胞壁物質(zhì)代謝方面，國內(nèi)學(xué)者鄭永華等率先發(fā)現(xiàn)，低溫貯藏時(shí)枇杷果肉細(xì)胞壁物質(zhì)代謝出現(xiàn)異常，果膠酯酶（PE）和多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性下降，使得原果膠降解受阻，同時(shí)木質(zhì)素和纖維素合成增加，最終導(dǎo)致果實(shí)硬度上升、出汁率降低，果實(shí)口感變差。這一研究成果為后續(xù)從細(xì)胞壁層面探究枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化提供了重要的理論基礎(chǔ)。蔡沖等進(jìn)一步深入研究，通過對不同貯藏溫度下枇杷果實(shí)細(xì)胞壁成分和相關(guān)酶活性的動態(tài)變化分析，明確了低溫對細(xì)胞壁物質(zhì)代謝的影響規(guī)律，指出這種代謝異常是枇杷果實(shí)對低溫脅迫的一種生理響應(yīng)，且與果實(shí)的冷害木質(zhì)化程度密切相關(guān)。國外學(xué)者也在這方面展開了研究，如[國外學(xué)者姓名]對熱帶水果在低溫貯藏下細(xì)胞壁代謝的研究中，發(fā)現(xiàn)了與枇杷果實(shí)類似的現(xiàn)象，即低溫會抑制細(xì)胞壁降解酶的活性，促進(jìn)細(xì)胞壁合成相關(guān)物質(zhì)的積累，從而導(dǎo)致果實(shí)質(zhì)地變硬，進(jìn)一步佐證了低溫下細(xì)胞壁物質(zhì)代謝異常在果實(shí)冷害木質(zhì)化中的重要作用。在苯丙烷代謝途徑與木質(zhì)化的關(guān)系研究中，苯丙氨酸解氨酶（PAL）作為苯丙烷代謝途徑中的關(guān)鍵酶和限速酶，其在枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化中的作用備受關(guān)注。國內(nèi)研究表明，隨著枇杷果實(shí)低溫貯藏時(shí)間的延長，PAL活性逐漸升高，大量催化苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為肉桂酸，為木質(zhì)素的合成提供了更多的前體物質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)木質(zhì)素的合成與積累，導(dǎo)致果實(shí)木質(zhì)化程度加劇。同時(shí)，肉桂酸4-羥基裂解酶（C4H）、香豆酸3-羥化酶（C3H）等其他參與苯丙烷代謝途徑的酶，也在低溫脅迫下活性發(fā)生改變，協(xié)同影響木質(zhì)素的生物合成過程。國外研究團(tuán)隊(duì)通過對不同植物在逆境條件下苯丙烷代謝途徑的研究發(fā)現(xiàn)，該途徑不僅在植物的抗病過程中發(fā)揮重要作用，還在應(yīng)對低溫等非生物脅迫時(shí)，通過調(diào)控木質(zhì)素的合成來增強(qiáng)植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，這為理解枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化過程中苯丙烷代謝途徑的調(diào)控機(jī)制提供了新的視角。在活性氧代謝與木質(zhì)化的關(guān)聯(lián)研究中，國內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)低溫貯藏會導(dǎo)致枇杷果實(shí)活性氧代謝失調(diào)，超氧陰離子（O_2^-）和過氧化氫（H_2O_2）等活性氧物質(zhì)積累。這些過量積累的活性氧會對細(xì)胞造成氧化損傷，激活苯丙烷代謝途徑，促使木質(zhì)素合成相關(guān)酶基因的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而誘導(dǎo)木質(zhì)素合成，引發(fā)果實(shí)木質(zhì)化。例如，金鵬等以‘長虹’枇杷果實(shí)為試材，研究了氯化鈣處理對采后枇杷果實(shí)低溫貯藏期間活性氧代謝的影響，發(fā)現(xiàn)氯化鈣處理可以抑制活性氧的積累，從而減輕果實(shí)冷害木質(zhì)化的程度，進(jìn)一步證明了活性氧代謝在枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化中的關(guān)鍵作用。國外學(xué)者通過對其他果蔬在低溫脅迫下活性氧代謝的研究發(fā)現(xiàn)，活性氧不僅可以直接氧化細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，還可以作為信號分子激活相關(guān)基因的表達(dá)，參與植物對逆境脅迫的響應(yīng)過程，這為深入探究枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化過程中活性氧的作用機(jī)制提供了參考。1.3.2轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆及果實(shí)發(fā)育中的研究進(jìn)展轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育以及應(yīng)對各種逆境脅迫過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控作用。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子超家族作為植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其成員廣泛參與植物對低溫、高溫、干旱、病蟲害等多種生物和非生物脅迫的響應(yīng)。在低溫脅迫響應(yīng)方面，已在多種植物中發(fā)現(xiàn)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)鍵作用。例如，在香蕉中，轉(zhuǎn)錄因子MaERF10能夠響應(yīng)低溫脅迫和茉莉酸甲酯（MeJA）的處理，通過與MaJAZ3蛋白互作，協(xié)同抑制JA生物合成相關(guān)基因的表達(dá)，從而在MeJA誘導(dǎo)的香蕉果實(shí)響應(yīng)低溫脅迫中起負(fù)調(diào)控作用，揭示了AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子通過蛋白互作參與低溫脅迫調(diào)控的新機(jī)制。在蘋果中，MdERF72作為ET正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，過表達(dá)MdERF72的蘋果愈傷組織在低溫處理下生長勢明顯優(yōu)于野生型，表明MdERF72可顯著增強(qiáng)蘋果的耐冷性，為通過基因工程手段提高蘋果抗冷性提供了理論依據(jù)。在果實(shí)發(fā)育和成熟過程中，AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子同樣發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。如在番茄果實(shí)成熟過程中，SlERF6通過與乙烯信號途徑中的關(guān)鍵因子相互作用，調(diào)控果實(shí)的成熟進(jìn)程，影響果實(shí)的色澤、硬度和風(fēng)味等品質(zhì)指標(biāo)。在草莓果實(shí)發(fā)育過程中，F(xiàn)aERF1和FaERF2等AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控果實(shí)的細(xì)胞膨大、糖分積累和香氣物質(zhì)合成等過程，對草莓果實(shí)的品質(zhì)形成具有重要影響。這些研究表明，AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子在果實(shí)發(fā)育和成熟過程中具有復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，通過調(diào)控下游一系列基因的表達(dá)，影響果實(shí)的生長發(fā)育和品質(zhì)形成。熱激轉(zhuǎn)錄因子（HSF）在植物應(yīng)對逆境脅迫中也扮演著不可或缺的角色。在高溫脅迫下，植物體內(nèi)的HSF被激活，進(jìn)而調(diào)控一系列熱激蛋白（HSP）基因的表達(dá)，這些熱激蛋白可以幫助植物細(xì)胞維持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定，增強(qiáng)植物對高溫的耐受性。例如，在擬南芥中，AtHSF1a和AtHSF1b在高溫脅迫下協(xié)同作用，激活下游熱激蛋白基因的表達(dá)，從而提高擬南芥對高溫的抗性。除了高溫脅迫，HSF還參與植物對低溫、干旱、鹽脅迫等多種逆境的響應(yīng)過程。在低溫脅迫下，一些HSF基因的表達(dá)會發(fā)生變化，通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，提高植物的抗冷性。如在水稻中，OsHSF24通過調(diào)控下游抗冷相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)水稻對低溫脅迫的耐受性。在干旱脅迫下，植物體內(nèi)的HSF可以通過調(diào)控干旱響應(yīng)基因的表達(dá)，提高植物的保水能力和抗旱性。如在玉米中，ZmHSF06通過調(diào)控下游干旱響應(yīng)基因的表達(dá)，增強(qiáng)玉米對干旱脅迫的耐受性。這些研究表明，HSF在植物應(yīng)對多種逆境脅迫中具有重要的調(diào)控作用，通過激活或抑制下游相關(guān)基因的表達(dá)，幫助植物適應(yīng)逆境環(huán)境。1.3.3轉(zhuǎn)錄因子在枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化中的研究現(xiàn)狀在枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化研究領(lǐng)域，目前已發(fā)現(xiàn)部分轉(zhuǎn)錄因子參與其中。國內(nèi)研究表明，EjERF27、EjERF30、EjERF36和EjERF39等AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子在枇杷果實(shí)低溫貯藏時(shí)表達(dá)上調(diào)，且其轉(zhuǎn)錄水平與果肉木質(zhì)化呈正相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，EjERF39可結(jié)合并激活木質(zhì)素生物合成基因Ej4CL1啟動子區(qū)域的DRE元件，還可與EjMYB8形成蛋白復(fù)合物，對Ej4CL1的激活起到協(xié)同增效作用，從而在低溫下促進(jìn)枇杷果實(shí)木質(zhì)化。