miR-29家族對奶牛乳腺上皮細胞泌乳調(diào)控機制的深度剖析一、引言1.1miRNA研究進展1.1.1miRNAs的發(fā)現(xiàn)與命名1993年，VictorAmbros等人在線蟲中發(fā)現(xiàn)了第一個具有調(diào)控功能的非編碼小分子RNA——lin-4，它能夠通過與靶mRNA的互補配對調(diào)控線蟲的發(fā)育進程，開啟了miRNA研究的序幕。然而，在最初發(fā)現(xiàn)的幾年里，lin-4被認為是一種特殊的個例，并未引起科學(xué)界的廣泛關(guān)注。直到2000年，GaryRuvkun團隊又在線蟲中發(fā)現(xiàn)了另一個重要的miRNA——let-7，它在不同物種間高度保守，并且在發(fā)育過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，這才使得miRNA逐漸成為研究熱點。2001年，三個研究小組分別從線蟲、果蠅和人類中鑒定出了90多個與lin-4和let-7類似的小分子RNA，并正式將這類分子命名為microRNA（miRNA），從此miRNA領(lǐng)域迎來了飛速發(fā)展的階段。隨著越來越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)，為了便于統(tǒng)一管理和學(xué)術(shù)交流，科學(xué)家們制定了一套規(guī)范的命名規(guī)則。對于在確定命名規(guī)則之前發(fā)現(xiàn)的miRNA，如hsa-let-7，則保留原來的名字。一般來說，miRNA成熟體簡寫成miR，再根據(jù)其物種名稱的英文縮寫，及被發(fā)現(xiàn)的先后順序加上阿拉伯?dāng)?shù)字，例如人類的hsa-miR-122。對于高度同源的miRNA，在數(shù)字后加上英文小寫字母（a,b,c,…）加以區(qū)分，像hsa-miR-34a、hsa-miR-34b等。由不同染色體上的DNA序列轉(zhuǎn)錄加工而成，但具有相同成熟體序列的miRNA，在后面加上阿拉伯?dāng)?shù)字以示區(qū)別，如hsa-miR-199a-1和hsa-miR-199a-2。通常一個長度大約為70-80nt的miRNA前體，其兩個臂可能分別產(chǎn)生miRNA。若表達水平有明顯差異，表達水平較高的miRNA后面不加任何符號，較低的加上“*”號；若沒有明顯表達差異，則以“-5p”和“-3p”分別命名，分別表示從前體的5’端臂和3’端臂加工而來，如hsa-miR-26b-5p和hsa-miR-26b-3p。在miRBase數(shù)據(jù)庫中，miRNA前體發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄本以“mir”命名，編號以“MI”開頭；miRNA成熟體以“miR”命名，編號以“MIMAT”開頭。1.1.2miRNAs的形成及作用機制miRNA的形成是一個復(fù)雜且精細的過程，主要分為以下幾個關(guān)鍵步驟。首先，在細胞核中，miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉(zhuǎn)錄生成初級miRNA（pri-miRNA），其長度可達幾百到幾千個核苷酸，具有復(fù)雜的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。接著，pri-miRNA在Drosha-DGCR8復(fù)合體的識別和切割作用下，被加工成長度約為60-70個核苷酸的發(fā)夾狀前體miRNA（pre-miRNA）。隨后，pre-miRNA在轉(zhuǎn)運蛋白Exportin-5的協(xié)助下，從細胞核轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)中。在細胞質(zhì)中，pre-miRNA被核酸酶Dicer進一步切割，形成長度約為21-23個核苷酸的雙鏈miRNA。雙鏈miRNA中的一條鏈會被選擇性地整合到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）中，形成成熟的miRISC復(fù)合物，而另一條鏈則通常被降解。miRNA主要通過兩種方式對靶基因進行調(diào)控，從而影響細胞的生物學(xué)功能。當(dāng)miRNA與靶mRNA的序列完全互補配對時，miRISC復(fù)合物會招募核酸酶，直接降解靶mRNA，使靶基因的表達在轉(zhuǎn)錄后水平受到抑制，這種方式在植物中較為常見。