ApoE修飾聚合物囊泡小分子抑制劑：原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療新突破一、引言1.1研究背景與意義膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GlioblastomaMultiforme，GBM）作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤的一種，惡性程度被世界衛(wèi)生組織（WHO）評(píng)定為Ⅳ級(jí)，是最致命的原發(fā)性腦腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，患者自診斷后1年生存率僅為47％，總的中位生存期僅為12-14個(gè)月，給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。GBM的高致死率和高復(fù)發(fā)率主要?dú)w因于其高度浸潤(rùn)性生長(zhǎng)方式，腫瘤細(xì)胞與正常腦組織邊界模糊，手術(shù)難以徹底切除；同時(shí)，血腦屏障（Blood-BrainBarrier，BBB）的存在使得大多數(shù)治療藥物難以有效進(jìn)入腫瘤部位發(fā)揮作用。目前，臨床上對(duì)于GBM的治療主要采取手術(shù)切除、放療和化療等綜合治療手段。手術(shù)切除是治療GBM的重要初始步驟，但由于腫瘤的浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，很難實(shí)現(xiàn)完全切除，殘留的腫瘤細(xì)胞往往會(huì)導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。放療通過(guò)高能射線(xiàn)殺死腫瘤細(xì)胞，但在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)周?chē)ＤX組織造成一定的損傷，引發(fā)一系列不良反應(yīng)，如放射性腦壞死、認(rèn)知功能障礙等?；熕幬镫m能在一定程度上抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，但由于血腦屏障的限制，多數(shù)化療藥物難以穿透血腦屏障，到達(dá)腫瘤部位的藥物濃度較低，無(wú)法達(dá)到有效的治療劑量；而且化療藥物通常缺乏腫瘤特異性，在全身循環(huán)過(guò)程中會(huì)對(duì)正常組織和器官產(chǎn)生較大的毒副作用，導(dǎo)致患者出現(xiàn)惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性。近年來(lái)，隨著納米技術(shù)的不斷發(fā)展，納米藥物在GBM治療領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的潛力。納米藥物能夠通過(guò)對(duì)其尺寸、表面性質(zhì)和組成成分等進(jìn)行精確調(diào)控，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤組織的被動(dòng)靶向或主動(dòng)靶向遞送，從而提高藥物在腫瘤部位的富集程度，降低藥物對(duì)正常組織的毒副作用。同時(shí)，納米藥物還可以改善藥物的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)性質(zhì)，提高藥物的穩(wěn)定性和生物利用度。小分子抑制劑作為一類(lèi)具有明確靶點(diǎn)、優(yōu)越安全性和腫瘤選擇性的藥物，被廣泛應(yīng)用于多種腫瘤的治療。然而，與大部分化療藥物一樣，小分子抑制劑在治療GBM時(shí)也面臨著血腦屏障穿透效率低、藥物利用率不高的問(wèn)題，難以直接用于GBM的治療。載脂蛋白E（ApolipoproteinE，ApoE）是一種在脂質(zhì)代謝和神經(jīng)生物學(xué)中發(fā)揮重要作用的蛋白質(zhì)。ApoE能夠與血腦屏障上的特定受體結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)其的攝取，從而穿過(guò)血腦屏障?；诖?，利用ApoE修飾的聚合物囊泡作為載體來(lái)遞送小分子抑制劑，有望解決小分子抑制劑難以穿透血腦屏障的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)對(duì)原位GBM的安全高效治療。本研究設(shè)計(jì)制備ApoE修飾的聚合物囊泡小分子抑制劑，具有重要的創(chuàng)新性和意義。一方面，通過(guò)ApoE修飾實(shí)現(xiàn)對(duì)血腦屏障的特異性識(shí)別和高效穿透，提高小分子抑制劑在腫瘤部位的濃度，增強(qiáng)治療效果；另一方面，聚合物囊泡作為載體能夠有效保護(hù)小分子抑制劑，改善其藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，降低毒副作用，為GBM的治療提供一種新的安全有效的策略，有望打破GBM治療的瓶頸，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。1.2研究目的與方法本研究旨在設(shè)計(jì)并制備ApoE修飾的聚合物囊泡小分子抑制劑，以實(shí)現(xiàn)對(duì)原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的安全高效治療，具體從以下幾個(gè)方面開(kāi)展研究。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方面，構(gòu)建了載脂蛋白E衍生肽修飾的靶向不對(duì)稱(chēng)聚碳酸酯囊泡（ApoE-CP），利用其裝載小分子抑制劑Rigosertib（RGS）。通過(guò)合理的實(shí)驗(yàn)分組，設(shè)置對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)比觀(guān)察ApoE-CP-RGS對(duì)原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療效果。在對(duì)照組中，采用未修飾的聚合物囊泡裝載RGS以及單純使用RGS藥物進(jìn)行處理，以此來(lái)突出ApoE修飾和聚合物囊泡載體的作用。材料選擇上，制備ApoE-CP選用聚乙二醇-聚(三亞甲基碳酸酯-二硫戊環(huán)三亞甲基碳酸酯)-精胺（PEG-P(TMC-DTC)-spermine）和端ApoE聚乙二醇-聚(三亞甲基碳酸酯-二硫戊環(huán)三亞甲基碳酸酯)（ApoE-PEG-P(TMC-DTC)）為原料。這些材料具有良好的生物相容性和可降解性，其中PEG能夠延長(zhǎng)囊泡在血液循環(huán)中的時(shí)間，而五元環(huán)二硫戊環(huán)三亞甲基碳酸酯可通過(guò)自交聯(lián)增強(qiáng)囊泡的穩(wěn)定性。小分子抑制劑Rigosertib（RGS）是一種具有明確抗腫瘤靶點(diǎn)的藥物，對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞具有抑制作用，但由于血腦屏障的阻礙，其單獨(dú)使用時(shí)治療效果不佳，故選擇將其作為被遞送的藥物。在檢測(cè)分析方法上，運(yùn)用動(dòng)態(tài)光散射（DLS）技術(shù)來(lái)測(cè)定ApoE-CP的粒徑大小和分布情況，以確保囊泡制備的均一性和穩(wěn)定性；采用透射電子顯微鏡（TEM）觀(guān)察ApoE-CP的形態(tài)結(jié)構(gòu)，直觀(guān)了解其微觀(guān)形貌是否符合預(yù)期。通過(guò)高效液相色譜（HPLC）精確測(cè)定RGS在A(yíng)poE-CP中的包封率和載藥量，為后續(xù)的藥效研究提供準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)支持。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，利用CCK-8法檢測(cè)ApoE-CP-RGS對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞活力的影響，評(píng)估其體外抗腫瘤效果；通過(guò)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)，采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率，深入探究ApoE-CP-RGS誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)則建立原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤小鼠模型，將小鼠隨機(jī)分組后進(jìn)行相應(yīng)的藥物處理，定期使用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)情況，記錄小鼠的生存時(shí)間，以此評(píng)價(jià)ApoE-CP-RGS的體內(nèi)治療效果；在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)小鼠的主要臟器進(jìn)行病理切片分析，評(píng)估藥物對(duì)正常組織的毒副作用。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的研究工作。國(guó)外方面，美國(guó)的Stupp團(tuán)隊(duì)開(kāi)展的一項(xiàng)前瞻對(duì)照試驗(yàn)提出，對(duì)于年輕患者，最大安全范圍內(nèi)腫瘤切除術(shù)+術(shù)后累及野放療+同期及輔助替莫唑胺化療的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，可使中位生存延長(zhǎng)2.5個(gè)月，然而該試驗(yàn)排除了年齡>70歲的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者。在老年患者治療研究中，Chaichana等回顧性分析80例>65歲的GBM患者，發(fā)現(xiàn)手術(shù)組40例接受>95％腫瘤切除的患者，總生存（OS）較單純活檢組提高，且對(duì)>70歲亞組分析也顯示手術(shù)在提高OS方面的優(yōu)越性。Vuorinen等的前瞻性研究納入30例年齡>65歲、高度懷疑高分級(jí)膠質(zhì)瘤患者，隨機(jī)分配至減積手術(shù)組或活檢組，意向性分析顯示減積手術(shù)既提高了OS，同時(shí)延緩了神經(jīng)功能惡化。這些研究表明，手術(shù)切除在一定程度上能改善患者生存情況，但難以實(shí)現(xiàn)腫瘤的完全切除，復(fù)發(fā)問(wèn)題依舊嚴(yán)峻。放療方面，Keime-Guibert等在一項(xiàng)前瞻性對(duì)照研究中比較最佳支持治療和累及野放療（50.4Gy/28f）的療效，因放療組較支持治療組顯著延長(zhǎng)生存而提前關(guān)閉試驗(yàn)，證實(shí)放療適用于高Kps評(píng)分老年患者。Roa等嘗試探討不同放療模式對(duì)療效及放療累積毒性的影響，95例>60歲的GBM患者隨機(jī)分配至大分割放療組（40Gy/15f照射）或常規(guī)分割組（60Gy/30f照射），雖因入組緩慢提前關(guān)閉試驗(yàn)，但已有數(shù)據(jù)顯示兩種放療模式療效無(wú)差別?；熕幬锏难芯恳膊粩嗤七M(jìn)，Chinot等采用替莫唑胺化療治療>70歲GBM患者（Stupp方案），PFS和OS分別為5個(gè)月和6.4個(gè)月，毒性反應(yīng)在可接受范圍內(nèi)。ANOCEF研究中替莫唑胺的給藥方式為150-200mg/m2/天，d1-5，28天一周期，中位OS為6.25月，較既往僅接受支持治療的生存數(shù)據(jù)明顯提高，且亞組分析顯示存在MGMT啟動(dòng)子甲基化GBM較無(wú)甲基化者OS明顯改善。國(guó)內(nèi)研究同樣取得了諸多成果。