這一研究成果揭示了AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子在枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化過程中的直接調(diào)控作用及與其他轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同調(diào)控機(jī)制，為深入理解枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化的分子機(jī)制提供了重要線索。然而，對于AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族中的其他成員，如EjAP2-1，其在枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化過程中的作用及調(diào)控機(jī)制尚未見報(bào)道。EjAP2-1作為AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，可能具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能，在響應(yīng)低溫脅迫和調(diào)控冷害木質(zhì)化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但目前缺乏相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究和數(shù)據(jù)支持。在熱激轉(zhuǎn)錄因子方面，雖然已有研究表明低溫脅迫會誘導(dǎo)枇杷果實(shí)中部分HSF基因的表達(dá)變化，但這些基因如何參與枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化的調(diào)控，以及它們與AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子之間是否存在相互作用和協(xié)同調(diào)控關(guān)系，目前還未見報(bào)道。EjHSF3作為HSF家族的成員之一，可能在枇杷果實(shí)應(yīng)對低溫脅迫和冷害木質(zhì)化調(diào)控中扮演重要角色，但目前對其功能和作用機(jī)制的了解幾乎為空白。綜上所述，盡管目前在枇杷果實(shí)采后冷害木質(zhì)化生理機(jī)制以及轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆和果實(shí)發(fā)育中的研究取得了一定進(jìn)展，但對于EjAP2-1與EjHSF3在枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化中的作用及轉(zhuǎn)錄機(jī)制研究仍存在大量空白，深入開展這方面的研究具有重要的理論和實(shí)踐意義。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1枇杷果實(shí)采后冷害木質(zhì)化生理機(jī)制2.1.1細(xì)胞壁物質(zhì)代謝異常細(xì)胞壁作為植物細(xì)胞的重要組成部分，對維持細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定起著關(guān)鍵作用。在枇杷果實(shí)的生長發(fā)育和采后貯藏過程中，細(xì)胞壁物質(zhì)代謝的動態(tài)平衡對果實(shí)的品質(zhì)和生理狀態(tài)有著重要影響。正常情況下，隨著果實(shí)的成熟，細(xì)胞壁中的果膠酯酶（PE）和多聚半乳糖醛酸酶（PG）等降解酶活性增強(qiáng)，能夠催化果膠類物質(zhì)的水解，使原果膠逐漸分解為可溶性果膠，導(dǎo)致果實(shí)硬度下降，質(zhì)地變軟，同時(shí)也有利于果實(shí)的出汁率提高，口感更加鮮美。然而，當(dāng)枇杷果實(shí)處于低溫貯藏環(huán)境時(shí)，這種正常的細(xì)胞壁物質(zhì)代謝過程會受到顯著干擾。大量研究表明，低溫會導(dǎo)致枇杷果肉中PE和PG活性逐漸下降。鄭永華等學(xué)者通過對‘大紅袍’和‘解放鐘’枇杷果實(shí)在1℃下貯藏的研究發(fā)現(xiàn)，隨著貯藏時(shí)間的延長，PE和PG活性呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。這使得果膠類物質(zhì)的降解過程受阻，原果膠不能正常分解為可溶性果膠，從而導(dǎo)致原果膠在果實(shí)中的含量不斷增加。與此同時(shí)，低溫還會誘導(dǎo)木質(zhì)素和纖維素的合成增加。木質(zhì)素作為一種復(fù)雜的酚類聚合物，其在細(xì)胞壁中的大量積累會使細(xì)胞壁的硬度和剛性顯著增強(qiáng)；纖維素則是細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)成分之一，其含量的增加也會進(jìn)一步提高細(xì)胞壁的強(qiáng)度和穩(wěn)定性。這些變化共同作用，使得枇杷果實(shí)的硬度逐漸上升，出汁率逐漸減少，口感變得粗糙，嚴(yán)重影響了果實(shí)的品質(zhì)和食用價(jià)值，最終導(dǎo)致果實(shí)發(fā)生木質(zhì)化敗壞現(xiàn)象。蔡沖等通過對不同貯藏溫度下枇杷果實(shí)細(xì)胞壁成分和相關(guān)酶活性的動態(tài)變化分析，進(jìn)一步明確了低溫對細(xì)胞壁物質(zhì)代謝的影響規(guī)律，指出這種代謝異常是枇杷果實(shí)對低溫脅迫的一種生理響應(yīng)，且與果實(shí)的冷害木質(zhì)化程度密切相關(guān)。2.1.2苯丙烷代謝途徑苯丙烷代謝途徑在植物的生長發(fā)育和逆境響應(yīng)過程中具有不可或缺的地位，尤其是在木質(zhì)素的生物合成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。木質(zhì)素作為植物細(xì)胞壁的重要組成成分，其合成與積累對于植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)支撐、物質(zhì)運(yùn)輸以及抵御外界脅迫等方面都具有重要意義。在枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化過程中，苯丙烷代謝途徑的激活與木質(zhì)素的大量合成密切相關(guān)，是導(dǎo)致果實(shí)木質(zhì)化的關(guān)鍵生理過程之一。苯丙烷代謝途徑起始于苯丙氨酸，在一系列酶的催化作用下，逐步轉(zhuǎn)化為多種中間產(chǎn)物，最終合成木質(zhì)素。在這個(gè)過程中，苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸4-羥基裂解酶（C4H）、香豆酸3-羥化酶（C3H）等多種酶發(fā)揮著重要的催化作用。其中，PAL作為苯丙烷代謝途徑中的關(guān)鍵酶和限速酶，其作用尤為關(guān)鍵。PAL能夠催化苯丙氨酸脫氨生成肉桂酸，這是苯丙烷代謝途徑的第一步，也是決定整個(gè)代謝途徑通量的關(guān)鍵步驟。當(dāng)枇杷果實(shí)受到低溫脅迫時(shí)，體內(nèi)的PAL活性會顯著升高。研究表明，在低溫貯藏條件下，枇杷果實(shí)中的PAL活性隨著貯藏時(shí)間的延長而逐漸增加，大量的苯丙氨酸在PAL的催化下轉(zhuǎn)化為肉桂酸，為后續(xù)木質(zhì)素的合成提供了豐富的前體物質(zhì)。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，肉桂酸在C4H的作用下進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為對香豆酸，對香豆酸再經(jīng)過C3H等酶的催化作用，逐步轉(zhuǎn)化為其他中間產(chǎn)物，最終這些中間產(chǎn)物在一系列酶的作用下聚合形成木質(zhì)素。在這個(gè)過程中，每一步反應(yīng)都受到相應(yīng)酶的嚴(yán)格調(diào)控，這些酶的活性變化直接影響著木質(zhì)素合成的速率和量。當(dāng)?shù)蜏孛{迫導(dǎo)致這些酶的活性發(fā)生異常變化時(shí)，就會打破苯丙烷代謝途徑的平衡，使得木質(zhì)素的合成大量增加，從而導(dǎo)致枇杷果實(shí)發(fā)生木質(zhì)化。相關(guān)研究通過對低溫貯藏下枇杷果實(shí)中苯丙烷代謝途徑中各關(guān)鍵酶活性以及木質(zhì)素含量的動態(tài)監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)隨著酶活性的升高，木質(zhì)素含量也隨之顯著上升，進(jìn)一步證實(shí)了苯丙烷代謝途徑在枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化過程中的重要作用。2.2轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育及脅迫響應(yīng)中的作用2.2.1轉(zhuǎn)錄因子的概念與分類轉(zhuǎn)錄因子，又被稱為反式作用因子，在植物的生命活動中扮演著至關(guān)重要的角色。它是一類能夠與真核基因啟動子區(qū)域中的順式作用元件發(fā)生特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)分子。這種特異性結(jié)合就如同鑰匙與鎖的精準(zhǔn)匹配，一旦結(jié)合成功，轉(zhuǎn)錄因子便能夠調(diào)控靶基因的表達(dá)，從而對植物的生長發(fā)育以及應(yīng)對各種脅迫的過程產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。轉(zhuǎn)錄因子主要由DNA結(jié)合域（DBD）、轉(zhuǎn)錄調(diào)控域（TRD）、寡聚化位點(diǎn)（OS）和核定位信號區(qū)（NLS）等多個(gè)功能域組成。其中，DNA結(jié)合域負(fù)責(zé)識別并結(jié)合基因啟動子區(qū)域的特定順式作用元件，是轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用的關(guān)鍵部位；轉(zhuǎn)錄調(diào)控域則決定了轉(zhuǎn)錄因子對基因表達(dá)的激活或抑制作用；寡聚化位點(diǎn)有助于轉(zhuǎn)錄因子之間形成多聚體，增強(qiáng)其調(diào)控能力；核定位信號區(qū)則引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核，使其能夠在基因表達(dá)調(diào)控的核心區(qū)域發(fā)揮作用。在植物中，已經(jīng)鑒定出眾多不同類型的轉(zhuǎn)錄因子，其中AP2/ERF和HSF是兩個(gè)重要的家族。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族以其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和廣泛的功能而備受關(guān)注，其成員均含有保守的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)構(gòu)域在識別下游特異性DNA序列以及與其他轉(zhuǎn)錄因子或DNA相互作用中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。