在動物細胞中，更普遍的作用方式是miRNA與靶mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）部分互補配對，尤其是miRNA的5’端2-8個被稱為種子序列的核苷酸與靶mRNA的互補配對。這種不完全互補配對雖然不會導(dǎo)致靶mRNA的降解，但會阻礙核糖體與mRNA的結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)的翻譯過程，從而降低靶基因的表達水平。此外，近年來研究還發(fā)現(xiàn)，某些miRNA可以通過與DNA直接相互作用，調(diào)控基因的表觀遺傳學(xué)修飾，如DNA甲基化和組蛋白修飾等，進而影響基因的表達。1.1.3miRNA的檢測與鑒定方法目前，檢測與鑒定miRNA的方法豐富多樣，每種方法都有其獨特的原理、優(yōu)勢及適用場景。Northern印跡法：作為經(jīng)典的核酸檢測技術(shù)，其基本原理是基于核酸分子的雜交特性。首先，通過凝膠電泳將RNA分子依據(jù)大小進行分離，然后利用印跡技術(shù)將RNA轉(zhuǎn)移到固相支持物（如硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，使其固定。接著，用帶有放射性或熒光標(biāo)記的特異性探針與固定在膜上的miRNA進行雜交，通過檢測雜交信號來鑒定miRNA的存在及其表達量。該方法具有較高的特異性，能夠準(zhǔn)確檢測出miRNA的大小和表達水平，但操作過程繁瑣、耗時較長，靈敏度相對較低，且需要使用放射性物質(zhì)，對實驗條件和操作人員的要求較高。實時定量PCR（qRT-PCR）：是當(dāng)前應(yīng)用最為廣泛的miRNA檢測方法之一。由于成熟miRNA長度較短，無法直接進行常規(guī)PCR擴增。因此，在檢測前需要對miRNA進行特殊處理，常見的方法有加尾法和莖環(huán)法。加尾法是在miRNA的3’端加上一段poly（A）尾，然后利用逆轉(zhuǎn)錄酶和特異性引物將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進行PCR擴增和熒光定量檢測。莖環(huán)法是設(shè)計一種莖環(huán)結(jié)構(gòu)的特異性逆轉(zhuǎn)錄引物，與miRNA的3’端互補配對，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，后續(xù)同樣進行PCR擴增和熒光檢測。qRT-PCR具有靈敏度高、特異性強、定量準(zhǔn)確、操作相對簡便等優(yōu)點，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測出miRNA的表達量變化，可用于少量樣本的精確分析，但對實驗技術(shù)和儀器設(shè)備要求較高，且每次只能檢測一種或少數(shù)幾種miRNA。微陣列芯片技術(shù)：該技術(shù)基于核酸探針雜交的原理，將大量已知序列的miRNA探針固定在芯片表面，形成高密度的探針陣列。然后，將提取的樣本RNA進行標(biāo)記，與芯片上的探針進行雜交，通過檢測雜交信號的強度來分析樣本中miRNA的表達譜。微陣列芯片技術(shù)能夠同時對成百上千種miRNA進行高通量檢測，快速獲得樣本中miRNA的整體表達情況，適用于大規(guī)模的基因表達分析和篩選研究，但存在假陽性率較高、檢測靈敏度有限、成本相對較高等問題，且對樣本的起始量要求較大。轉(zhuǎn)錄組深度測序：隨著高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組深度測序已成為miRNA研究的重要手段。其基本流程是先提取樣本中的總RNA，對小RNA進行富集后，給所有的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別連接上3’-RNA和5’-RNA接頭，然后進行逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增，構(gòu)建小RNA文庫，最后利用高通量測序平臺對文庫進行測序。通過生物信息學(xué)分析，將測序數(shù)據(jù)與miRNA數(shù)據(jù)庫以及參考基因組進行比對，從而鑒定出樣本中的miRNA種類和表達豐度，并能夠發(fā)現(xiàn)新的miRNA。