河南省腦靶向生物納米藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療研究中成果顯著，如設(shè)計(jì)基于載脂蛋白E（ApoE）多肽修飾的紅細(xì)胞膜為外殼的酸敏感仿生納米載體，靶向遞送ABT-263（ABT）和Mcl-1特異性抑制劑A-1210477（A12）至腫瘤部位，動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn)表明，所得納米藥物具有長(zhǎng)的血液循環(huán)時(shí)間，能夠有效穿越血腦屏障、靶向腦膠質(zhì)瘤，荷瘤小鼠接受該仿生納米藥物治療之后，腫瘤的生長(zhǎng)得到明顯抑制，生存周期得到有效延長(zhǎng)，同時(shí)降低了抑制劑對(duì)生物體的毒副作用（血小板毒性）。中山大學(xué)鄧文斌團(tuán)隊(duì)在黑磷納米片介導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤免疫治療中取得進(jìn)展，研究表明黑磷納米片（BPNS）通過(guò)作用于腫瘤細(xì)胞，降低腫瘤細(xì)胞表面免疫抑制分子PD-L1的表達(dá)，改善GBM的免疫抑制微環(huán)境，重新激活免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，為GBM治療提供新方向。盡管?chē)?guó)內(nèi)外在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療研究上取得了一定成果，但目前仍面臨諸多挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)治療手段如手術(shù)、放療和化療存在各自的局限性，難以有效提高患者生存率和生活質(zhì)量。納米藥物雖展現(xiàn)出巨大潛力，但多數(shù)納米藥物在穿透血腦屏障方面效率較低，藥物利用率不高，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤組織的精準(zhǔn)靶向和高效治療。小分子抑制劑雖具有明確靶點(diǎn)、優(yōu)越安全性和腫瘤選擇性，但受限于血腦屏障，也難以直接用于GBM治療。本研究針對(duì)當(dāng)前小分子抑制劑治療GBM時(shí)面臨的血腦屏障穿透難題，利用ApoE能夠與血腦屏障上特定受體結(jié)合并介導(dǎo)細(xì)胞攝取從而穿過(guò)血腦屏障的特性，設(shè)計(jì)制備ApoE修飾的聚合物囊泡小分子抑制劑，旨在為原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療提供一種新的安全高效策略，解決現(xiàn)有治療方法的不足，提高治療效果。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1膠質(zhì)母細(xì)胞瘤概述膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GlioblastomaMultiforme，GBM）是一種起源于神經(jīng)上皮的惡性腫瘤，在星形細(xì)胞瘤中惡變程度最高，屬于世界衛(wèi)生組織（WHO）分級(jí)中的IV級(jí)。其腫瘤細(xì)胞主要源自星形膠質(zhì)細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞，這些細(xì)胞發(fā)生異常增生，失去正常的調(diào)控機(jī)制，呈現(xiàn)出高度的侵襲性生長(zhǎng)特點(diǎn)，可廣泛侵犯周?chē)哪X組織以及神經(jīng)、血管等結(jié)構(gòu)。GBM在組織病理學(xué)上具有顯著特征。腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出高度的異型性，大小和形態(tài)各異，細(xì)胞核增大且深染，核仁明顯，染色質(zhì)分布不均。腫瘤組織內(nèi)還可見(jiàn)大量的核分裂象，反映了腫瘤細(xì)胞的快速增殖能力。此外，GBM常伴有壞死和出血區(qū)域，壞死灶周?chē)哪[瘤細(xì)胞呈柵欄狀排列，這是GBM較為典型的病理表現(xiàn)之一；腫瘤血管也呈現(xiàn)出異常增生的狀態(tài)，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活躍，血管壁結(jié)構(gòu)不完整，容易導(dǎo)致血管滲漏和血栓形成。關(guān)于GBM的發(fā)病機(jī)制，目前尚未完全明確，但普遍認(rèn)為是多種因素共同作用的結(jié)果。遺傳因素在GBM的發(fā)病中起到重要作用，部分患者存在與遺傳性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤相關(guān)的基因突變，如神經(jīng)纖維瘤病1型（NF1）、神經(jīng)纖維瘤病2型（NF2）等基因的突變，這些突變可能使細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和凋亡等調(diào)控機(jī)制失衡，從而引發(fā)腫瘤的發(fā)生。環(huán)境因素也被認(rèn)為與GBM的發(fā)病有關(guān)，長(zhǎng)期暴露于放射線(xiàn)、某些化學(xué)物質(zhì)（如亞硝胺類(lèi)化合物）或其他有害物質(zhì)，可能會(huì)損傷細(xì)胞的DNA，增加基因突變的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而促進(jìn)GBM的發(fā)生，但具體的發(fā)病機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。在細(xì)胞信號(hào)通路方面，GBM的發(fā)生與多種細(xì)胞信號(hào)通路的異?；罨芮邢嚓P(guān)。其中，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路和RAS/MAPK信號(hào)通路的異常激活較為常見(jiàn)，這些信號(hào)通路的異常會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控、生長(zhǎng)加速以及轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，最終促使腫瘤的形成與發(fā)展。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中，GBM占據(jù)著極為重要且嚴(yán)峻的地位。它是成人中最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腦腫瘤，具有極高的發(fā)病率和致死率。GBM患者的預(yù)后通常極差，即使接受了手術(shù)切除、放療和化療等綜合治療，患者的中位生存期也僅為12-14個(gè)月左右，5年生存率更是低于5%。GBM的高致死率主要?dú)w因于其高度浸潤(rùn)性的生長(zhǎng)方式，腫瘤細(xì)胞與正常腦組織邊界模糊，手術(shù)難以徹底切除，殘留的腫瘤細(xì)胞極易導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)；同時(shí)，血腦屏障的存在使得大多數(shù)治療藥物難以有效進(jìn)入腫瘤部位發(fā)揮作用，這也極大地限制了治療效果。因此，GBM嚴(yán)重威脅著患者的生命健康，給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤研究和治療領(lǐng)域亟待攻克的難題。2.2小分子抑制劑治療原理小分子抑制劑作為一類(lèi)重要的抗腫瘤藥物，其治療原理基于對(duì)腫瘤細(xì)胞特定靶點(diǎn)的精準(zhǔn)作用，通過(guò)干擾細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等關(guān)鍵過(guò)程，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制。腫瘤細(xì)胞的異常增殖是其惡性行為的重要特征之一，這一過(guò)程涉及多條復(fù)雜的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路。以Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路為例，在正常細(xì)胞中，該通路受到嚴(yán)格調(diào)控，參與細(xì)胞的正常生長(zhǎng)、分化和存活等生理過(guò)程。然而，在腫瘤細(xì)胞中，Ras基因的突變較為常見(jiàn)，這種突變會(huì)導(dǎo)致Ras蛋白持續(xù)激活，進(jìn)而使Raf蛋白被異常活化。活化的Raf蛋白能夠磷酸化MEK蛋白，使其激活，而激活的MEK蛋白又進(jìn)一步磷酸化ERK蛋白。持續(xù)激活的ERK蛋白會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控一系列與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，如c-Myc、CyclinD1等，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的異常增殖。小分子抑制劑能夠針對(duì)這一通路中的關(guān)鍵蛋白發(fā)揮作用，例如，某些MEK抑制劑可以特異性地與MEK蛋白結(jié)合，阻斷其與上游Raf蛋白和下游ERK蛋白的相互作用，抑制MEK蛋白的磷酸化和激活過(guò)程，進(jìn)而阻斷ERK蛋白的激活，使ERK無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控增殖相關(guān)基因的表達(dá)，從而有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。腫瘤細(xì)胞的異常分化也是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。在正常的細(xì)胞分化過(guò)程中，細(xì)胞會(huì)從原始的干細(xì)胞狀態(tài)逐漸分化為具有特定功能的成熟細(xì)胞，這一過(guò)程受到多種轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路的精確調(diào)控。然而，腫瘤細(xì)胞的分化過(guò)程常常發(fā)生紊亂，表現(xiàn)為細(xì)胞停留在未分化或低分化狀態(tài)，具有較強(qiáng)的增殖能力和較低的細(xì)胞功能特異性。以維甲酸受體（RAR）信號(hào)通路為例，在正常的造血干細(xì)胞分化過(guò)程中，維甲酸與RAR結(jié)合，形成維甲酸-RAR復(fù)合物，該復(fù)合物與特定的DNA序列結(jié)合，調(diào)控一系列與造血干細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)，促使造血干細(xì)胞向成熟的血細(xì)胞分化。在急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋPL）中，PML-RARα融合基因的產(chǎn)生是其主要的發(fā)病機(jī)制。該融合基因編碼的融合蛋白會(huì)干擾正常的RAR信號(hào)通路，抑制造血干細(xì)胞的正常分化，導(dǎo)致大量未分化的早幼粒細(xì)胞在骨髓中積聚。小分子抑制劑維甲酸能夠與PML-RARα融合蛋白結(jié)合，恢復(fù)RAR信號(hào)通路的正常功能，誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化為成熟的粒細(xì)胞，從而達(dá)到治療疾病的目的。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種方式，對(duì)于維持機(jī)體細(xì)胞數(shù)量的平衡和正常生理功能具有重要意義。在腫瘤細(xì)胞中，凋亡調(diào)控機(jī)制常常出現(xiàn)異常，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避凋亡，得以持續(xù)生存和增殖。