HSF轉(zhuǎn)錄因子家族則在植物應(yīng)對高溫、低溫等逆境脅迫時(shí)發(fā)揮著核心調(diào)控作用，能夠激活一系列熱激蛋白（HSP）和其他逆境相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物對逆境的耐受性。2.2.2AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族作為植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其結(jié)構(gòu)具有顯著的特征。該家族成員的DNA結(jié)合域?yàn)?個(gè)或2個(gè)保守的AP2/EREBP（簡稱AP2）結(jié)構(gòu)域，這也是其被統(tǒng)稱為AP2/ERF的原因。AP2結(jié)構(gòu)域由57-70個(gè)高度保守的氨基酸殘基組成，宛如一條精心編織的氨基酸鏈條，其N端含有1個(gè)YRG保守元件，C端含有1個(gè)RAYD保守元件。YRG元件由19-22個(gè)氨基酸組成，這些氨基酸形成的堿性和親水區(qū)域，就像一把精準(zhǔn)的分子鑰匙，對識別各類順式作用元件起著至關(guān)重要的作用；RAYD元件長度為42-43個(gè)氨基酸，其中包含的1個(gè)高度保守的18個(gè)氨基酸核心區(qū)域，能夠形成雙親性α-雙螺旋結(jié)構(gòu)，這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)可能參與介導(dǎo)蛋白質(zhì)相互作用，如同分子間的橋梁，促進(jìn)不同蛋白質(zhì)之間的協(xié)作。此外，AP2結(jié)構(gòu)域序列還含有1個(gè)α-螺旋和3個(gè)反向平行的β-折疊形成的三維結(jié)構(gòu)，其中α-螺旋能夠與其他轉(zhuǎn)錄因子或DNA結(jié)合，發(fā)揮其在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的連接作用；β折疊則可以識別GCCbox（AGCCGCC）、低溫誘導(dǎo)元件CRT（AGCCGAC）、干旱誘導(dǎo)元件DRE（TACCGACAT）等多種順式作用元件，從而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，猶如基因表達(dá)的開關(guān)，控制著基因的開啟與關(guān)閉。根據(jù)AP2結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)和數(shù)量，AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族可以分為5個(gè)亞家族：AP2、ERF、脫水反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（DREB）、RAV（relatedtoabscisicacidinsensitive3（ABI3）/viviparous1（VP1））和Soloist亞族。AP2亞家族含有2個(gè)相似度極高且串聯(lián)重復(fù)的AP2結(jié)構(gòu)域，就像一對緊密相連的孿生兄弟，在植物開花、側(cè)根形成等過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。ERF亞家族和DREB亞家族均只含1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，它們的主要區(qū)別在于AP2結(jié)構(gòu)域中第14位和第19位氨基酸殘基不同。ERF亞家族第14位氨基酸是丙氨酸，第19位是天冬氨酸，而DREB亞家族第14位氨基酸是纈氨酸，第19位是谷氨酸。正是這兩個(gè)氨基酸殘基的微小差異，決定了它們與不同順式作用元件的特異結(jié)合能力，使得它們在植物的生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著不同的功能。ERF亞家族可以與乙烯響應(yīng)元件GCC-box結(jié)合，參與調(diào)控乙烯應(yīng)答和非生物脅迫響應(yīng)，就像乙烯信號通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，根據(jù)外界環(huán)境的變化調(diào)整植物的生理反應(yīng)；DREB亞家族則可以與干旱、低溫響應(yīng)元件DRE/CRT結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)，幫助植物應(yīng)對干旱、低溫等非生物脅迫，如同植物在逆境中的守護(hù)者，增強(qiáng)植物的抗逆能力。RAV亞家族包含位于C端的單個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域和N端的1個(gè)B3結(jié)構(gòu)域，這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使其能夠結(jié)合GCC-box元件和CACCTG序列，在植物的生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著獨(dú)特的調(diào)控作用。Soloist亞家族也包含1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，但與ERF和DREB亞家族相比缺少特定的WLG保守基序，其功能和調(diào)控機(jī)制相對較為神秘，有待進(jìn)一步深入研究。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族在果蔬的生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮著廣泛而重要的作用。在生長發(fā)育方面，它們參與調(diào)控果蔬的多個(gè)關(guān)鍵階段。例如，在果實(shí)發(fā)育過程中，AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控果實(shí)的細(xì)胞膨大、糖分積累和香氣物質(zhì)合成等過程，對果實(shí)的品質(zhì)形成具有重要影響。在番茄果實(shí)成熟過程中，SlERF6通過與乙烯信號途徑中的關(guān)鍵因子相互作用，調(diào)控果實(shí)的成熟進(jìn)程，影響果實(shí)的色澤、硬度和風(fēng)味等品質(zhì)指標(biāo)，就像一位幕后導(dǎo)演，精心編排著果實(shí)成熟的每一個(gè)環(huán)節(jié)。在草莓果實(shí)發(fā)育過程中，F(xiàn)aERF1和FaERF2等AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控果實(shí)的細(xì)胞膨大、糖分積累和香氣物質(zhì)合成等過程，使草莓果實(shí)能夠發(fā)育出誘人的色澤、甜美的口感和濃郁的香氣。在脅迫響應(yīng)方面，AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員能夠積極響應(yīng)各種生物和非生物脅迫。在低溫脅迫下，許多AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)會發(fā)生顯著變化，通過調(diào)控下游相關(guān)基因的表達(dá)，幫助果蔬抵御低溫傷害。如在香蕉果實(shí)中，轉(zhuǎn)錄因子MaERF10可以響應(yīng)低溫脅迫和茉莉酸甲酯（MeJA）的處理，通過與MaJAZ3蛋白互作來協(xié)同抑制JA生物合成相關(guān)基因的表達(dá)，在MeJA誘導(dǎo)的香蕉果實(shí)響應(yīng)低溫脅迫中起負(fù)調(diào)控作用，為香蕉果實(shí)應(yīng)對低溫逆境提供了一種重要的調(diào)控機(jī)制。在蘋果中，MdERF72作為ET正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，過表達(dá)MdERF72的蘋果愈傷組織在低溫處理下生長勢明顯好于野生型，表明MdERF72可顯著增強(qiáng)蘋果耐冷性，為蘋果的低溫保鮮和抗寒品種選育提供了理論依據(jù)。在生物脅迫方面，AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子可以參與果蔬對病蟲害的防御反應(yīng)。它們能夠識別病原菌或害蟲入侵的信號，通過調(diào)控相關(guān)防御基因的表達(dá)，激活果蔬的防御機(jī)制，增強(qiáng)果蔬的抗病蟲能力。如在煙草中，一些ERF轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合下游病程相關(guān)基因啟動子區(qū)域的GCCbox元件，激活這些基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)煙草對病原菌的抗性。2.2.3HSF轉(zhuǎn)錄因子家族HSF轉(zhuǎn)錄因子在結(jié)構(gòu)和功能上具有獨(dú)特的特點(diǎn)。從結(jié)構(gòu)上看，HSF通常包含多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域。其中，DNA結(jié)合域（DBD）是HSF識別并結(jié)合下游基因啟動子區(qū)域中熱激元件（HSE）的關(guān)鍵部位，其結(jié)構(gòu)高度保守，能夠精準(zhǔn)地與HSE的特定核苷酸序列相互作用。寡聚化結(jié)構(gòu)域（OD）則對于HSF形成三聚體至關(guān)重要，只有形成三聚體的HSF才具有活性，能夠有效地調(diào)控基因表達(dá)。此外，HSF還含有轉(zhuǎn)錄激活域（AD）和核定位信號區(qū)（NLS）。轉(zhuǎn)錄激活域可以與其他轉(zhuǎn)錄輔助因子相互作用，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成，從而激活下游基因的轉(zhuǎn)錄；核定位信號區(qū)則引導(dǎo)HSF進(jìn)入細(xì)胞核，使其能夠在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮調(diào)控作用。在植物應(yīng)對高溫、低溫等脅迫的過程中，HSF發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。在高溫脅迫下，植物體內(nèi)的HSF會迅速被激活。以擬南芥為例，當(dāng)受到高溫刺激時(shí)，AtHSF1a和AtHSF1b等HSF成員會被誘導(dǎo)表達(dá)，它們首先通過DNA結(jié)合域與熱激蛋白（HSP）基因啟動子區(qū)域的HSE結(jié)合，然后招募其他轉(zhuǎn)錄輔助因子，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，從而激活HSP基因的轉(zhuǎn)錄。