轉(zhuǎn)錄組深度測序具有高通量、高靈敏度、能夠檢測未知miRNA等優(yōu)勢，可全面、系統(tǒng)地分析miRNA的表達譜和序列特征，但數(shù)據(jù)分析復(fù)雜、成本較高，需要專業(yè)的生物信息學(xué)知識和分析軟件。原位雜交技術(shù)：原位雜交是一種在組織或細胞水平上檢測核酸的技術(shù)，其原理是以已知序列的核酸作為特異性探針，與細胞或組織切片中的核酸進行雜交，并通過顯色或熒光標(biāo)記來檢測雜交信號，從而確定miRNA在組織或細胞中的定位和表達情況。該技術(shù)能夠直觀地顯示miRNA在組織和細胞中的分布位置，對于研究miRNA在組織發(fā)育、病理過程中的作用機制具有重要意義，但操作較為復(fù)雜，實驗條件要求嚴格，靈敏度相對較低，且信號容易受到組織固定和處理過程的影響。1.1.4miRNAs靶基因的尋找與鑒定尋找和鑒定miRNA的靶基因是深入理解miRNA功能及其調(diào)控機制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由于一個miRNA可以調(diào)控多個靶基因，而一個基因也可能受到多個miRNA的共同調(diào)節(jié)，使得miRNA-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)極其復(fù)雜。目前，主要通過生物信息學(xué)預(yù)測和生物學(xué)實驗驗證兩種策略來尋找和鑒定miRNA的靶基因。生物信息學(xué)預(yù)測：主要依據(jù)miRNA與靶基因之間的互補配對原則、靶位點在不同物種間的保守性、miRNA-mRNA雙鏈的熱穩(wěn)定性等特征，利用特定的算法和軟件對靶基因進行預(yù)測。常用的靶基因預(yù)測軟件有miRanda、TargetScan、PicTar、RNAhybrid等。這些軟件雖然在預(yù)測原理和算法上有所差異，但都遵循一定的基本原則。例如，miRanda軟件通過計算miRNA與靶mRNA之間的互補配對得分、雙鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性以及靶位點的保守性等參數(shù)，來預(yù)測潛在的靶基因；TargetScan則主要基于miRNA種子序列與靶mRNA3’UTR區(qū)域的互補配對，結(jié)合位點的保守性和進化信息進行靶基因預(yù)測。生物信息學(xué)預(yù)測方法能夠快速、高效地篩選出大量潛在的靶基因，為后續(xù)實驗驗證提供線索，但由于其基于算法和模型，存在一定的假陽性和假陰性率，預(yù)測結(jié)果需要進一步的實驗驗證。生物學(xué)實驗驗證：為了確定生物信息學(xué)預(yù)測得到的靶基因是否真實受miRNA調(diào)控，需要進行生物學(xué)實驗驗證。常見的實驗方法有以下幾種：基因芯片法：將miRNA成熟體雙鏈或腺病毒載體轉(zhuǎn)染至細胞中，使miRNA在細胞中過表達，然后利用基因芯片分析mRNA的表達變化，通過對比實驗組和對照組中mRNA表達水平的差異，找出表達量發(fā)生顯著變化的mRNA，從而推測這些mRNA可能是miRNA的靶基因。然而，由于miRNA在體內(nèi)主要通過翻譯抑制或影響mRNA穩(wěn)定性起作用，對于僅發(fā)生翻譯抑制而mRNA水平無明顯變化的靶基因，該方法可能無法有效檢測，存在一定的局限性。免疫共沉淀法：利用AGO蛋白家族既能結(jié)合miRNA又能結(jié)合mRNA的特性，使用AGO-1或AGO-2蛋白的單克隆抗體在細胞中進行免疫共沉淀實驗，將與AGO蛋白結(jié)合的mRNA沉淀下來，通過克隆測序?qū)@些mRNA進行鑒定，從而篩選出可能的miRNA靶基因。這種方法能夠直接從細胞內(nèi)的天然復(fù)合物中分離出與miRNA相互作用的mRNA，具有較高的可信度，但操作過程復(fù)雜，實驗難度較大，且可能存在非特異性結(jié)合的問題。熒光素酶報告基因法：這是目前最為常用的miRNA靶位點鑒定方法。其基本原理是構(gòu)建熒光素酶表達載體，將待鑒定的miRNA靶基因的3’UTR區(qū)域克隆到熒光素酶基因的3’UTR中，然后將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)染至細胞中，并同時轉(zhuǎn)染miRNA模擬物或抑制劑，改變細胞中miRNA的表達水平。