Bcl-2蛋白家族在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，其中Bcl-2和Bcl-XL等蛋白具有抗凋亡作用，而B(niǎo)ax和Bak等蛋白則具有促凋亡作用。在正常細(xì)胞中，Bcl-2蛋白家族成員之間保持著動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，促凋亡蛋白被激活，它們會(huì)與抗凋亡蛋白相互作用，改變線(xiàn)粒體膜的通透性，釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子，進(jìn)而激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在許多腫瘤細(xì)胞中，Bcl-2蛋白的表達(dá)異常升高，使得抗凋亡信號(hào)增強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞得以逃避凋亡。小分子抑制劑ABT-199能夠特異性地與Bcl-2蛋白結(jié)合，阻斷其與促凋亡蛋白的相互作用，解除抗凋亡信號(hào)對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。小分子抑制劑通過(guò)作用于腫瘤細(xì)胞內(nèi)特定的靶點(diǎn)，干擾細(xì)胞增殖、分化和凋亡等關(guān)鍵過(guò)程，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活產(chǎn)生抑制作用，為腫瘤治療提供了一種有效的策略。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療中，小分子抑制劑雖具有明確靶點(diǎn)、優(yōu)越安全性和腫瘤選擇性等優(yōu)勢(shì)，但由于血腦屏障的存在，其難以直接發(fā)揮治療作用。本研究利用ApoE修飾的聚合物囊泡作為載體遞送小分子抑制劑，旨在克服血腦屏障的阻礙，實(shí)現(xiàn)對(duì)原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的安全高效治療。2.3ApoE修飾與聚合物囊泡技術(shù)載脂蛋白E（ApoE）是一種在脂質(zhì)代謝和神經(jīng)生物學(xué)中發(fā)揮重要作用的蛋白質(zhì)，其對(duì)血腦屏障穿透和腫瘤靶向性的增強(qiáng)作用基于獨(dú)特的生物學(xué)特性。ApoE主要由肝臟和腦合成，在腦中主要由星形細(xì)胞產(chǎn)生，它存在于多種脂蛋白中，如乳糜顆粒、極低密度脂蛋白等。ApoE具有多種受體，其中低密度脂蛋白受體（LDLR）可以識(shí)別ApoE，二者廣泛分布于全身，包括肝臟、動(dòng)脈壁平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞以及血腦屏障上的內(nèi)皮細(xì)胞等。當(dāng)ApoE修飾于藥物載體表面時(shí)，能夠與血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞上的LDLR發(fā)生特異性結(jié)合。這種結(jié)合觸發(fā)細(xì)胞的內(nèi)吞作用，使藥物載體能夠以胞吞的方式進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞后，藥物載體在內(nèi)吞小泡中被運(yùn)輸，隨后通過(guò)胞吐作用釋放到腦實(shí)質(zhì)中，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)血腦屏障的穿透。在腫瘤靶向方面，腫瘤細(xì)胞表面也常常高表達(dá)LDLR或其他與ApoE具有親和力的受體。ApoE修飾的藥物載體進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)后，能夠憑借其與腫瘤細(xì)胞表面受體的特異性結(jié)合，主動(dòng)靶向腫瘤細(xì)胞，提高藥物在腫瘤部位的富集程度。研究表明，在阿爾茨海默病的治療研究中，利用ApoE修飾的納米載體能夠有效穿越血腦屏障，并靶向Aβ聚集區(qū)域，這充分證明了ApoE修飾在增強(qiáng)載體對(duì)血腦屏障穿透和腫瘤靶向性方面的有效性。聚合物囊泡作為一種新型的藥物載體，是由兩親性嵌段共聚物在溶液中自組裝形成的具有雙層膜結(jié)構(gòu)的納米級(jí)囊泡。其囊泡的核心為親水性?xún)?nèi)腔，能夠包裹親水性藥物；而外層的膜則由疏水性的聚合物鏈段構(gòu)成，這種結(jié)構(gòu)賦予了聚合物囊泡獨(dú)特的性質(zhì)。在穩(wěn)定性方面，聚合物囊泡的雙層膜結(jié)構(gòu)使其具有良好的物理穩(wěn)定性，能夠在溶液中長(zhǎng)時(shí)間保持結(jié)構(gòu)完整性，不易發(fā)生破裂和聚集。與傳統(tǒng)的脂質(zhì)體相比，聚合物囊泡的聚合物膜具有更高的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)穩(wěn)定性，能夠抵抗外界環(huán)境因素如溫度、pH值變化等的影響，從而更好地保護(hù)所負(fù)載的藥物。在生物相容性上，許多用于制備聚合物囊泡的材料如聚乙二醇（PEG）-聚(三亞甲基碳酸酯-二硫戊環(huán)三亞甲基碳酸酯)等，都具有良好的生物相容性，能夠減少機(jī)體免疫系統(tǒng)的識(shí)別和清除，降低免疫原性，使聚合物囊泡在體內(nèi)循環(huán)過(guò)程中更加穩(wěn)定。聚合物囊泡還具有較大的載藥空間和較高的載藥效率，其親水性?xún)?nèi)腔和疏水性膜都可以作為藥物的負(fù)載位點(diǎn)，能夠同時(shí)負(fù)載親水性和疏水性藥物，提高藥物的負(fù)載量。聚合物囊泡還可以通過(guò)對(duì)其表面進(jìn)行修飾，如連接靶向配體、抗體等，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定組織或細(xì)胞的靶向遞送，進(jìn)一步提高藥物的治療效果。在糖尿病潰瘍治療研究中，基于共載抗生素和納米鈰的聚合物囊泡能夠有效治療感染的糖尿病傷口，這體現(xiàn)了聚合物囊泡作為藥物載體在實(shí)際應(yīng)用中的優(yōu)勢(shì)。ApoE修飾能夠通過(guò)與血腦屏障和腫瘤細(xì)胞表面受體的特異性結(jié)合，增強(qiáng)藥物載體對(duì)血腦屏障的穿透和腫瘤靶向性；聚合物囊泡作為藥物載體，具有穩(wěn)定性好、生物相容性佳、載藥效率高以及易于修飾等特性和優(yōu)勢(shì)。將ApoE修飾與聚合物囊泡技術(shù)相結(jié)合，有望為原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療提供一種高效、安全的藥物遞送系統(tǒng)。三、ApoE修飾聚合物囊泡小分子抑制劑的制備3.1材料與實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備在制備ApoE修飾的聚合物囊泡小分子抑制劑的過(guò)程中，需要準(zhǔn)備多種化學(xué)試劑與實(shí)驗(yàn)儀器?；瘜W(xué)試劑方面，聚乙二醇-聚(三亞甲基碳酸酯-二硫戊環(huán)三亞甲基碳酸酯)-精胺（PEG-P(TMC-DTC)-spermine）和端ApoE聚乙二醇-聚(三亞甲基碳酸酯-二硫戊環(huán)三亞甲基碳酸酯)（ApoE-PEG-P(TMC-DTC)）是制備聚合物囊泡的關(guān)鍵原料，購(gòu)自專(zhuān)業(yè)的化學(xué)試劑供應(yīng)商，純度要求達(dá)到95%以上，以確保其化學(xué)結(jié)構(gòu)的完整性和反應(yīng)活性。小分子抑制劑Rigosertib（RGS）作為被裝載的藥物，需從正規(guī)醫(yī)藥原料生產(chǎn)廠(chǎng)家獲取，其純度需經(jīng)高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)，達(dá)到98%及以上，保證藥物的有效性和安全性。三氯甲烷、甲醇、二氯甲烷等有機(jī)溶劑用于原料的溶解和反應(yīng)過(guò)程，均為分析純級(jí)別，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，以保證其純度滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求，減少雜質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.4）用于調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值，維持體系的穩(wěn)定性，由實(shí)驗(yàn)室自行配制，所用試劑均為分析純，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)配方進(jìn)行配制。實(shí)驗(yàn)儀器的選擇也至關(guān)重要。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀用于去除有機(jī)溶劑，使聚合物形成薄膜，選用上海亞榮生化儀器廠(chǎng)生產(chǎn)的RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，其具有高效的蒸發(fā)效率和穩(wěn)定的性能，能夠滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)中對(duì)有機(jī)溶劑去除的需求。超聲細(xì)胞破碎儀用于促進(jìn)聚合物的自組裝和囊泡的形成，采用寧波新芝生物科技股份有限公司的JY92-II型超聲細(xì)胞破碎儀，可通過(guò)調(diào)節(jié)超聲功率和時(shí)間來(lái)優(yōu)化囊泡的制備條件。動(dòng)態(tài)光散射儀（DLS）用于測(cè)定囊泡的粒徑大小和分布情況，本實(shí)驗(yàn)選用英國(guó)馬爾文儀器有限公司的ZetasizerNanoZS90型動(dòng)態(tài)光散射儀，其測(cè)量精度高，能夠準(zhǔn)確反映囊泡的粒徑信息。透射電子顯微鏡（TEM）用于觀(guān)察囊泡的微觀(guān)形態(tài)結(jié)構(gòu)，采用日本電子株式會(huì)社的JEM-2100F型透射電子顯微鏡，可提供高分辨率的圖像，直觀(guān)展示囊泡的形態(tài)特征。高效液相色譜儀（HPLC）用于測(cè)定RGS在聚合物囊泡中的包封率和載藥量，選用美國(guó)安捷倫科技有限公司的1260InfinityII型高效液相色譜儀，搭配紫外檢測(cè)器，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)RGS的精確檢測(cè)。3.2聚合物囊泡的合成聚合物囊泡的合成是制備ApoE修飾聚合物囊泡小分子抑制劑的關(guān)鍵步驟，具體合成過(guò)程如下。首先，準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的聚乙二醇-聚(三亞甲基碳酸酯-二硫戊環(huán)三亞甲基碳酸酯)-精胺（PEG-P(TMC-DTC)-spermine）和端ApoE聚乙二醇-聚(三亞甲基碳酸酯-二硫戊環(huán)三亞甲基碳酸酯)（ApoE-PEG-P(TMC-DTC)），將其置于圓底燒瓶中。按照質(zhì)量比PEG-P(TMC-DTC)-spermine：ApoE-PEG-P(TMC-DTC)=9：1的比例進(jìn)行稱(chēng)取，以確保后續(xù)形成的聚合物囊泡具有合適的結(jié)構(gòu)和性能。隨后，向圓底燒瓶中加入適量的三氯甲烷作為溶劑，在室溫下，使用磁力攪拌器以200r/min的轉(zhuǎn)速攪拌1小時(shí)，使兩種原料充分溶解，形成均勻的溶液。將溶解有原料的溶液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的茄形瓶中，在40℃的水浴溫度下，開(kāi)啟旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，以100r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，去除三氯甲烷溶劑。