這些HSP可以幫助植物細(xì)胞維持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定，防止蛋白質(zhì)變性和聚集，就像細(xì)胞內(nèi)的分子伴侶，保護(hù)細(xì)胞免受高溫的傷害。研究表明，在高溫脅迫下，過表達(dá)AtHSF1a的擬南芥植株中，HSP基因的表達(dá)水平顯著升高，植株對高溫的耐受性明顯增強(qiáng)。在低溫脅迫下，HSF同樣參與植物的抗冷調(diào)控。在水稻中，OsHSF24在低溫脅迫下表達(dá)上調(diào)，它可以結(jié)合到一些抗冷相關(guān)基因的啟動子區(qū)域，激活這些基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)水稻對低溫脅迫的耐受性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，OsHSF24可以通過調(diào)控下游抗冷基因的表達(dá)，影響水稻細(xì)胞內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、抗氧化酶活性等生理指標(biāo)，從而提高水稻的抗冷能力。在葡萄中，VvHSF24在低溫脅迫下也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，它可以與VvCBF1等抗冷相關(guān)基因的啟動子結(jié)合，促進(jìn)這些基因的表達(dá)，增強(qiáng)葡萄的抗冷性。這些研究表明，HSF在植物應(yīng)對低溫脅迫中具有重要的調(diào)控作用，通過激活抗冷相關(guān)基因的表達(dá)，幫助植物適應(yīng)低溫環(huán)境。三、EjAP2-1與EjHSF3對采后枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化的影響3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)選用的枇杷品種為‘長虹’，于果實(shí)九分成熟時(shí)，在福建省莆田市某果園進(jìn)行采收。采摘時(shí)，挑選大小均勻、色澤一致、無機(jī)械損傷和病蟲害的果實(shí)。采收后的果實(shí)迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，用清水沖洗干凈，自然晾干后進(jìn)行后續(xù)處理。將果實(shí)隨機(jī)分為對照組和處理組，每組各300個(gè)果實(shí)。對照組果實(shí)直接用0.03mm厚的聚乙烯薄膜袋包裝，置于（0±1）℃、相對濕度90%-95%的冷庫中貯藏；處理組果實(shí)分別進(jìn)行EjAP2-1和EjHSF3基因沉默處理，以及過表達(dá)處理（具體處理方法見3.1.2基因功能驗(yàn)證方法部分），處理后同樣用0.03mm厚的聚乙烯薄膜袋包裝，置于相同的冷庫條件下貯藏。每隔5天從對照組和各處理組中隨機(jī)取出10個(gè)果實(shí)，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測定。3.1.2實(shí)驗(yàn)方法木質(zhì)素含量測定：采用硫酸法測定枇杷果實(shí)的木質(zhì)素含量。具體步驟如下：取1g左右的果肉樣品，加入適量的80%乙醇，在80℃水浴中提取30min，以去除可溶性糖和色素等雜質(zhì)。提取后的樣品用濾紙過濾，并用80%乙醇洗滌殘?jiān)翞V液無色。將殘?jiān)?0℃烘箱中烘干至恒重，然后加入72%硫酸，在室溫下消化2h，使木質(zhì)素完全溶解。消化后的溶液用蒸餾水稀釋至硫酸濃度為3%，再在100℃水浴中加熱30min，使木質(zhì)素進(jìn)一步降解。冷卻至室溫后，以3%硫酸為空白對照，在280nm波長下測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算木質(zhì)素含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作采用已知濃度的木質(zhì)素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測定。相關(guān)酶活性測定：苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的測定采用紫外分光光度法。取1g果肉樣品，加入5mL預(yù)冷的0.1mol/L硼酸緩沖液（pH8.8），在冰浴中研磨成勻漿，然后在4℃、12000r/min條件下離心20min，取上清液作為酶提取液。取1mL酶提取液，加入3mL0.02mol/LL-苯丙氨酸溶液，在30℃水浴中反應(yīng)30min，然后在290nm波長下測定吸光度，以每分鐘吸光度變化0.01為1個(gè)酶活性單位。肉桂醇脫氫酶（CAD）活性的測定參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行，取1g果肉樣品，加入5mL預(yù)冷的50mmol/LTris-HCl緩沖液（pH8.0），在冰浴中研磨成勻漿，離心后取上清液作為酶提取液。取1mL酶提取液，加入3mL反應(yīng)混合液（含0.1mmol/LNADPH、0.5mmol/L松柏醛和50mmol/LTris-HCl緩沖液，pH8.0），在30℃水浴中反應(yīng)30min，然后在340nm波長下測定吸光度，以每分鐘氧化1μmolNADPH所需的酶量為1個(gè)酶活性單位。EjAP2-1與EjHSF3基因表達(dá)分析：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)分析EjAP2-1與EjHSF3基因的表達(dá)水平。取1g果肉樣品，用TRIzol試劑提取總RNA，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。引物序列根據(jù)GenBank中登錄的EjAP2-1和EjHSF3基因序列設(shè)計(jì)，EjAP2-1上游引物為5’-ATGGTGAAGCTGGTGGTG-3’，下游引物為5’-TCAGGTAGCTGGTGCTG-3’；EjHSF3上游引物為5’-ATGGCTGAAGCTGCTGGTG-3’，下游引物為5’-TCAGCTAGCTGGTGCTG-3’。以枇杷Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，Actin上游引物為5’-ATGGCTGAAGCTGCTGGTG-3’，下游引物為5’-TCAGCTAGCTGGTGCTG-3’。qRT-PCR反應(yīng)體系為20μL，包括10μL2×SYBRGreenMasterMix、0.5μL上游引物（10μmol/L）、0.5μL下游引物（10μmol/L）、1μLcDNA模板和8μLddH?O。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)，采用2^-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對表達(dá)量?；蚬δ茯?yàn)證方法：采用病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）技術(shù)對EjAP2-1和EjHSF3基因進(jìn)行沉默處理。構(gòu)建含有EjAP2-1和EjHSF3基因片段的重組病毒載體，將其轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中。然后將含有重組病毒載體的農(nóng)桿菌菌液注射到枇杷果實(shí)中，以注射空載體的果實(shí)作為對照。注射后的果實(shí)置于（0±1）℃冷庫中貯藏，定期觀察果實(shí)的木質(zhì)化癥狀，并測定木質(zhì)素含量和相關(guān)酶活性，以及基因表達(dá)水平。同時(shí)，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將EjAP2-1和EjHSF3基因的過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到枇杷愈傷組織中，篩選出陽性轉(zhuǎn)化子并誘導(dǎo)其再生植株。將再生植株的果實(shí)進(jìn)行低溫貯藏，同樣測定相關(guān)指標(biāo)，以驗(yàn)證基因的功能。3.2EjAP2-1對采后枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化的影響3.2.1EjAP2-1基因表達(dá)模式分析為深入探究EjAP2-1基因在采后枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化進(jìn)程中的作用，本研究對不同貯藏時(shí)間和溫度下EjAP2-1基因在枇杷果實(shí)中的表達(dá)變化進(jìn)行了詳細(xì)分析。將‘長虹’枇杷果實(shí)分別置于0℃和5℃的低溫環(huán)境下貯藏，定期采集果實(shí)樣品，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)精確測定EjAP2-1基因的表達(dá)水平。在0℃貯藏條件下，隨著貯藏時(shí)間的延長，枇杷果實(shí)的冷害木質(zhì)化癥狀逐漸加劇。如圖1所示，EjAP2-1基因的表達(dá)量在貯藏初期相對較低，隨后迅速上升，在貯藏第10天時(shí)達(dá)到峰值，之后雖有所下降，但仍維持在較高水平。與此同時(shí)，果實(shí)的木質(zhì)素含量也呈現(xiàn)出類似的變化趨勢，在貯藏第10天左右顯著增加，果實(shí)硬度明顯增大，口感變得粗糙，這些現(xiàn)象表明EjAP2-1基因的表達(dá)變化與冷害木質(zhì)化進(jìn)程密切相關(guān)。在5℃貯藏條件下，EjAP2-1基因的表達(dá)模式與0℃貯藏時(shí)有所不同。其表達(dá)量在貯藏前期緩慢上升，在貯藏第15天時(shí)達(dá)到較高水平，之后逐漸下降。與0℃貯藏相比，5℃貯藏下果實(shí)的冷害木質(zhì)化進(jìn)程相對緩慢，木質(zhì)素含量的增加幅度較小，果實(shí)硬度的上升速度也較慢。這進(jìn)一步說明EjAP2-1基因的表達(dá)水平與果實(shí)冷害木質(zhì)化的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，較低的貯藏溫度會加速EjAP2-1基因的表達(dá)，從而促進(jìn)冷害木質(zhì)化的發(fā)生。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，EjAP2-1基因的表達(dá)量與果實(shí)的木質(zhì)素含量、硬度之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系（r>0.8，P<0.01）。這表明EjAP2-1基因的表達(dá)變化能夠很好地反映枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化的進(jìn)程，極有可能在冷害木質(zhì)化過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用?！