最后，檢測熒光素酶的表達活性，如果miRNA能夠與靶基因的3’UTR結(jié)合并抑制其表達，那么熒光素酶的表達量會相應(yīng)降低；反之，如果miRNA與靶基因無相互作用，熒光素酶的表達則不受影響。通過對比不同實驗組中熒光素酶的活性變化，即可判斷轉(zhuǎn)染的3’UTR中是否含有miRNA的靶位點，該方法具有靈敏度高、特異性強、結(jié)果直觀等優(yōu)點，能夠準(zhǔn)確鑒定miRNA與靶基因之間的相互作用關(guān)系。實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）：這兩種方法通常結(jié)合使用，分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測miRNA對靶基因表達的影響。首先，通過轉(zhuǎn)染miRNA模擬物或抑制劑改變細胞中miRNA的表達水平，然后利用實時熒光定量PCR檢測靶基因mRNA的表達量變化，再通過蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測靶蛋白的表達水平。如果在miRNA表達改變后，靶基因的mRNA和蛋白質(zhì)水平都發(fā)生相應(yīng)的變化，則可初步確定該基因是miRNA的靶基因。這種方法能夠直接驗證miRNA對靶基因表達的調(diào)控作用，結(jié)果可靠，但只能對單個或少數(shù)幾個靶基因進行驗證，通量較低。1.2泌乳生物學(xué)研究現(xiàn)狀1.2.1乳腺泌乳過程概述乳腺的發(fā)育和泌乳是一個高度復(fù)雜且受到精細調(diào)控的生理過程，這一過程與哺乳動物的繁衍和后代生存密切相關(guān)。在胚胎發(fā)育早期，乳腺就開始了其最初的發(fā)育歷程。外胚層細胞逐漸分化形成乳腺始基，隨后乳腺始基進一步發(fā)育，形成乳腺芽，并逐漸向深層組織延伸，為后續(xù)乳腺結(jié)構(gòu)的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。在胚胎發(fā)育過程中，一系列基因和信號通路的精確調(diào)控，確保了乳腺組織的正常形成和初步分化。出生后，乳腺在兒童期和青春期前處于相對靜止的狀態(tài)。然而，進入青春期后，隨著下丘腦-垂體-性腺軸的啟動，體內(nèi)激素水平發(fā)生顯著變化，乳腺開始迅速發(fā)育。雌激素的分泌顯著增加，它能夠刺激乳腺導(dǎo)管的伸長和分支，使乳腺導(dǎo)管系統(tǒng)逐漸形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；同時，孕激素也在乳腺發(fā)育中發(fā)揮重要作用，它促使乳腺腺泡的形成和發(fā)育，使得乳腺組織逐漸具備泌乳的基本結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。此外，生長激素、胰島素樣生長因子等多種激素和生長因子也通過協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)乳腺在青春期的發(fā)育進程。妊娠期間，乳腺經(jīng)歷了更為深刻的變化。胎盤分泌的大量雌激素和孕激素，進一步促進乳腺腺泡的增殖和分化，使腺泡細胞體積增大、數(shù)量增多，乳腺小葉也更加發(fā)達，為泌乳做好充分準(zhǔn)備。同時，催乳素在妊娠后期的分泌逐漸增加，它能夠促進乳腺細胞合成和分泌乳汁相關(guān)的蛋白質(zhì)，如酪蛋白、乳清蛋白等，并且對維持乳腺的泌乳功能起著關(guān)鍵作用。此外，胎盤泌乳素、甲狀腺激素等也參與到乳腺的妊娠發(fā)育調(diào)控中，它們通過不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，共同協(xié)調(diào)乳腺在妊娠期間的形態(tài)和功能變化。分娩后，隨著體內(nèi)雌激素和孕激素水平的急劇下降，對催乳素的抑制作用解除，催乳素的分泌顯著增加，乳腺開始進入泌乳階段。在催乳素的持續(xù)刺激下，乳腺腺泡細胞不斷合成和分泌乳汁，乳汁通過乳腺導(dǎo)管系統(tǒng)匯集到乳竇，最終通過乳頭排出，以滿足嬰兒的營養(yǎng)需求。在整個泌乳期，乳腺的泌乳活動受到神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的嚴格調(diào)控，嬰兒的吸吮刺激能夠通過神經(jīng)反射，促進垂體分泌催乳素和縮宮素。