ICS11.220B41備案號(hào)：DB42Methodofthelatexagglutinationforthedetectionofavianinfluenzavirus湖北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB42/T795—2012前言 12術(shù)語和定義 13實(shí)驗(yàn)原理 14實(shí)驗(yàn)條件 15實(shí)驗(yàn)材料 16樣品處理 27實(shí)驗(yàn)方法 28結(jié)果判定 29注意事項(xiàng) 3 4DB42/T795—2012本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提出。本標(biāo)準(zhǔn)由湖北省農(nóng)業(yè)廳歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院、武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司、湖北省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心。本標(biāo)準(zhǔn)起草人：金梅林、鐘廣漢、但漢并、郭學(xué)波、徐高原、張安定、周艷君、孫小美、李淑云。DB42/T795—2012禽流感病毒（AvianInfluenzaVirus,AIV）具有易變異的特點(diǎn)，可通過突變獲得對(duì)人的感染和致病能力，導(dǎo)致重大的公共衛(wèi)生危害。為加強(qiáng)禽流感監(jiān)測(cè)，制定了《禽流感病毒乳膠凝集試驗(yàn)檢測(cè)方法》，本方法具有簡便、快速的優(yōu)點(diǎn)，尤其適合基層現(xiàn)場使用。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)提請(qǐng)注意，聲明符合本文件時(shí)，可能涉及到《一種禽流感病毒乳膠凝集檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用》（專利號(hào)：ZL200510019512.3）相關(guān)的專利的使用。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)對(duì)于該專利的真實(shí)性、有效性和范圍無任何立場。該專利持有人已向本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)保證，他愿意同任何申請(qǐng)人在合理且無歧視的條款和條件下，就專利授權(quán)許可進(jìn)行談判。該專利持有人的聲明已在本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)備案。相關(guān)信息可以通過以下聯(lián)系方式獲得：專利持有人姓名：金梅林、陳劍鋒、喻正軍、張安定、李紅超、陳煥春。地址：武漢市洪山區(qū)獅子山街1號(hào)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)郵政編碼：430070聯(lián)系電話真注意除上述專利外，本文件的某些內(nèi)容仍可能涉及其他專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。DB42/T795—20121禽流感病毒乳膠凝集檢測(cè)方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了禽流感病毒的乳膠凝集試驗(yàn)檢測(cè)方法的術(shù)語和定義、實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)材料、樣品處理、實(shí)驗(yàn)方法、結(jié)果判定和注意事項(xiàng)等。本標(biāo)準(zhǔn)適用于禽類咽/鼻拭子、肛拭子、內(nèi)臟組織、雞胚尿囊液、細(xì)胞培養(yǎng)物中禽流感病毒的檢測(cè)。2術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。乳膠（Latex）：聚合物微粒分散于水中形成的膠體乳液。3實(shí)驗(yàn)原理禽流感病毒核蛋白的多克隆抗體致敏固相載體羧化聚苯乙烯微球，當(dāng)與相應(yīng)的抗原反應(yīng)時(shí)，可形成肉眼可見的凝集顆粒。4實(shí)驗(yàn)條件4.1實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)操作宜在常溫（18℃~25℃)進(jìn)行。4.2儀器臺(tái)式低溫高速離心機(jī)、微量移液器、冰箱、玻片、吸頭。4.3人員注意個(gè)人防護(hù)和環(huán)境保護(hù)。5實(shí)驗(yàn)材料5.1乳膠診斷液5.2陽性對(duì)照含禽流感病毒的雞胚尿囊液滅活處理。5.3陰性對(duì)照未接種禽流感病毒的雞胚尿囊液。2DB42/T795—20125.4樣品處理液A配制見附錄第A.1章5.5樣品處理液B配制見附錄第A.2章6樣品處理6.1咽/鼻拭子和肛拭子用無菌棉拭子于禽的咽喉或鼻腔、泄殖腔中沾取滲出液，然后浸泡于1mL樣品處理液B中，劇烈震蕩1min后擠出棉拭子中的液體，凍融3次后于37℃感作15min，置2℃~8℃,12,000r/min離心5min，取上清。6.2內(nèi)臟組織剪取組織塊0.5g，置于研磨器中，加樣品處理液A1mL，研磨后取出組織浸出液，凍融3次，然后于2℃~8℃,12,000r/min離心15min，取上清。6.3雞胚尿囊液雞胚尿囊液樣品，12,000r/min離心5min，取上清。6.4細(xì)胞培養(yǎng)物細(xì)胞培養(yǎng)物可直接用于檢測(cè)或者凍融一次后檢測(cè)。7實(shí)驗(yàn)方法取樣品、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照各8μL～10μL，分置于黑色背景的玻璃片上。各加等量的乳膠試劑，用纖細(xì)潔凈物（牙簽等）攪勻，使液面直徑達(dá)到1.5cm左右，前后左右緩慢連續(xù)搖動(dòng)30sec，并在1min內(nèi)觀察記錄結(jié)果。8結(jié)果判定8.1凝集反應(yīng)可能出現(xiàn)以下幾種結(jié)果：a）“++++”全部膠乳凝集，顆粒聚于液滴邊緣，液體完全透明；b）“+++”大部分膠乳凝集，顆粒明顯，液體稍混濁；c）“++”約50％膠乳凝集，但顆粒較細(xì)，液體較混濁；d）“+”有少許凝集，液體呈混濁：e）“-”液滴呈原有的均勻乳狀。8.2成立條件30sec～60sec內(nèi)出現(xiàn)如下結(jié)果，試驗(yàn)方可成立：陽性對(duì)照樣品與乳膠診斷液進(jìn)行乳膠凝集反應(yīng)，應(yīng)出現(xiàn)“++”以上凝集；陰性對(duì)照樣品與乳膠診斷液進(jìn)行乳膠凝集反應(yīng)，應(yīng)不凝集。DB42/T795—201238.3結(jié)果判斷30sec～60sec內(nèi)出現(xiàn)“++”以上凝集，判為陽性；30sec～60sec內(nèi)液滴呈原有的均勻乳狀為陰性。9注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)過程中注意做好個(gè)人的生物安全防護(hù)措施，廢棄物應(yīng)做無害化處理。DB42/T795—20124（規(guī)范性附錄）試劑的配制A.1樣品處理液A四硼酸鈉（Na2B4O7?10H2O）13.3g硼酸（H3BO3）16.08g氯化鈉（NaCl）8.5g加蒸餾水或去離子水800mL，調(diào)pH值至8.4后定容至1000mL。置2℃~8℃下保存?zhèn)溆?。A.2樣