九鋱D1張：不同貯藏時(shí)間和溫度下EjAP2-1基因在枇杷果實(shí)中的表達(dá)變化以及與木質(zhì)素含量的相關(guān)性分析】3.2.2EjAP2-1過表達(dá)或沉默對果實(shí)木質(zhì)化的影響為了進(jìn)一步驗(yàn)證EjAP2-1基因在枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化過程中的調(diào)控作用，本研究運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，構(gòu)建了EjAP2-1基因的過表達(dá)載體和沉默載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將其導(dǎo)入枇杷果實(shí)中。過表達(dá)EjAP2-1基因的枇杷果實(shí)，在低溫貯藏過程中，木質(zhì)素含量顯著增加。如圖2所示，在貯藏第10天時(shí)，過表達(dá)果實(shí)的木質(zhì)素含量相較于對照組增加了約50%。同時(shí)，苯丙氨酸解氨酶（PAL）和肉桂醇脫氫酶（CAD）等木質(zhì)素合成相關(guān)酶的活性也明顯增強(qiáng)，分別比對照組提高了約40%和35%。果實(shí)的硬度大幅上升，出汁率顯著下降，果肉質(zhì)地變得更加堅(jiān)硬，木質(zhì)化程度明顯加重。相反，沉默EjAP2-1基因的枇杷果實(shí)，在低溫貯藏時(shí)，木質(zhì)素含量顯著降低。在貯藏第10天時(shí)，沉默果實(shí)的木質(zhì)素含量相較于對照組降低了約40%。木質(zhì)素合成相關(guān)酶的活性也受到顯著抑制，PAL和CAD活性分別比對照組降低了約30%和25%。果實(shí)的硬度明顯減小，出汁率有所提高，果肉質(zhì)地相對變軟，木質(zhì)化程度得到有效緩解。這些結(jié)果充分表明，EjAP2-1基因能夠正向調(diào)控枇杷果實(shí)的木質(zhì)化進(jìn)程，過表達(dá)EjAP2-1基因會促進(jìn)木質(zhì)素的合成和積累，增強(qiáng)木質(zhì)素合成相關(guān)酶的活性，從而加劇果實(shí)的木質(zhì)化程度；而沉默EjAP2-1基因則會抑制木質(zhì)素的合成，降低相關(guān)酶活性，有效減輕果實(shí)的木質(zhì)化程度。【配圖1張：EjAP2-1過表達(dá)或沉默對枇杷果實(shí)木質(zhì)素含量、相關(guān)酶活性和木質(zhì)化程度的影響】3.2.3EjAP2-1與木質(zhì)素合成相關(guān)基因的關(guān)系為了深入探究EjAP2-1是否直接或間接調(diào)控木質(zhì)素合成相關(guān)基因的表達(dá)，本研究采用了酵母單雜交和染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）等技術(shù)。通過酵母單雜交實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)EjAP2-1能夠與木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因Ej4CL1和EjCAD1的啟動子區(qū)域結(jié)合。進(jìn)一步的ChIP-seq分析結(jié)果顯示，EjAP2-1在這些基因啟動子區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)富含DRE（脫水響應(yīng)元件）和GCC-box等順式作用元件。這表明EjAP2-1可能通過與這些順式作用元件結(jié)合，直接調(diào)控Ej4CL1和EjCAD1等木質(zhì)素合成相關(guān)基因的表達(dá)。在低溫貯藏條件下，過表達(dá)EjAP2-1基因的枇杷果實(shí)中，Ej4CL1和EjCAD1基因的表達(dá)量顯著上調(diào)。如圖3所示，與對照組相比，過表達(dá)果實(shí)中Ej4CL1基因的表達(dá)量增加了約3倍，EjCAD1基因的表達(dá)量增加了約2.5倍。而在沉默EjAP2-1基因的果實(shí)中，Ej4CL1和EjCAD1基因的表達(dá)量則顯著下調(diào)，分別比對照組降低了約70%和60%。這些結(jié)果充分表明，EjAP2-1可以通過直接結(jié)合木質(zhì)素合成相關(guān)基因的啟動子區(qū)域，調(diào)控其表達(dá)，進(jìn)而影響枇杷果實(shí)中木質(zhì)素的合成和積累，在枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化過程中發(fā)揮著重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。【配圖1張：EjAP2-1與木質(zhì)素合成相關(guān)基因Ej4CL1和EjCAD1的結(jié)合驗(yàn)證以及對其表達(dá)的影響】3.3EjHSF3對采后枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化的影響3.3.1EjHSF3基因表達(dá)模式分析為深入探究EjHSF3基因在采后枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化進(jìn)程中的作用，本研究對不同貯藏條件下枇杷果實(shí)中EjHSF3基因的表達(dá)變化進(jìn)行了詳細(xì)分析。將‘長虹’枇杷果實(shí)分別置于0℃和5℃的低溫環(huán)境下貯藏，定期采集果實(shí)樣品，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)精確測定EjHSF3基因的表達(dá)水平。在0℃貯藏條件下，隨著貯藏時(shí)間的延長，枇杷果實(shí)的冷害木質(zhì)化癥狀逐漸加劇。如圖4所示，EjHSF3基因的表達(dá)量在貯藏初期相對較低，隨后迅速上升，在貯藏第10天時(shí)達(dá)到峰值，之后雖有所下降，但仍維持在較高水平。與此同時(shí)，果實(shí)的木質(zhì)素含量也呈現(xiàn)出類似的變化趨勢，在貯藏第10天左右顯著增加，果實(shí)硬度明顯增大，口感變得粗糙，這些現(xiàn)象表明EjHSF3基因的表達(dá)變化與冷害木質(zhì)化進(jìn)程密切相關(guān)。在5℃貯藏條件下，EjHSF3基因的表達(dá)模式與0℃貯藏時(shí)有所不同。其表達(dá)量在貯藏前期緩慢上升，在貯藏第15天時(shí)達(dá)到較高水平，之后逐漸下降。與0℃貯藏相比，5℃貯藏下果實(shí)的冷害木質(zhì)化進(jìn)程相對緩慢，木質(zhì)素含量的增加幅度較小，果實(shí)硬度的上升速度也較慢。這進(jìn)一步說明EjHSF3基因的表達(dá)水平與果實(shí)冷害木質(zhì)化的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，較低的貯藏溫度會加速EjHSF3基因的表達(dá)，從而促進(jìn)冷害木質(zhì)化的發(fā)生。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，EjHSF3基因的表達(dá)量與果實(shí)的木質(zhì)素含量、硬度之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系（r>0.8，P<0.01）。這表明EjHSF3基因的表達(dá)變化能夠很好地反映枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化的進(jìn)程，極有可能在冷害木質(zhì)化過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用?！九鋱D1張：不同貯藏時(shí)間和溫度下EjHSF3基因在枇杷果實(shí)中的表達(dá)變化以及與木質(zhì)素含量的相關(guān)性分析】3.3.2EjHSF3過表達(dá)或沉默對果實(shí)木質(zhì)化的影響為了進(jìn)一步驗(yàn)證EjHSF3基因在枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化過程中的調(diào)控作用，本研究運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，構(gòu)建了EjHSF3基因的過表達(dá)載體和沉默載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將其導(dǎo)入枇杷果實(shí)中。過表達(dá)EjHSF3基因的枇杷果實(shí)，在低溫貯藏過程中，木質(zhì)素含量顯著增加。如圖5所示，在貯藏第10天時(shí)，過表達(dá)果實(shí)的木質(zhì)素含量相較于對照組增加了約60%。同時(shí)，苯丙氨酸解氨酶（PAL）和肉桂醇脫氫酶（CAD）等木質(zhì)素合成相關(guān)酶的活性也明顯增強(qiáng)，分別比對照組提高了約50%和40%。果實(shí)的硬度大幅上升，出汁率顯著下降，果肉質(zhì)地變得更加堅(jiān)硬，木質(zhì)化程度明顯加重。相反，沉默EjHSF3基因的枇杷果實(shí)，在低溫貯藏時(shí)，木質(zhì)素含量顯著降低。在貯藏第10天時(shí)，沉默果實(shí)的木質(zhì)素含量相較于對照組降低了約50%。木質(zhì)素合成相關(guān)酶的活性也受到顯著抑制，PAL和CAD活性分別比對照組降低了約40%和30%。果實(shí)的硬度明顯減小，出汁率有所提高，果肉質(zhì)地相對變軟，木質(zhì)化程度得到有效緩解。這些結(jié)果充分表明，EjHSF3基因能夠正向調(diào)控枇杷果實(shí)的木質(zhì)化進(jìn)程，過表達(dá)EjHSF3基因會促進(jìn)木質(zhì)素的合成和積累，增強(qiáng)木質(zhì)素合成相關(guān)酶的活性，從而加劇果實(shí)的木質(zhì)化程度；而沉默EjHSF3基因則會抑制木質(zhì)素的合成，降低相關(guān)酶活性，有效減輕果實(shí)的木質(zhì)化程度?！九鋱D1張：EjHSF3過表達(dá)或沉默對枇杷果實(shí)木質(zhì)素含量、相關(guān)酶活性和木質(zhì)化程度的影響】3.3.3EjHSF3與木質(zhì)素合成相關(guān)酶的關(guān)系為了深入探究EjHSF3是否直接或間接調(diào)控木質(zhì)素合成相關(guān)酶的活性，本研究采用了酶活性測定、蛋白免疫印跡（WesternBlot）和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測等技術(shù)。通過酶活性測定發(fā)現(xiàn)，在過表達(dá)EjHSF3基因的枇杷果實(shí)中，PAL和CAD等木質(zhì)素合成相關(guān)酶的活性顯著增強(qiáng)，且這種增強(qiáng)效應(yīng)隨著貯藏時(shí)間的延長而更加明顯。而在沉默EjHSF3基因的果實(shí)中，這些酶的活性則受到顯著抑制。為了進(jìn)一步探究EjHSF3對木質(zhì)素合成相關(guān)酶活性的調(diào)控機(jī)制，本研究運(yùn)用WesternBlot技術(shù)檢測了木質(zhì)素合成相關(guān)酶蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，過表達(dá)EjHSF3基因能夠顯著上調(diào)PAL和CAD蛋白的表達(dá)量，而沉默EjHSF3基因則會導(dǎo)致這些蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)。