催乳素進一步促進乳汁的合成，而縮宮素則引起乳腺導(dǎo)管周圍的肌上皮細胞收縮，推動乳汁排出，形成一個完整的泌乳反射弧。此外，營養(yǎng)狀況、心理狀態(tài)等因素也會對泌乳產(chǎn)生影響，良好的營養(yǎng)供應(yīng)和穩(wěn)定的心理狀態(tài)有助于維持正常的泌乳功能。當(dāng)停止哺乳后，乳腺進入退化階段。乳腺腺泡細胞逐漸凋亡，乳腺導(dǎo)管系統(tǒng)也發(fā)生萎縮，乳腺組織逐漸恢復(fù)到非妊娠狀態(tài)的結(jié)構(gòu)和功能。在這一過程中，多種細胞因子和信號通路參與調(diào)節(jié)乳腺組織的重塑和退化，如轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等，它們能夠促進細胞凋亡和細胞外基質(zhì)的降解，使得乳腺組織能夠有序地進行退化和重塑。1.2.2乳腺泌乳的調(diào)節(jié)機制乳腺泌乳的調(diào)節(jié)是一個極其復(fù)雜的過程，涉及多種激素、信號通路以及細胞因子的相互作用，這些調(diào)節(jié)因素共同維持著乳腺泌乳的正常進行。激素調(diào)節(jié)：在眾多參與乳腺泌乳調(diào)節(jié)的激素中，催乳素（PRL）無疑是最為關(guān)鍵的激素之一。PRL由垂體前葉的催乳素細胞合成和分泌，其分泌受到下丘腦的雙重調(diào)控。下丘腦分泌的催乳素釋放激素（PRH）能夠促進PRL的釋放，而多巴胺則作為催乳素釋放抑制因子（PIF），抑制PRL的分泌。在妊娠后期和哺乳期，PRL的分泌顯著增加，它通過與乳腺細胞表面的催乳素受體（PRLR）結(jié)合，激活細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進乳汁合成相關(guān)基因的表達，從而刺激乳腺腺泡細胞合成和分泌乳汁。例如，PRL與PRLR結(jié)合后，能夠激活Janus激酶2（JAK2），進而磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子5（STAT5），磷酸化的STAT5進入細胞核，與乳汁蛋白基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，促進酪蛋白、乳清蛋白等乳汁蛋白的合成。雌激素和孕激素在乳腺泌乳的調(diào)節(jié)中也發(fā)揮著重要作用。在妊娠期間，雌激素和孕激素水平升高，它們能夠促進乳腺導(dǎo)管和腺泡的發(fā)育，為泌乳做好準(zhǔn)備。然而，過高水平的雌激素和孕激素會抑制PRL對乳腺的泌乳刺激作用，因此在分娩后，隨著胎盤的娩出，雌激素和孕激素水平急劇下降，解除了對PRL的抑制，使得乳腺能夠在PRL的作用下開始泌乳。此外，雌激素還能夠通過調(diào)節(jié)PRLR的表達，影響乳腺對PRL的敏感性，從而間接調(diào)節(jié)泌乳過程。生長激素（GH）和胰島素樣生長因子-1（IGF-1）也參與了乳腺泌乳的調(diào)節(jié)。GH能夠促進乳腺組織的生長和發(fā)育，并且可以通過刺激肝臟合成和分泌IGF-1，間接調(diào)節(jié)乳腺的泌乳功能。IGF-1可以與乳腺細胞表面的IGF-1受體結(jié)合，激活下游的PI3K-Akt和MAPK信號通路，促進細胞增殖、存活和乳汁合成相關(guān)基因的表達。在奶牛養(yǎng)殖中，通過調(diào)節(jié)GH和IGF-1的水平，可以改善奶牛的乳腺發(fā)育和泌乳性能。雌激素和孕激素在乳腺泌乳的調(diào)節(jié)中也發(fā)揮著重要作用。在妊娠期間，雌激素和孕激素水平升高，它們能夠促進乳腺導(dǎo)管和腺泡的發(fā)育，為泌乳做好準(zhǔn)備。然而，過高水平的雌激素和孕激素會抑制PRL對乳腺的泌乳刺激作用，因此在分娩后，隨著胎盤的娩出，雌激素和孕激素水平急劇下降，解除了對PRL的抑制，使得乳腺能夠在PRL的作用下開始泌乳。此外，雌激素還能夠通過調(diào)節(jié)PRLR的表達，影響乳腺對PRL的敏感性，從而間接調(diào)節(jié)泌乳過程。生長激素（GH）和胰島素樣生長因子-1（IGF-1）也參與了乳腺泌乳的調(diào)節(jié)。GH能夠促進乳腺組織的生長和發(fā)育，并且可以通過刺激肝臟合成和分泌IGF-1，間接調(diào)節(jié)乳腺的泌乳功能。IGF-1可以與乳腺細胞表面的IGF-1受體結(jié)合，激活下游的PI3K-Akt和MAPK信號通路，促進細胞增殖、存活和乳汁合成相關(guān)基因的表達。