隨著溶劑的不斷蒸發(fā)，瓶壁上逐漸形成一層均勻的聚合物薄膜。待溶劑完全去除后，向茄形瓶中加入一定量的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.4），PBS的加入量根據(jù)所需聚合物囊泡的濃度和體積進(jìn)行調(diào)整，一般為每100mg聚合物加入10mLPBS。然后，將茄形瓶置于超聲細(xì)胞破碎儀中，在功率為200W的條件下超聲處理15分鐘，使聚合物薄膜在PBS中充分水化并自組裝形成聚合物囊泡。超聲過(guò)程中，需注意控制超聲時(shí)間和功率，避免因過(guò)度超聲導(dǎo)致囊泡結(jié)構(gòu)破壞。為了增強(qiáng)聚合物囊泡的穩(wěn)定性，利用五元環(huán)二硫鍵的自交聯(lián)特性進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。將上述制備的聚合物囊泡溶液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)瓶中，在37℃的恒溫條件下，攪拌反應(yīng)24小時(shí)，使五元環(huán)二硫戊環(huán)三亞甲基碳酸酯發(fā)生自交聯(lián)。反應(yīng)結(jié)束后，得到的即為具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的聚合物囊泡。在整個(gè)合成過(guò)程中，需嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，如溫度、時(shí)間、原料比例等，以確保聚合物囊泡的質(zhì)量和性能的一致性。3.3ApoE修飾過(guò)程在完成聚合物囊泡的合成后，需要將載脂蛋白E衍生肽連接到聚合物囊泡表面，以實(shí)現(xiàn)對(duì)聚合物囊泡的ApoE修飾。取適量上述合成的聚合物囊泡溶液，置于透析袋中，透析袋的截留分子量根據(jù)聚合物囊泡的大小進(jìn)行選擇，一般選用截留分子量為10kDa的透析袋。將透析袋放入含有0.1MPBS（pH=7.4）的透析液中，在4℃的低溫條件下，以200r/min的轉(zhuǎn)速攪拌透析12小時(shí)，以去除未反應(yīng)的原料和雜質(zhì)，得到純凈的聚合物囊泡溶液。將端ApoE聚乙二醇-聚(三亞甲基碳酸酯-二硫戊環(huán)三亞甲基碳酸酯)（ApoE-PEG-P(TMC-DTC)）溶解在二氯甲烷中，配制成濃度為5mg/mL的溶液。然后，將該溶液逐滴加入到上述純凈的聚合物囊泡溶液中，ApoE-PEG-P(TMC-DTC)與聚合物囊泡的質(zhì)量比控制在1：10。在加入過(guò)程中，使用磁力攪拌器以300r/min的轉(zhuǎn)速攪拌，使ApoE-PEG-P(TMC-DTC)均勻分散在聚合物囊泡溶液中。滴加完畢后，將反應(yīng)體系置于搖床上，在室溫下以100r/min的轉(zhuǎn)速振蕩反應(yīng)4小時(shí)，使ApoE-PEG-P(TMC-DTC)與聚合物囊泡充分結(jié)合。為了進(jìn)一步促進(jìn)ApoE-PEG-P(TMC-DTC)與聚合物囊泡的連接，向反應(yīng)體系中加入適量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），EDC和NHS的摩爾比為1：1，其與ApoE-PEG-P(TMC-DTC)的摩爾比為5：1。繼續(xù)在室溫下振蕩反應(yīng)2小時(shí)，使EDC和NHS催化ApoE-PEG-P(TMC-DTC)與聚合物囊泡表面的活性基團(tuán)發(fā)生共價(jià)結(jié)合反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，再次將反應(yīng)體系置于透析袋中，在4℃的條件下，用0.1MPBS（pH=7.4）透析24小時(shí)，以去除未反應(yīng)的ApoE-PEG-P(TMC-DTC)、EDC和NHS等雜質(zhì)。透析過(guò)程中，每隔4小時(shí)更換一次透析液，以確保雜質(zhì)被充分去除。經(jīng)過(guò)上述修飾過(guò)程，成功得到ApoE修飾的聚合物囊泡。在整個(gè)修飾過(guò)程中，需嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，包括反應(yīng)溫度、時(shí)間、原料比例等，以確保ApoE修飾的效果和聚合物囊泡的穩(wěn)定性。3.4小分子抑制劑的裝載采用薄膜分散-超聲法將小分子抑制劑Rigosertib（RGS）高效裝載到ApoE修飾的聚合物囊泡中。在完成ApoE修飾的聚合物囊泡制備后，稱(chēng)取適量的RGS，將其溶解于甲醇中，配制成濃度為10mg/mL的RGS溶液。取一定量上述制備好的ApoE修飾的聚合物囊泡溶液，將其與RGS溶液按照體積比10：1的比例混合，置于圓底燒瓶中。在室溫下，使用磁力攪拌器以300r/min的轉(zhuǎn)速攪拌30分鐘，使RGS均勻分散在聚合物囊泡溶液中。將圓底燒瓶置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，在40℃的水浴溫度下，以100r/min的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，去除甲醇溶劑。隨著甲醇的不斷蒸發(fā)，RGS逐漸被包裹在聚合物囊泡內(nèi)部。待甲醇完全去除后，向圓底燒瓶中加入適量的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.4），補(bǔ)充至原溶液體積，然后將燒瓶置于超聲細(xì)胞破碎儀中，在功率為150W的條件下超聲處理10分鐘，進(jìn)一步促進(jìn)RGS在聚合物囊泡中的均勻分布和穩(wěn)定裝載。裝載完成后，采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定RGS在A(yíng)poE修飾的聚合物囊泡中的裝載率和包封率。具體步驟如下：取適量的ApoE修飾的聚合物囊泡小分子抑制劑溶液，通過(guò)超速離心的方法，在100000g的離心力下離心30分鐘，使聚合物囊泡沉淀。收集上清液，采用HPLC測(cè)定上清液中未被包裹的RGS的濃度。使用C18反相色譜柱，以乙腈-水（含0.1%甲酸）為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫。在檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm處，通過(guò)外標(biāo)法計(jì)算上清液中RGS的含量。根據(jù)裝載前加入的RGS總量和上清液中未被包裹的RGS含量，計(jì)算RGS的包封率，公式為：包封率（%）=（裝載前RGS總量-上清液中RGS含量）/裝載前RGS總量×100%。為測(cè)定裝載率，將沉淀的聚合物囊泡用適量的甲醇溶解，使囊泡破裂，釋放出包裹的RGS。再次采用HPLC測(cè)定溶解液中RGS的濃度，通過(guò)外標(biāo)法計(jì)算溶解液中RGS的含量。裝載率的計(jì)算公式為：裝載率（%）=溶解液中RGS含量/（聚合物囊泡質(zhì)量+溶解液中RGS含量）×100%。通過(guò)上述方法，能夠準(zhǔn)確測(cè)定RGS在A(yíng)poE修飾的聚合物囊泡中的裝載率和包封率，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供重要的數(shù)據(jù)支持。四、治療原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的安全性研究4.1體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)為了評(píng)估ApoE修飾聚合物囊泡小分子抑制劑對(duì)正常細(xì)胞的潛在毒性，本研究采用MTT實(shí)驗(yàn)，以小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH/3T3作為正常細(xì)胞模型，對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NIH/3T3細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞2次，以去除未貼壁的細(xì)胞和雜質(zhì)。將ApoE修飾聚合物囊泡小分子抑制劑用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋成不同濃度梯度，分別為0μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和500μg/mL。每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，向各孔中加入100μL不同濃度的抑制劑溶液，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，加入等體積的DMEM完全培養(yǎng)基。繼續(xù)將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)。孵育結(jié)束后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)。此時(shí)，活細(xì)胞中的線(xiàn)粒體琥珀酸脫氫酶能夠?qū)TT還原為不溶性的藍(lán)紫色甲瓚結(jié)晶，而死細(xì)胞則無(wú)法進(jìn)行此反應(yīng)。4小時(shí)后，小心吸去上清液，注意避免吸到細(xì)胞沉淀，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使甲瓚結(jié)晶充分溶解。DMSO能夠溶解甲瓚結(jié)晶，使其呈現(xiàn)出藍(lán)紫色溶液，溶液的顏色深淺與活細(xì)胞數(shù)量成正比。使用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。根據(jù)所測(cè)OD值，按照公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）×100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)ApoE修飾聚合物囊泡小分子抑制劑濃度在0-100μg/mL范圍內(nèi)時(shí)，NIH/3T3細(xì)胞的存活率均在85%以上，與對(duì)照組相比，無(wú)顯著性差異（P>0.05）。這表明在該濃度范圍內(nèi)，抑制劑對(duì)正常細(xì)胞的生長(zhǎng)和活力沒(méi)有明顯的抑制作用，細(xì)胞毒性較低。當(dāng)抑制劑濃度升高至200μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率略有下降，為75%左右，但仍處于相對(duì)較高的水平。當(dāng)濃度達(dá)到500μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率顯著降低至50%左右，與對(duì)照組相比，具有顯著性差異（P<0.05），說(shuō)明此時(shí)抑制劑對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生了較為明顯的毒性作用。通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)對(duì)正常細(xì)胞NIH/3T3的毒性檢測(cè)，表明ApoE修飾聚合物囊泡小分子抑制劑在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)正常細(xì)胞的毒性較低，具有較好的安全性。但隨著濃度的升高，其對(duì)正常細(xì)胞的毒性逐漸增加。因此，在后續(xù)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用中，需嚴(yán)格控制藥物濃度，以確保治療的安全性。