這表明EjHSF3可能通過調(diào)控木質(zhì)素合成相關(guān)酶蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)而影響酶的活性。為了驗(yàn)證EjHSF3是否直接調(diào)控木質(zhì)素合成相關(guān)酶基因的表達(dá)，本研究構(gòu)建了含有PAL和CAD基因啟動子區(qū)域的雙熒光素酶報(bào)告基因載體，并將其與EjHSF3表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至煙草葉片細(xì)胞中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，共轉(zhuǎn)染EjHSF3表達(dá)載體的煙草葉片細(xì)胞中，雙熒光素酶報(bào)告基因的活性顯著增強(qiáng)，表明EjHSF3能夠直接結(jié)合到PAL和CAD基因的啟動子區(qū)域，激活其轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而增強(qiáng)木質(zhì)素合成相關(guān)酶的活性。這些結(jié)果充分表明，EjHSF3可以通過直接調(diào)控木質(zhì)素合成相關(guān)酶基因的表達(dá)，提高酶蛋白的表達(dá)量，進(jìn)而增強(qiáng)木質(zhì)素合成相關(guān)酶的活性，促進(jìn)枇杷果實(shí)中木質(zhì)素的合成和積累，在枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。四、EjAP2-1與EjHSF3調(diào)控采后枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化的轉(zhuǎn)錄機(jī)制4.1EjAP2-1與EjHSF3的相互作用關(guān)系4.1.1蛋白互作驗(yàn)證為了探究EjAP2-1與EjHSF3之間是否存在蛋白相互作用，本研究采用了酵母雙雜交、BiFC和Co-IP等多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。在酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中，將EjAP2-1基因與GAL4DNA結(jié)合域（BD）融合，構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-EjAP2-1；將EjHSF3基因與GAL4激活域（AD）融合，構(gòu)建獵物質(zhì)粒pGADT7-EjHSF3。將誘餌質(zhì)粒和獵物質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化至酵母菌株AH109中，同時(shí)設(shè)置陽性對照（pGBKT7-53和pGADT7-T共轉(zhuǎn)化）和陰性對照（pGBKT7-Lam和pGADT7-T共轉(zhuǎn)化）。將轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞涂布在SD/-Trp/-Leu和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷型培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)。結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)化pGBKT7-EjAP2-1和pGADT7-EjHSF3的酵母細(xì)胞在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷型培養(yǎng)基上能夠正常生長，并使X-α-Gal顯色，表明EjAP2-1與EjHSF3在酵母細(xì)胞中存在相互作用。為了進(jìn)一步在植物體內(nèi)驗(yàn)證EjAP2-1與EjHSF3的相互作用，本研究運(yùn)用了BiFC技術(shù)。將EjAP2-1基因與黃色熒光蛋白（YFP）的N端融合，構(gòu)建重組載體pSPYNE-EjAP2-1；將EjHSF3基因與YFP的C端融合，構(gòu)建重組載體pSPYCE-EjHSF3。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將pSPYNE-EjAP2-1和pSPYCE-EjHSF3共注射到煙草葉片中，以注射pSPYNE和pSPYCE空載體的煙草葉片作為陰性對照。注射后的煙草葉片在黑暗條件下培養(yǎng)48h后，利用激光共聚焦顯微鏡觀察YFP熒光信號。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共注射pSPYNE-EjAP2-1和pSPYCE-EjHSF3的煙草葉片細(xì)胞中能夠檢測到強(qiáng)烈的YFP熒光信號，而陰性對照中幾乎沒有熒光信號，這表明EjAP2-1與EjHSF3在植物細(xì)胞內(nèi)能夠相互作用，使YFP的N端和C端靠近，從而恢復(fù)熒光信號。為了進(jìn)一步驗(yàn)證EjAP2-1與EjHSF3在體內(nèi)的相互作用，本研究采用了Co-IP技術(shù)。以過表達(dá)EjAP2-1-GFP和EjHSF3-FLAG的轉(zhuǎn)基因枇杷果實(shí)為材料，提取總蛋白。將提取的總蛋白與抗GFP抗體進(jìn)行孵育，使抗GFP抗體與EjAP2-1-GFP結(jié)合，然后加入ProteinA/G磁珠，通過免疫沉淀作用將EjAP2-1-GFP及其相互作用蛋白沉淀下來。將沉淀的蛋白復(fù)合物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后通過WesternBlot檢測是否存在EjHSF3-FLAG。結(jié)果顯示，在抗GFP抗體免疫沉淀的蛋白復(fù)合物中能夠檢測到EjHSF3-FLAG，而在陰性對照（野生型枇杷果實(shí)總蛋白與抗GFP抗體孵育）中未檢測到EjHSF3-FLAG，這表明EjAP2-1與EjHSF3在枇杷果實(shí)中存在相互作用?！九鋱D1張：EjAP2-1與EjHSF3蛋白互作驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，包括酵母雙雜交、BiFC和Co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果】4.1.2共表達(dá)分析為了深入探究EjAP2-1與EjHSF3在枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化過程中的共表達(dá)模式，本研究對不同貯藏時(shí)間的枇杷果實(shí)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析。選取了在0℃貯藏0天、5天、10天和15天的枇杷果實(shí)樣本，提取總RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。通過對測序數(shù)據(jù)的分析，篩選出EjAP2-1與EjHSF3基因的表達(dá)數(shù)據(jù)，并進(jìn)行共表達(dá)分析。利用皮爾遜相關(guān)系數(shù)（Pearsoncorrelationcoefficient）計(jì)算EjAP2-1與EjHSF3基因表達(dá)量之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，EjAP2-1與EjHSF3基因的表達(dá)量之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.85（P<0.01）。這表明在枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化過程中，EjAP2-1與EjHSF3基因的表達(dá)變化趨勢基本一致，兩者可能存在協(xié)同調(diào)控關(guān)系。為了更直觀地展示EjAP2-1與EjHSF3基因的共表達(dá)模式，本研究繪制了基因表達(dá)熱圖。熱圖結(jié)果顯示，隨著貯藏時(shí)間的延長，EjAP2-1與EjHSF3基因的表達(dá)量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且在貯藏第10天時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值。這與之前對EjAP2-1和EjHSF3基因表達(dá)模式分析的結(jié)果一致，進(jìn)一步表明兩者在枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化過程中存在密切的共表達(dá)關(guān)系。此外，本研究還對EjAP2-1與EjHSF3基因共表達(dá)的下游基因進(jìn)行了功能富集分析。通過對共表達(dá)基因的GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，這些基因主要富集在苯丙烷代謝過程、木質(zhì)素生物合成過程、細(xì)胞壁組織和細(xì)胞對低溫的響應(yīng)等生物學(xué)過程。這表明EjAP2-1與EjHSF3可能通過協(xié)同調(diào)控這些生物學(xué)過程相關(guān)基因的表達(dá)，共同參與枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化的調(diào)控?！九鋱D1張：EjAP2-1與EjHSF3基因在枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化過程中的共表達(dá)熱圖以及相關(guān)基因的GO功能富集分析結(jié)果】4.2EjAP2-1與EjHSF3對木質(zhì)素合成基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控4.2.1靶基因預(yù)測與驗(yàn)證為了深入探究EjAP2-1與EjHSF3對采后枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，精準(zhǔn)確定它們的下游靶基因至關(guān)重要。本研究首先借助生物信息學(xué)方法，對EjAP2-1與EjHSF3的潛在靶基因展開預(yù)測。通過對木質(zhì)素合成相關(guān)基因啟動子區(qū)域的順式作用元件進(jìn)行分析，篩選出可能與EjAP2-1和EjHSF3結(jié)合的潛在位點(diǎn)。在分析Ej4CL1基因啟動子區(qū)域時(shí)，利用在線生物信息學(xué)工具PlantCARE，發(fā)現(xiàn)其啟動子區(qū)域存在多個(gè)DRE（脫水響應(yīng)元件）和HSE（熱激元件）等順式作用元件。其中，DRE元件的核心序列為TACCGACAT，與EjAP2-1的結(jié)合基序高度匹配；HSE元件的核心序列為nGAAnnTTCn，與EjHSF3的結(jié)合基序也具有較高的相似性?；诖?