在奶牛養(yǎng)殖中，通過調(diào)節(jié)GH和IGF-1的水平，可以改善奶牛的乳腺發(fā)育和泌乳性能。生長激素（GH）和胰島素樣生長因子-1（IGF-1）也參與了乳腺泌乳的調(diào)節(jié)。GH能夠促進乳腺組織的生長和發(fā)育，并且可以通過刺激肝臟合成和分泌IGF-1，間接調(diào)節(jié)乳腺的泌乳功能。IGF-1可以與乳腺細胞表面的IGF-1受體結(jié)合，激活下游的PI3K-Akt和MAPK信號通路，促進細胞增殖、存活和乳汁合成相關(guān)基因的表達。在奶牛養(yǎng)殖中，通過調(diào)節(jié)GH和IGF-1的水平，可以改善奶牛的乳腺發(fā)育和泌乳性能。信號通路調(diào)節(jié)：在乳腺泌乳過程中，多條信號通路相互交織，共同調(diào)節(jié)乳腺細胞的增殖、分化和乳汁合成。除了上述提到的PRL-JAK2-STAT5信號通路外，PI3K-Akt信號通路也在乳腺泌乳中發(fā)揮重要作用。PI3K被激活后，能夠?qū)⒘字＜〈?4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3可以招募并激活A(yù)kt蛋白。Akt通過磷酸化多種下游底物，如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等，調(diào)節(jié)細胞的代謝、生長和存活。在乳腺細胞中，PI3K-Akt-mTOR信號通路的激活可以促進蛋白質(zhì)合成、細胞增殖和乳汁合成，并且能夠抑制細胞凋亡，維持乳腺組織的泌乳功能。例如，研究發(fā)現(xiàn)，在奶牛乳腺上皮細胞中，通過激活PI3K-Akt-mTOR信號通路，可以顯著增加乳汁蛋白的合成和分泌。MAPK信號通路也是乳腺泌乳調(diào)節(jié)中的重要信號通路之一。該信號通路主要包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）三條途徑。在乳腺泌乳過程中，MAPK信號通路可以被多種細胞外刺激激活，如生長因子、細胞因子等。激活后的MAPK信號通路可以調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡以及基因表達等過程。例如，ERK信號通路的激活可以促進乳腺細胞的增殖和乳汁合成相關(guān)基因的表達，而p38MAPK信號通路的激活則與乳腺細胞的分化和乳汁合成密切相關(guān)。在奶牛乳腺上皮細胞中，抑制p38MAPK信號通路會導(dǎo)致乳汁蛋白合成減少，表明p38MAPK信號通路在奶牛乳腺泌乳中具有重要作用。MAPK信號通路也是乳腺泌乳調(diào)節(jié)中的重要信號通路之一。該信號通路主要包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）三條途徑。在乳腺泌乳過程中，MAPK信號通路可以被多種細胞外刺激激活，如生長因子、細胞因子等。激活后的MAPK信號通路可以調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡以及基因表達等過程。例如，ERK信號通路的激活可以促進乳腺細胞的增殖和乳汁合成相關(guān)基因的表達，而p38MAPK信號通路的激活則與乳腺細胞的分化和乳汁合成密切相關(guān)。在奶牛乳腺上皮細胞中，抑制p38MAPK信號通路會導(dǎo)致乳汁蛋白合成減少，表明p38MAPK信號通路在奶牛乳腺泌乳中具有重要作用。細胞因子調(diào)節(jié)：除了激素和信號通路外，細胞因子在乳腺泌乳的調(diào)節(jié)中也起著不可或缺的作用。白細胞介素-6（IL-6）是一種多功能的細胞因子，它在乳腺泌乳過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。IL-6可以由乳腺上皮細胞、巨噬細胞等多種細胞分泌，它能夠通過與乳腺細胞表面的IL-6受體結(jié)合，激活JAK-STAT3信號通路，促進乳腺細胞的增殖和乳汁合成。研究表明，在奶牛哺乳期，乳腺組織中IL-6的表達水平顯著升高，并且IL-6能夠促進奶牛乳腺上皮細胞中乳汁蛋白的合成和分泌。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是另一種參與乳腺泌乳調(diào)節(jié)的細胞因子。TNF-α可以由巨噬細胞、淋巴細胞等免疫細胞分泌，在乳腺泌乳過程中，TNF-α的作用具有雙重性。