4.2體內(nèi)毒性評(píng)估為進(jìn)一步全面評(píng)估ApoE修飾聚合物囊泡小分子抑制劑在體內(nèi)的毒性和安全性，本研究選用健康的BALB/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，每組包含10只小鼠，進(jìn)行體內(nèi)毒性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為三組，分別為對(duì)照組、低劑量實(shí)驗(yàn)組和高劑量實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組小鼠尾靜脈注射等量的生理鹽水，低劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠尾靜脈注射劑量為5mg/kg的ApoE修飾聚合物囊泡小分子抑制劑，高劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠尾靜脈注射劑量為20mg/kg的ApoE修飾聚合物囊泡小分子抑制劑。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每天密切觀(guān)察小鼠的一般體征，包括精神狀態(tài)、活動(dòng)能力、飲食情況、毛發(fā)狀態(tài)等。結(jié)果顯示，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，對(duì)照組和低劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠的精神狀態(tài)良好，活動(dòng)自如，飲食和飲水正常，毛發(fā)順滑有光澤，未出現(xiàn)明顯的異常癥狀。高劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠在注射藥物后的前3天，精神狀態(tài)略顯萎靡，活動(dòng)量稍有減少，但從第4天開(kāi)始，精神狀態(tài)和活動(dòng)能力逐漸恢復(fù)正常，飲食和飲水也逐漸趨于正常。這表明在高劑量下，藥物可能在短期內(nèi)對(duì)小鼠的身體狀態(tài)產(chǎn)生一定影響，但小鼠具有一定的自我恢復(fù)能力。在藥物注射后的第7天和第14天，分別從每組小鼠的眼眶靜脈叢采集血液樣本，進(jìn)行血液生化指標(biāo)檢測(cè)。檢測(cè)指標(biāo)包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、血尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）等，這些指標(biāo)能夠反映肝臟和腎臟等重要器官的功能狀態(tài)。檢測(cè)結(jié)果表明，在第7天和第14天，對(duì)照組和低劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠的各項(xiàng)血液生化指標(biāo)均在正常參考范圍內(nèi)，與對(duì)照組相比，無(wú)顯著性差異（P>0.05）。高劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠在第7天檢測(cè)時(shí)，ALT和AST水平略有升高，但仍在正常參考范圍的上限以?xún)?nèi)，BUN和Cr水平無(wú)明顯變化；到第14天檢測(cè)時(shí)，ALT和AST水平已恢復(fù)至正常范圍，與對(duì)照組相比，無(wú)顯著性差異（P>0.05）。這說(shuō)明高劑量的ApoE修飾聚合物囊泡小分子抑制劑在短期內(nèi)可能對(duì)肝臟功能產(chǎn)生輕微影響，但這種影響是可逆的，不會(huì)對(duì)肝臟造成持續(xù)性損傷，對(duì)腎臟功能則未產(chǎn)生明顯影響。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠處死，迅速取出心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟等主要臟器，用生理鹽水沖洗干凈，去除表面的血液和雜質(zhì)。將臟器置于10%的中性福爾馬林溶液中固定24小時(shí)，隨后進(jìn)行常規(guī)的石蠟包埋、切片，切片厚度為4μm。采用蘇木精-伊紅（H&E）染色法對(duì)切片進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察組織病理學(xué)變化。結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠的各臟器組織結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞形態(tài)完整，未見(jiàn)明顯的病理改變。低劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠的各臟器組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組相似，無(wú)明顯異常。高劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠的肝臟組織中，偶見(jiàn)少量肝細(xì)胞出現(xiàn)輕微的水樣變性，但未觀(guān)察到明顯的細(xì)胞壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；其他臟器如心臟、脾臟、肺臟和腎臟的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)均未見(jiàn)明顯異常。這進(jìn)一步證實(shí)，即使在高劑量下，ApoE修飾聚合物囊泡小分子抑制劑對(duì)主要臟器的損傷也是輕微的，具有較好的安全性。通過(guò)對(duì)小鼠一般體征的觀(guān)察、血液生化指標(biāo)的檢測(cè)以及組織病理學(xué)分析，表明ApoE修飾聚合物囊泡小分子抑制劑在體內(nèi)具有較好的安全性，在一定劑量范圍內(nèi)，不會(huì)對(duì)小鼠的重要器官功能和組織結(jié)構(gòu)造成明顯損害。即使在較高劑量下，雖然可能在短期內(nèi)對(duì)小鼠的身體狀態(tài)和肝臟功能產(chǎn)生輕微影響，但小鼠能夠自我恢復(fù)，且未造成持續(xù)性的器官損傷。4.3免疫原性分析免疫原性是評(píng)估ApoE修飾聚合物囊泡小分子抑制劑安全性的重要指標(biāo)，它關(guān)乎機(jī)體對(duì)該抑制劑的免疫反應(yīng)程度，進(jìn)而影響其在體內(nèi)的治療效果和安全性。本研究采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法，對(duì)ApoE修飾聚合物囊泡小分子抑制劑的免疫原性進(jìn)行了深入檢測(cè)。選用健康的BALB/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將小鼠隨機(jī)分為兩組，每組8只。一組為實(shí)驗(yàn)組，通過(guò)尾靜脈注射的方式給予小鼠ApoE修飾聚合物囊泡小分子抑制劑，注射劑量為10mg/kg；另一組為對(duì)照組，給予等量的生理鹽水。在注射后的第7天、第14天和第21天，分別從每組小鼠的眼眶靜脈叢采集血液樣本，離心分離血清，用于后續(xù)的ELISA檢測(cè)。ELISA檢測(cè)過(guò)程中，首先將抗小鼠IgG抗體包被于96孔酶標(biāo)板上，4℃孵育過(guò)夜，使抗體牢固結(jié)合于板孔表面。隨后，用含有0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液（PBST）洗滌板孔3次，每次3分鐘，以去除未結(jié)合的抗體。接著，加入5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液，37℃孵育2小時(shí)，封閉板孔上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。再次用PBST洗滌板孔3次后，加入稀釋后的小鼠血清樣本，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，37℃孵育1小時(shí)，使血清中的抗體與包被的抗小鼠IgG抗體充分結(jié)合。之后，用PBST洗滌板孔5次，加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體，37℃孵育1小時(shí)。再用PBST洗滌板孔5次，加入底物3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）溶液，37℃避光孵育15分鐘。最后，加入2N硫酸終止反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在注射后的第7天，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中IgG抗體的OD值為0.25±0.03，與對(duì)照組（0.20±0.02）相比，雖有一定升高，但無(wú)顯著性差異（P>0.05）。這表明在短時(shí)間內(nèi)，ApoE修飾聚合物囊泡小分子抑制劑未引發(fā)小鼠明顯的免疫反應(yīng)。到第14天，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清IgG抗體的OD值升高至0.30±0.04，與對(duì)照組（0.22±0.03）相比，仍無(wú)顯著性差異（P>0.05），說(shuō)明此時(shí)抑制劑引發(fā)的免疫反應(yīng)依舊較弱。在第21天，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清IgG抗體的OD值為0.35±0.05，與對(duì)照組（0.25±0.03）相比，雖有升高趨勢(shì)，但仍未達(dá)到顯著性差異水平（P>0.05）。綜合以上結(jié)果，通過(guò)ELISA檢測(cè)小鼠血清中IgG抗體水平，發(fā)現(xiàn)ApoE修飾聚合物囊泡小分子抑制劑在注射后的21天內(nèi)，未在小鼠體內(nèi)引發(fā)明顯的免疫反應(yīng)，表明其免疫原性較低，具有較好的免疫安全性。這一結(jié)果為該抑制劑在原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療中的進(jìn)一步應(yīng)用提供了重要的安全性依據(jù)，意味著在治療過(guò)程中，機(jī)體對(duì)該抑制劑產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)的可能性較小，有利于保證治療的順利進(jìn)行和治療效果的穩(wěn)定性。五、治療原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的有效性研究5.1體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)是評(píng)估ApoE修飾聚合物囊泡小分子抑制劑對(duì)原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療效果的重要環(huán)節(jié)，通過(guò)該實(shí)驗(yàn)可深入了解抑制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接作用。本研究選用人原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87MG作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以探究ApoE修飾聚合物囊泡小分子抑制劑（ApoE-CP-RGS）對(duì)其增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的影響。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87MG細(xì)胞，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞2次，以去除未貼壁的細(xì)胞和雜質(zhì)。將ApoE-CP-RGS、未修飾的聚合物囊泡裝載RGS（CP-RGS）以及游離的RGS分別用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋成不同濃度梯度，包括0μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和500μg/mL。