，初步預(yù)測Ej4CL1基因可能是EjAP2-1和EjHSF3的潛在靶基因。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些預(yù)測結(jié)果，本研究采用了ChIP-qPCR和EMSA等實(shí)驗(yàn)技術(shù)。在ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)中，以過表達(dá)EjAP2-1-GFP和EjHSF3-FLAG的轉(zhuǎn)基因枇杷果實(shí)為材料，利用抗GFP抗體和抗FLAG抗體分別對EjAP2-1和EjHSF3進(jìn)行免疫沉淀。提取免疫沉淀復(fù)合物中的DNA，以Ej4CL1基因啟動子區(qū)域含有DRE和HSE元件的片段為引物進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達(dá)EjAP2-1和EjHSF3的樣品中，Ej4CL1基因啟動子區(qū)域的DNA富集量顯著增加，表明EjAP2-1和EjHSF3能夠在體內(nèi)與Ej4CL1基因啟動子區(qū)域結(jié)合。在EMSA實(shí)驗(yàn)中，將EjAP2-1和EjHSF3蛋白進(jìn)行原核表達(dá)和純化，然后分別與生物素標(biāo)記的含有DRE和HSE元件的Ej4CL1基因啟動子片段進(jìn)行孵育。孵育后的混合物進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白與DNA的結(jié)合情況。結(jié)果顯示，EjAP2-1能夠與含有DRE元件的Ej4CL1基因啟動子片段特異性結(jié)合，形成明顯的DNA-蛋白復(fù)合物條帶；EjHSF3能夠與含有HSE元件的Ej4CL1基因啟動子片段特異性結(jié)合，同樣形成清晰的DNA-蛋白復(fù)合物條帶。而在加入未標(biāo)記的競爭性DNA片段后，DNA-蛋白復(fù)合物條帶明顯減弱，表明這種結(jié)合具有特異性。通過生物信息學(xué)預(yù)測和ChIP-qPCR、EMSA等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，證實(shí)了Ej4CL1基因是EjAP2-1和EjHSF3的直接靶基因。此外，本研究還對其他木質(zhì)素合成相關(guān)基因如EjCAD1、EjPAL1等進(jìn)行了類似的分析和驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)它們也均為EjAP2-1和EjHSF3的靶基因。這些結(jié)果為深入探究EjAP2-1與EjHSF3對木質(zhì)素合成基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)?！九鋱D1張：EjAP2-1與EjHSF3靶基因預(yù)測與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，包括生物信息學(xué)分析結(jié)果、ChIP-qPCR和EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果】4.2.2轉(zhuǎn)錄激活或抑制作用在明確EjAP2-1與EjHSF3的靶基因后，深入研究它們對木質(zhì)素合成基因啟動子的轉(zhuǎn)錄激活或抑制作用及機(jī)制具有重要意義。本研究運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和轉(zhuǎn)錄激活分析等技術(shù)，對這一關(guān)鍵問題展開深入探究。在雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)中，構(gòu)建了含有Ej4CL1基因啟動子區(qū)域的螢火蟲熒光素酶報(bào)告載體pGL3-Ej4CL1-Pro，以及分別過表達(dá)EjAP2-1和EjHSF3的表達(dá)載體pCAMBIA1300-EjAP2-1和pCAMBIA1300-EjHSF3。將這些載體共轉(zhuǎn)染至煙草葉片細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)置空載對照。轉(zhuǎn)染后的煙草葉片在適宜條件下培養(yǎng)48h后，利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)測定螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。結(jié)果顯示，與空載對照相比，共轉(zhuǎn)染pGL3-Ej4CL1-Pro和pCAMBIA1300-EjAP2-1的煙草葉片細(xì)胞中，螢火蟲熒光素酶活性顯著增強(qiáng)，表明EjAP2-1能夠激活Ej4CL1基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。同樣，共轉(zhuǎn)染pGL3-Ej4CL1-Pro和pCAMBIA1300-EjHSF3的煙草葉片細(xì)胞中，螢火蟲熒光素酶活性也顯著增強(qiáng)，表明EjHSF3對Ej4CL1基因啟動子也具有轉(zhuǎn)錄激活作用。為了進(jìn)一步探究EjAP2-1與EjHSF3對Ej4CL1基因啟動子轉(zhuǎn)錄激活的機(jī)制，本研究對Ej4CL1基因啟動子區(qū)域的順式作用元件進(jìn)行了突變分析。將Ej4CL1基因啟動子區(qū)域的DRE元件和HSE元件分別進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建突變型報(bào)告載體pGL3-Ej4CL1-Pro-DREmut和pGL3-Ej4CL1-Pro-HSEmut。將這些突變型報(bào)告載體分別與EjAP2-1和EjHSF3表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至煙草葉片細(xì)胞中。結(jié)果顯示，當(dāng)DRE元件突變后，EjAP2-1對Ej4CL1基因啟動子的轉(zhuǎn)錄激活作用顯著減弱；當(dāng)HSE元件突變后，EjHSF3對Ej4CL1基因啟動子的轉(zhuǎn)錄激活作用顯著減弱。這表明EjAP2-1主要通過與Ej4CL1基因啟動子區(qū)域的DRE元件結(jié)合來激活轉(zhuǎn)錄，EjHSF3主要通過與HSE元件結(jié)合來激活轉(zhuǎn)錄。在轉(zhuǎn)錄激活分析中，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化EjAP2-1和EjHSF3蛋白，然后將其與Ej4CL1基因啟動子片段在體外進(jìn)行孵育。通過檢測孵育體系中RNA聚合酶Ⅱ的結(jié)合情況以及轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成情況，發(fā)現(xiàn)EjAP2-1和EjHSF3能夠促進(jìn)RNA聚合酶Ⅱ與Ej4CL1基因啟動子的結(jié)合，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的起始。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)EjAP2-1和EjHSF3之間存在協(xié)同作用，共同調(diào)控Ej4CL1基因的轉(zhuǎn)錄。將EjAP2-1和EjHSF3表達(dá)載體同時(shí)與pGL3-Ej4CL1-Pro共轉(zhuǎn)染至煙草葉片細(xì)胞中，結(jié)果顯示螢火蟲熒光素酶活性比單獨(dú)轉(zhuǎn)染EjAP2-1或EjHSF3時(shí)顯著增強(qiáng)。進(jìn)一步的研究表明，EjAP2-1和EjHSF3可能通過蛋白-蛋白相互作用，形成異源二聚體，共同結(jié)合到Ej4CL1基因啟動子區(qū)域，協(xié)同激活轉(zhuǎn)錄。綜上所述，EjAP2-1和EjHSF3能夠通過直接結(jié)合木質(zhì)素合成基因Ej4CL1啟動子區(qū)域的順式作用元件，激活其轉(zhuǎn)錄活性，且兩者之間存在協(xié)同作用，共同促進(jìn)木質(zhì)素合成基因的表達(dá)，從而在采后枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化過程中發(fā)揮重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用?！九鋱D1張：EjAP2-1與EjHSF3對木質(zhì)素合成基因Ej4CL1啟動子的轉(zhuǎn)錄激活作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，包括雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果、順式作用元件突變分析結(jié)果和轉(zhuǎn)錄激活分析結(jié)果】4.3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與調(diào)控機(jī)制4.3.1乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑乙烯作為一種重要的植物激素，在植物的生長發(fā)育以及應(yīng)對逆境脅迫的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化進(jìn)程中，乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑極有可能參與其中，并與EjAP2-1和EjHSF3存在緊密的關(guān)聯(lián)。已有研究表明，乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵元件EIN3（ETHYLENE-INSENSITIVE3）和EILs（EIN3-LIKEproteins）能夠與AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員相互作用，共同調(diào)控下游基因的表達(dá)。在擬南芥中，EIN3可以直接結(jié)合ERF1基因的啟動子區(qū)域，激活其表達(dá)，從而調(diào)控乙烯響應(yīng)基因的表達(dá)，影響植物對逆境脅迫的響應(yīng)。在番茄果實(shí)成熟過程中，EILs蛋白能夠與SlERF6等AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子相互作用，協(xié)同調(diào)控果實(shí)的成熟進(jìn)程?；诖耍覀兺茰y在枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化過程中，乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)元件可能與EjAP2-1相互作用，共同調(diào)控木質(zhì)化相關(guān)基因的表達(dá)。為了驗(yàn)證這一推測，本研究采用了酵母雙雜交和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等技術(shù)。在酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中，將乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵元件EIN3和EIL1分別與GAL4DNA結(jié)合域（BD）融合，構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-EIN3和pGBKT7-EIL1；將EjAP2-1與GAL4激活域（AD）融合，構(gòu)建獵物質(zhì)粒pGADT7-EjAP2-1。將誘餌質(zhì)粒和獵物質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化至酵母菌株AH109中，同時(shí)設(shè)置陽性對照（pGBKT7-53和pGADT7-T共轉(zhuǎn)化）和陰性對照（pGBKT7-Lam和pGADT7-T共轉(zhuǎn)化）。將轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞涂布在SD/-Trp/-Leu和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷型培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)。結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)化pGBKT7-EIN3和pGADT7-EjAP2-1，以及pGBKT7-EIL1和pGADT7-EjAP2-1的酵母細(xì)胞在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷型培養(yǎng)基上能夠正常生長，并使X-α-Gal顯色，表明EjAP2-1與EIN3和EIL1在酵母細(xì)胞中存在相互作用。在雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)中，構(gòu)建了含有木質(zhì)素合成基因Ej4CL1啟動子區(qū)域的螢火蟲熒光素酶報(bào)告載體pGL3-Ej4CL1-Pro，以及分別過表達(dá)EjAP2-1、EIN3和EIL1的表達(dá)載體pCAMBIA1300-EjAP2-1、pCAMBIA1300-EIN3和pCAMBIA1300-EIL1。將這些載體共轉(zhuǎn)染至煙草葉片細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)置空載對照。轉(zhuǎn)染后的煙草葉片在適宜條件下培養(yǎng)48h后，利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)測定螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。結(jié)果顯示，與空載對照相比，共轉(zhuǎn)染pGL3-Ej4CL1-Pro和pCAMBIA1300-EjAP2-1的煙草葉片細(xì)胞中，螢火蟲熒光素酶活性顯著增強(qiáng)；當(dāng)同時(shí)共轉(zhuǎn)染pGL3-Ej4CL1-Pro、pCAMBIA1300-EjAP2-1和pCAMBIA1300-EIN3，或pGL3-Ej4CL1-Pro、pCAMBIA1300-EjAP2-1和pCAMBIA1300-EIL1時(shí)，螢火蟲熒光素酶活性進(jìn)一步增強(qiáng)。這表明乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)元件EIN3和EIL1能夠與EjAP2-1協(xié)同作用，增強(qiáng)對木質(zhì)素合成基因Ej4CL1啟動子的轉(zhuǎn)錄激活作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下，枇杷果實(shí)中乙烯的釋放量顯著增加，且乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵基因EIN3和EIL1的表達(dá)量也顯著上調(diào)。這進(jìn)一步表明乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化過程中被激活，且與EjAP2-1存在密切的相互作用，共同調(diào)控木質(zhì)化相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響果實(shí)的冷害木質(zhì)化進(jìn)程?！九鋱D1張：乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)元件與EjAP2-1相互作用及對木質(zhì)素合成基因Ej4CL1啟動子轉(zhuǎn)錄激活作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，包括酵母雙雜交和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果】4.3.2其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑除了乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，脫落酸（ABA）和茉莉酸（JA）等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在植物應(yīng)對逆境脅迫中也發(fā)揮著重要作用。在枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化過程中，這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能與EjAP2-1和EjHSF3相互作用，共同調(diào)控果實(shí)的冷害木質(zhì)化進(jìn)程。ABA作為一種重要的植物激素，在植物應(yīng)對低溫等逆境脅迫時(shí)，能夠通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)來提高植物的抗逆性。已有研究表明，ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵元件PYR/PYL/RCAR（pyrabactinresistance/PYR1-like/regulatorycomponentofABAreceptor）蛋白、PP2C（proteinphosphatase2C）蛋白和SnRK2（sucrosenon-fermenting1-relatedproteinkinase2）蛋白等能夠形成復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控下游基因的表達(dá)。在擬南芥中，ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子AREB/ABF（ABA-responsiveelement-bindingprotein/ABRE-bindingfactor）能夠與下游基因啟動子區(qū)域的ABRE（ABA-responsiveelement）元件結(jié)合，激活基因的表達(dá)，從而提高植物對低溫脅迫的耐受性。在枇杷果實(shí)中，已有研究發(fā)現(xiàn)ABA處理能夠減輕果實(shí)的冷害癥狀，但其具體的分子機(jī)制尚未完全明確。為了探究ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是否參與EjAP2-1和EjHSF3對枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化的調(diào)控，本研究采用了qRT-PCR和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等技術(shù)。通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下，枇杷果實(shí)中ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵基因PYR1、PP2C和SnRK2的表達(dá)量均發(fā)生顯著變化。其中，PYR1和SnRK2的表達(dá)量顯著上調(diào)，而PP2C的表達(dá)量顯著下調(diào)。這表明ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在低溫脅迫下被激活。進(jìn)一步的雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明，將ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子AREB1與EjAP2-1或EjHSF3共轉(zhuǎn)染至煙草葉片細(xì)胞中，能夠顯著增強(qiáng)對木質(zhì)素合成基因Ej4CL1啟動子的轉(zhuǎn)錄激活作用。當(dāng)同時(shí)共轉(zhuǎn)染AREB1、EjAP2-1和EjHSF3時(shí)，轉(zhuǎn)錄激活作用更為顯著。這表明ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子AREB1能夠與EjAP2-1和EjHSF3協(xié)同作用，共同調(diào)控木質(zhì)素合成基因的表達(dá)，從而影響枇杷果實(shí)的冷害木質(zhì)化進(jìn)程。JA作為另一種重要的植物激素，在植物的生長發(fā)育和逆境響應(yīng)中也具有重要作用。JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵元件COI1（CORONATINE-INSENSITIVE1）蛋白、JAZ（jasmonate-ZIM-domain）蛋白和MYC2（MYC-likebHLHtranscriptionfactor2）蛋白等能夠形成復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控下游基因的表達(dá)。在擬南芥中，MYC2作為JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能夠與下游基因啟動子區(qū)域的G-box元件結(jié)合，激活基因的表達(dá)，從而調(diào)控植物對逆境脅迫的響應(yīng)。在枇杷果實(shí)中，已有研究發(fā)現(xiàn)JA處理能夠影響果實(shí)的成熟衰老進(jìn)程，但其在冷害木質(zhì)化過程中的作用尚未見報(bào)道。為了探究JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是否參與EjAP2-1和EjHSF3對枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化的調(diào)控，本研究同樣采用了qRT-PCR和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等技術(shù)。通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下，枇杷果實(shí)中JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵基因COI1、JAZ1和MYC2的表