適量的TNF-α可以促進乳腺細胞的增殖和分化，并且能夠調(diào)節(jié)乳汁合成相關(guān)基因的表達，對乳腺泌乳具有一定的促進作用。然而，過高水平的TNF-α?xí)?dǎo)致乳腺組織炎癥反應(yīng)加劇，損傷乳腺細胞，抑制乳汁合成，對乳腺泌乳產(chǎn)生負面影響。例如，在奶牛乳腺炎發(fā)生時，乳腺組織中TNF-α的表達水平顯著升高，會導(dǎo)致奶牛泌乳量下降和乳汁質(zhì)量降低。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是另一種參與乳腺泌乳調(diào)節(jié)的細胞因子。TNF-α可以由巨噬細胞、淋巴細胞等免疫細胞分泌，在乳腺泌乳過程中，TNF-α的作用具有雙重性。適量的TNF-α可以促進乳腺細胞的增殖和分化，并且能夠調(diào)節(jié)乳汁合成相關(guān)基因的表達，對乳腺泌乳具有一定的促進作用。然而，過高水平的TNF-α?xí)?dǎo)致乳腺組織炎癥反應(yīng)加劇，損傷乳腺細胞，抑制乳汁合成，對乳腺泌乳產(chǎn)生負面影響。例如，在奶牛乳腺炎發(fā)生時，乳腺組織中TNF-α的表達水平顯著升高，會導(dǎo)致奶牛泌乳量下降和乳汁質(zhì)量降低。1.2.3miRNAs在乳腺發(fā)育及泌乳中的研究近年來，隨著對miRNA研究的不斷深入，越來越多的證據(jù)表明miRNA在乳腺發(fā)育和泌乳過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。miRNA通過對靶基因的精細調(diào)控，參與調(diào)節(jié)乳腺細胞的增殖、分化、凋亡以及乳汁合成和分泌等多個生物學(xué)過程，為深入理解乳腺發(fā)育和泌乳的分子機制提供了新的視角。在乳腺發(fā)育方面，miRNA參與了乳腺發(fā)育的各個階段。在胚胎期乳腺發(fā)育過程中，miR-10b被發(fā)現(xiàn)能夠通過調(diào)控HOXD10基因的表達，影響乳腺始基的形成和發(fā)育。HOXD10是一種同源盒基因，在胚胎發(fā)育過程中具有重要作用。miR-10b與HOXD10mRNA的3’UTR區(qū)域互補配對，抑制其翻譯過程，從而調(diào)節(jié)乳腺始基的正常發(fā)育。在青春期乳腺發(fā)育階段，miR-125b的表達水平發(fā)生顯著變化。研究表明，miR-125b可以通過靶向抑制ERα基因的表達，影響雌激素信號通路，進而調(diào)節(jié)乳腺導(dǎo)管的伸長和分支。ERα是雌激素受體的一種亞型，在乳腺發(fā)育過程中，雌激素通過與ERα結(jié)合，激活下游信號通路，促進乳腺導(dǎo)管的發(fā)育。miR-125b對ERα的調(diào)控作用，使得乳腺導(dǎo)管的發(fā)育能夠在雌激素的刺激下保持平衡和穩(wěn)定。在妊娠期乳腺發(fā)育過程中，miR-200家族成員發(fā)揮了重要作用。miR-200a、miR-200b和miR-200c等通過靶向抑制ZEB1和ZEB2基因的表達，影響乳腺上皮細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，從而促進乳腺腺泡的發(fā)育和分化。ZEB1和ZEB2是轉(zhuǎn)錄因子，能夠抑制上皮細胞標(biāo)志物的表達，促進間質(zhì)細胞標(biāo)志物的表達，在EMT過程中起關(guān)鍵作用。miR-200家族成員對ZEB1和ZEB2的抑制作用，使得乳腺上皮細胞能夠維持正常的上皮特性，有利于乳腺腺泡的正常發(fā)育和功能維持。在乳腺泌乳過程中，miRNA同樣參與了乳汁合成和分泌的調(diào)控。miR-148a被發(fā)現(xiàn)能夠通過靶向抑制DNMT1基因的表達，影響乳汁合成相關(guān)基因的甲基化水平，從而促進乳汁合成。DNMT1是一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，能夠催化DNA的甲基化修飾，影響基因的表達。miR-148a通過抑制DNMT1的表達，降低了乳汁合成相關(guān)基因啟動子區(qū)域的甲基化水平，使得這些基因能夠更易被轉(zhuǎn)錄，從而促進乳汁蛋白的合成。miR-30a能夠通過靶向抑制mTOR基因的表達，調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細胞的自噬和乳汁合成。mTOR是一種重要的信號分子，在細胞生長、代謝和自噬等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。