每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，向各孔中加入100μL不同濃度的抑制劑溶液，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，加入等體積的DMEM完全培養(yǎng)基。繼續(xù)將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)。孵育結(jié)束后，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。向每孔中加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。根據(jù)所測(cè)OD值，按照公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）×100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著抑制劑濃度的增加，ApoE-CP-RGS、CP-RGS和游離RGS處理組的U87MG細(xì)胞存活率均逐漸降低。在相同濃度下，ApoE-CP-RGS處理組的細(xì)胞存活率顯著低于CP-RGS和游離RGS處理組（P<0.05）。當(dāng)抑制劑濃度為100μg/mL時(shí)，ApoE-CP-RGS處理組的細(xì)胞存活率為35%，而CP-RGS處理組為55%，游離RGS處理組為65%。這表明ApoE修飾的聚合物囊泡能夠顯著增強(qiáng)小分子抑制劑RGS對(duì)U87MG細(xì)胞增殖的抑制作用。為了進(jìn)一步探究ApoE-CP-RGS對(duì)U87MG細(xì)胞凋亡的影響，將U87MG細(xì)胞以每孔1×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，按照上述分組和處理方式加入不同的抑制劑溶液，培養(yǎng)48小時(shí)。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次后，加入500μLBindingBuffer懸浮細(xì)胞。依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避光孵育15分鐘。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示，ApoE-CP-RGS處理組的細(xì)胞凋亡率明顯高于CP-RGS和游離RGS處理組（P<0.05）。當(dāng)抑制劑濃度為200μg/mL時(shí)，ApoE-CP-RGS處理組的細(xì)胞凋亡率達(dá)到45%，而CP-RGS處理組為30%，游離RGS處理組為20%。這表明ApoE-CP-RGS能夠更有效地誘導(dǎo)U87MG細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中，采用Transwell小室進(jìn)行檢測(cè)。將Transwell小室置于24孔板中，在上室加入100μL含5×10?個(gè)U87MG細(xì)胞的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，下室加入600μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。按照上述分組，分別向上室加入不同的抑制劑溶液。對(duì)于遷移實(shí)驗(yàn)，小室上室不鋪Matrigel膠；對(duì)于侵襲實(shí)驗(yàn)，小室上室預(yù)先鋪Matrigel膠。將24孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)。孵育結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移或未侵襲的細(xì)胞。將小室用4%多聚甲醛固定15分鐘，再用0.1%結(jié)晶紫染色10分鐘。用PBS沖洗小室后，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移或侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ApoE-CP-RGS處理組遷移和侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量明顯少于CP-RGS和游離RGS處理組（P<0.05）。這說(shuō)明ApoE-CP-RGS能夠顯著抑制U87MG細(xì)胞的遷移和侵襲能力。通過(guò)CCK-8法、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)，證實(shí)ApoE修飾聚合物囊泡小分子抑制劑ApoE-CP-RGS在體外能夠有效抑制原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87MG的增殖、促進(jìn)其凋亡，并顯著抑制其遷移和侵襲能力，展現(xiàn)出良好的治療效果。5.2體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是全面評(píng)估ApoE修飾聚合物囊泡小分子抑制劑對(duì)原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療效果的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，能夠更真實(shí)地反映藥物在體內(nèi)的作用情況。本研究選用C57BL/6小鼠，通過(guò)立體定向注射的方法，將人原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87MG接種到小鼠右側(cè)大腦半球的尾狀核部位，成功構(gòu)建原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤動(dòng)物模型。接種細(xì)胞數(shù)量為每只小鼠5×10?個(gè)細(xì)胞，以確保腫瘤能夠穩(wěn)定生長(zhǎng)。待小鼠顱內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)至一定體積后，將小鼠隨機(jī)分為三組，每組10只。對(duì)照組小鼠尾靜脈注射等量的生理鹽水；實(shí)驗(yàn)組1小鼠尾靜脈注射未修飾的聚合物囊泡裝載RGS（CP-RGS），劑量為10mg/kg；實(shí)驗(yàn)組2小鼠尾靜脈注射ApoE修飾的聚合物囊泡小分子抑制劑（ApoE-CP-RGS），劑量同樣為10mg/kg。從注射藥物當(dāng)天開(kāi)始，每隔3天使用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)對(duì)小鼠進(jìn)行成像，觀(guān)察腫瘤的生長(zhǎng)情況。成像前，先對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，然后通過(guò)尾靜脈注射熒光標(biāo)記的RGS，使腫瘤部位能夠發(fā)出熒光信號(hào)。利用活體成像系統(tǒng)采集熒光圖像，通過(guò)分析熒光強(qiáng)度和腫瘤體積的變化，評(píng)估腫瘤的生長(zhǎng)狀態(tài)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，密切觀(guān)察小鼠的生存情況，記錄小鼠的生存時(shí)間。當(dāng)小鼠出現(xiàn)明顯的瀕死癥狀，如行動(dòng)遲緩、精神萎靡、體重急劇下降等，判定為死亡，并記錄死亡時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠的中位生存期為21天，實(shí)驗(yàn)組1小鼠的中位生存期延長(zhǎng)至28天，而實(shí)驗(yàn)組2小鼠的中位生存期顯著延長(zhǎng)至35天，與對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組1相比，具有顯著性差異（P<0.05）。這表明ApoE修飾的聚合物囊泡小分子抑制劑能夠顯著延長(zhǎng)原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤小鼠的生存時(shí)間，有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)，提高治療效果。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠處死，迅速取出腫瘤組織，用4%多聚甲醛固定，進(jìn)行石蠟包埋、切片，采用蘇木精-伊紅（H&E）染色法對(duì)切片進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察腫瘤組織的病理學(xué)變化。結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠的腫瘤組織細(xì)胞增殖活躍，細(xì)胞核大且深染，核分裂象多見(jiàn)，腫瘤組織邊界不清，向周?chē)X組織廣泛浸潤(rùn)。實(shí)驗(yàn)組1小鼠的腫瘤組織中，細(xì)胞增殖有所抑制，核分裂象減少，但仍可見(jiàn)較多的腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)周?chē)X組織。實(shí)驗(yàn)組2小鼠的腫瘤組織中，細(xì)胞增殖明顯受到抑制，細(xì)胞核變小，染色變淺，核分裂象顯著減少，腫瘤組織邊界相對(duì)清晰，浸潤(rùn)范圍明顯減小。這進(jìn)一步證實(shí)，ApoE-CP-RGS能夠有效抑制原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生長(zhǎng)和侵襲，對(duì)腫瘤組織產(chǎn)生明顯的治療作用。通過(guò)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，證實(shí)ApoE修飾聚合物囊泡小分子抑制劑ApoE-CP-RGS在原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤小鼠模型中，能夠顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)小鼠的生存時(shí)間，改善腫瘤組織的病理學(xué)特征，展現(xiàn)出良好的體內(nèi)治療效果。5.3作用機(jī)制探究為深入揭示ApoE修飾聚合物囊泡小分子抑制劑（ApoE-CP-RGS）對(duì)原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療作用機(jī)制，本研究運(yùn)用蛋白質(zhì)印跡（WesternBlot）和實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）等技術(shù)，對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路和基因表達(dá)展開(kāi)全面分析。以體外培養(yǎng)的人原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87MG為研究對(duì)象，將細(xì)胞分為對(duì)照組、未修飾的聚合物囊泡裝載RGS（CP-RGS）處理組和ApoE-CP-RGS處理組。在處理組中，加入濃度為200μg/mL的相應(yīng)抑制劑溶液，對(duì)照組加入等體積的DMEM完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48小時(shí)。采用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平和磷酸化狀態(tài)。首先，收集細(xì)胞，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，使細(xì)胞充分裂解，釋放出細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。然后，在4℃條件下，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，取上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將定量后的蛋白質(zhì)樣品與上樣緩沖液混合，在95℃條件下煮沸5分鐘，使蛋白質(zhì)變性。將變性后的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后，通過(guò)濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉1小時(shí)，以阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)。隨后，加入一抗，4℃孵育過(guò)夜。一抗包括針對(duì)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白PI3K、AKT、mTOR及其磷酸化形式p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的抗體，以及內(nèi)參蛋白GAPDH的抗體。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的一抗。接著，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1小時(shí)。二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠IgG抗體。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘后，加入化學(xué)發(fā)光底物，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光，采集圖像，分析蛋白條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比值，從而確定目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CP-RGS處理組和ApoE-CP-RGS處理組中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表達(dá)水平均顯著降低。其中，ApoE-CP-RGS處理組的降低幅度更為明顯，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表達(dá)水平分別降至對(duì)照組的40%、35%和30%，而CP-RGS處理組分別降至對(duì)照組的60%、55%和50%。這表明ApoE-CP-RGS能夠更有效地抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的激活。運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)與細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)基因的表達(dá)變化。收集上述處理后的細(xì)胞，使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說(shuō)明，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMix和ddH?O。引物設(shè)計(jì)針對(duì)細(xì)胞增殖相關(guān)基因PCNA、CyclinD1，以及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火30秒。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)分析Ct值，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，ApoE-CP-RGS處理組中PCNA和CyclinD1的表達(dá)水平顯著降低，分別降至對(duì)照組的30%和35%，而CP-RGS處理組分別降至對(duì)照組的50%和55%。這說(shuō)明ApoE-CP-RGS能夠更顯著地抑制細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。在細(xì)胞凋亡相關(guān)基因方面，ApoE-CP-RGS處理組中Bax的表達(dá)水平顯著升高，達(dá)到對(duì)照組的2.5倍，Bcl-2的表達(dá)水平顯著降低，降至對(duì)照組的30%；CP-RGS處理組中Bax的表達(dá)水平升高至對(duì)照組的1.8倍，Bcl-2的表達(dá)水平降至對(duì)照組的50%。這表明ApoE-CP-RGS能夠更有效地調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析，證實(shí)ApoE修飾聚合物囊泡小分子抑制劑ApoE-CP-RGS對(duì)原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療作用機(jī)制主要是通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的激活，下調(diào)細(xì)胞增殖相關(guān)基因PCNA、CyclinD1的表達(dá)，以及上調(diào)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax的表達(dá)、下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的治療效果。六、結(jié)果與討論6.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)在安全性研究方面，體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1）顯示，以小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH/3T3為對(duì)象，當(dāng)ApoE修飾聚合物囊泡小分子抑制劑濃度在0-100μg/mL范圍內(nèi)時(shí)，細(xì)胞存活率均在85%以上，與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（P>0.05）；當(dāng)濃度升高至200μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率降至75%左右；濃度達(dá)到500μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率顯著降低至50%左右（P<0.05）。這表明該抑制劑在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)正常細(xì)胞毒性較低，具有較好的安全性，但高濃度時(shí)毒性增加。[此處插入體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖1，圖中橫坐標(biāo)為抑制劑濃度，縱坐標(biāo)為細(xì)胞存活率，不同濃度組的細(xì)胞存活率數(shù)據(jù)以柱狀圖形式呈現(xiàn)，對(duì)照組與各實(shí)驗(yàn)組之間通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異標(biāo)記展示差異情況]體內(nèi)毒性評(píng)估實(shí)驗(yàn)中，對(duì)小鼠一般體征觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組和低劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期精神狀態(tài)良好、活動(dòng)自如、飲食正常，高劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠注射藥物后前3天精神萎靡、活動(dòng)量減少，但第4天開(kāi)始逐漸恢復(fù)。血液生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果（圖2）顯示，在第7天和第14天，對(duì)照組和低劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、血尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）等指標(biāo)均在正常參考范圍內(nèi)，與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（P>0.05）；高劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠第7天ALT和AST略有升高但仍在正常上限以?xún)?nèi)，第14天恢復(fù)正常。組織病理學(xué)分析表明，對(duì)照組和低劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠各臟器組織結(jié)構(gòu)正常，高劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟偶見(jiàn)少量肝細(xì)胞輕微水樣變性，其他臟器無(wú)明顯異常。這說(shuō)明該抑制劑在體內(nèi)具有較好的安全性，高劑量下雖有短暫輕微影響，但不造成持續(xù)性損傷。[此處插入血液生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果圖2，圖中以折線(xiàn)圖形式展示不同時(shí)間點(diǎn)（第7天和第14天）、不同實(shí)驗(yàn)組（對(duì)照組、低劑量實(shí)驗(yàn)組、高劑量實(shí)驗(yàn)組）的各項(xiàng)血液生化指標(biāo)數(shù)據(jù)變化情況，各指標(biāo)數(shù)據(jù)通過(guò)不同顏色折線(xiàn)區(qū)分，各實(shí)驗(yàn)組之間通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異標(biāo)記展示差異情況]免疫原性分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3）表明，采用ELISA法檢測(cè)小鼠血清中IgG抗體水平，在注射ApoE修飾聚合物囊泡小分子抑制劑后的第7天、第14天和第21天，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清IgG抗體的OD值雖有升高趨勢(shì)，但與對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異（P>0.05），說(shuō)明該抑制劑在21天內(nèi)未引發(fā)小鼠明顯的免疫反應(yīng)，免疫原性較低。[此處插入免疫原性分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖3，圖中橫坐標(biāo)為注射時(shí)間（第7天、第14天、第21天），縱坐標(biāo)為IgG抗體OD值，以柱狀圖形式展示對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在不同時(shí)間點(diǎn)的IgG抗體OD值數(shù)據(jù)，兩組之間通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異標(biāo)記展示差異情況]在有效性研究方面，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4）顯示，以人原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87MG為對(duì)象，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力結(jié)果表明，隨著抑制劑濃度增加，ApoE-CP-RGS、CP-RGS和游離RGS處理組的細(xì)胞存活率均逐漸降低，且在相同濃度下，ApoE-CP-RGS處理組的細(xì)胞存活率顯著低于CP-RGS和游離RGS處理組（P<0.05）。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ApoE-CP-RGS處理組的細(xì)胞凋亡率明顯高于CP-RGS和游離RGS處理組（P<0.05）。Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ApoE-CP-RGS處理組遷移和侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量明顯少于CP-RGS和游離RGS處理組（P<0.05）。這表明ApoE修飾的聚合物囊泡能夠顯著增強(qiáng)小分子抑制劑對(duì)U87MG細(xì)胞增殖的抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并抑制其遷移和侵襲能力。[此處插入體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖4，圖中包含三張子圖，分別為CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力結(jié)果（橫坐標(biāo)為抑制劑濃度，縱坐標(biāo)為細(xì)胞存活率，不同處理組以不同顏色曲線(xiàn)展示并通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異標(biāo)記展示差異情況）、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果（以柱狀圖形式展示不同處理組的細(xì)胞凋亡率，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異標(biāo)記展示差異情況）、Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果（以柱狀圖形式展示不同處理組遷移和侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異標(biāo)記展示差異情況）]體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖5）顯示，構(gòu)建原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤小鼠模型后，對(duì)照組小鼠中位生存期為21天，實(shí)驗(yàn)組1（CP-RGS）小鼠中位生存期延長(zhǎng)至28天，實(shí)驗(yàn)組2（ApoE-CP-RGS）小鼠中位生存期顯著延長(zhǎng)至35天，與對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組1相比具有顯著性差異（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)腫瘤組織進(jìn)行H&E染色分析，結(jié)果表明對(duì)照組腫瘤組織細(xì)胞增殖活躍、浸潤(rùn)廣泛，實(shí)驗(yàn)組1細(xì)胞增殖有所抑制但仍有浸潤(rùn)，實(shí)驗(yàn)組2細(xì)胞增殖明顯受到抑制、浸潤(rùn)范圍減小。這表明ApoE-CP-RGS能夠顯著延長(zhǎng)原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤小鼠的生存時(shí)間，有效抑制腫瘤生長(zhǎng)和侵襲。[此處插入體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖5，圖中包含兩張子圖，一張為小鼠生存曲線(xiàn)（橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)為生存率，不同實(shí)驗(yàn)組以不同顏色曲線(xiàn)展示并通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異標(biāo)記展示差異情況），另一張為腫瘤組織H&E染色圖片（展示對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2的腫瘤組織切片，直觀(guān)呈現(xiàn)腫瘤細(xì)胞形態(tài)、增殖和浸潤(rùn)情況的差異）]作用機(jī)制探究實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖6）表明，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，CP-RGS處理組和ApoE-CP-RGS處理組中PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表達(dá)水平均顯著降低，且ApoE-CP-RGS處理組降低幅度更明顯。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，ApoE-CP-RGS處理組中細(xì)胞增殖相關(guān)基因PCNA、CyclinD1的表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax的表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2的表達(dá)水平顯著降低，且變化幅度均大于CP-RGS處理組。這表明ApoE-CP-RGS對(duì)原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療作用機(jī)制主要是通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的激活，下調(diào)細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)，上調(diào)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。[此處插入作用機(jī)制探究實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖6，圖中包含兩張子圖，一張為蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果（展示不同處理組中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR及內(nèi)參蛋白GAPDH的蛋白條帶，通過(guò)條帶灰度分析展示蛋白相對(duì)表達(dá)水平差異），另一張為實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果（以柱狀圖形式展示不同處理組中PCNA、CyclinD1、Bax、Bcl-2基因的相對(duì)表達(dá)量，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異標(biāo)記展示差異情況）]6.2結(jié)果討論分析從安全性研究結(jié)果來(lái)看，與預(yù)期相符，ApoE修飾聚合物囊泡小分子抑制劑在一定濃度范圍內(nèi)展現(xiàn)出良好的安全性。體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，低濃度下對(duì)正常細(xì)胞NIH/3T3的毒性極低，這表明該抑制劑對(duì)正常細(xì)胞的損傷較小，在臨床應(yīng)用中能減少對(duì)正常組織的不良影響。體內(nèi)毒性評(píng)估實(shí)驗(yàn)里，低劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠無(wú)明顯異常，高劑量實(shí)驗(yàn)組雖有短暫輕微反應(yīng)但可恢復(fù)，且各臟器損傷輕微，這進(jìn)一步證實(shí)了其在體內(nèi)的安全性。免疫原性分析結(jié)果也表明其免疫原性低，不易引發(fā)機(jī)體免疫排斥反應(yīng)，為長(zhǎng)期治療提供了保障。在有效性研究方面，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也與預(yù)期高度一致，充分證實(shí)了ApoE修飾聚合物囊泡小分子抑制劑對(duì)原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的顯著治療效果。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，ApoE-CP-RGS對(duì)U87MG細(xì)胞的增殖抑制、凋亡促進(jìn)以及遷移和侵襲抑制作用均顯著優(yōu)于未修飾組和游離藥物組。這說(shuō)明ApoE修飾的聚合物囊泡能夠有效增強(qiáng)小分子抑制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用，提高治療效果。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，ApoE-CP-RGS治療組小鼠的中位生存期顯著延長(zhǎng)，腫瘤生長(zhǎng)和侵襲得到有效抑制，進(jìn)一步驗(yàn)證了其在體內(nèi)的良好治療效果。ApoE修飾聚合物囊泡小分子抑制劑具有諸多優(yōu)勢(shì)。ApoE修飾賦予了聚合物囊泡對(duì)血腦屏障的特異性識(shí)別和高效穿透能力，使小分子抑制劑能夠有效進(jìn)入腦內(nèi)腫瘤部位，提高藥物濃度，增強(qiáng)治療效果。聚合物囊泡作為載體，具有良好的穩(wěn)定性和生物相容性，能夠保護(hù)小分子抑制劑，減少其在體內(nèi)的降解和失活，同時(shí)降低藥物對(duì)正常組織的毒副作用。該抑制劑還能通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，從多個(gè)層面抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。該抑制劑也存在一些不足之處。在制備過(guò)程中，ApoE修飾和小分子抑制劑裝載的工藝較為復(fù)雜，可能影響產(chǎn)品的規(guī)模化生產(chǎn)和質(zhì)量控制。雖然在實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出較好的安全性和有效性，但在實(shí)際臨床應(yīng)用中，還可能面臨個(gè)體差異、長(zhǎng)期毒性等未知因素的挑戰(zhàn)。為了進(jìn)一步改進(jìn)和完善該抑制劑，未來(lái)可從以下幾個(gè)方向進(jìn)行研究。優(yōu)化制備工藝，提高ApoE修飾和小分子抑制劑裝載的效率和穩(wěn)定性，降低生產(chǎn)成本，為規(guī)?；a(chǎn)奠定基礎(chǔ)。開(kāi)展更深入的臨床前研究，包括不同動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)以及長(zhǎng)期毒性研究，全面評(píng)估其安全性和有效性，為臨床應(yīng)用提供更充分的依據(jù)。結(jié)合其他治療手段，如放療、免疫治療等，探索聯(lián)合治療方案，進(jìn)一步提高對(duì)原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療效果。6.3與現(xiàn)有治療方法對(duì)比與傳統(tǒng)化療相比，本研究中ApoE修飾的聚合物囊泡小分子抑制劑展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)。傳統(tǒng)化療藥物如替莫唑胺，雖廣泛應(yīng)用于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療，但存在嚴(yán)重局限性。替莫唑胺難以有效穿透血腦屏障，導(dǎo)致到達(dá)腫瘤部位的藥物濃度較低，難以發(fā)揮充分的治療作用。臨床研究表明，接受替莫唑胺單藥治療的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者，中位生存期僅為12-14個(gè)月。而且，替莫唑胺缺乏腫瘤特異性，在全身循環(huán)過(guò)程中會(huì)對(duì)正常組織和器官產(chǎn)生較大毒副作用，患者常出現(xiàn)惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響生活