miR-30a對mTOR的抑制作用，能夠調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細胞的自噬水平，維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，進而影響乳汁合成。在乳腺發(fā)育方面，miRNA參與了乳腺發(fā)育的各個階段。在胚胎期乳腺發(fā)育過程中，miR-10b被發(fā)現(xiàn)能夠通過調(diào)控HOXD10基因的表達，影響乳腺始基的形成和發(fā)育。HOXD10是一種同源盒基因，在胚胎發(fā)育過程中具有重要作用。miR-10b與HOXD10mRNA的3’UTR區(qū)域互補配對，抑制其翻譯過程，從而調(diào)節(jié)乳腺始基的正常發(fā)育。在青春期乳腺發(fā)育階段，miR-125b的表達水平發(fā)生顯著變化。研究表明，miR-125b可以通過靶向抑制ERα基因的表達，影響雌激素信號通路，進而調(diào)節(jié)乳腺導(dǎo)管的伸長和分支。ERα是雌激素受體的一種亞型，在乳腺發(fā)育過程中，雌激素通過與ERα結(jié)合，激活下游信號通路，促進乳腺導(dǎo)管的發(fā)育。miR-125b對ERα的調(diào)控作用，使得乳腺導(dǎo)管的發(fā)育能夠在雌激素的刺激下保持平衡和穩(wěn)定。在妊娠期乳腺發(fā)育過程中，miR-200家族成員發(fā)揮了重要作用。miR-200a、miR-200b和miR-200c等通過靶向抑制ZEB1和ZEB2基因的表達，影響乳腺上皮細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，從而促進乳腺腺泡的發(fā)育和分化。ZEB1和ZEB2是轉(zhuǎn)錄因子，能夠抑制上皮細胞標(biāo)志物的表達，促進間質(zhì)細胞標(biāo)志物的表達，在EMT過程中起關(guān)鍵作用。miR-200家族成員對ZEB1和ZEB2的抑制作用，使得乳腺上皮細胞能夠維持正常的上皮特性，有利于乳腺腺泡的正常發(fā)育和功能維持。在乳腺泌乳過程中，miRNA同樣參與了乳汁合成和分泌的調(diào)控。miR-148a被發(fā)現(xiàn)能夠通過靶向抑制DNMT1基因的表達，影響乳汁合成相關(guān)基因的甲基化水平，從而促進乳汁合成。DNMT1是一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，能夠催化DNA的甲基化修飾，影響基因的表達。miR-148a通過抑制DNMT1的表達，降低了乳汁合成相關(guān)基因啟動子區(qū)域的甲基化水平，使得這些基因能夠更易被轉(zhuǎn)錄，從而促進乳汁蛋白的合成。miR-30a能夠通過靶向抑制mTOR基因的表達，調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細胞的自噬和乳汁合成。mTOR是一種重要的信號分子，在細胞生長、代謝和自噬等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。miR-30a對mTOR的抑制作用，能夠調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細胞的自噬水平，維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，進而影響乳汁合成。在妊娠期乳腺發(fā)育過程中，miR-200家族成員發(fā)揮了重要作用。miR-200a、miR-200b和miR-200c等通過靶向抑制ZEB1和ZEB2基因的表達，影響乳腺上皮細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，從而促進乳腺腺泡的發(fā)育和分化。ZEB1和ZEB2是轉(zhuǎn)錄因子，能夠抑制上皮細胞標(biāo)志物的表達，促進間質(zhì)細胞標(biāo)志物的表達，在EMT過程中起關(guān)鍵作用。miR-200家族成員對ZEB1和ZEB2的抑制作用，使得乳腺上皮細胞能夠維持正常的上皮特性，有利于乳腺腺泡的正常發(fā)育和功能維持。在乳腺泌乳過程中，miRNA同樣參與了乳汁合成和分泌的調(diào)控。miR-148a被發(fā)現(xiàn)能夠通過靶向抑制DNMT1基因的表達，影響乳汁合成相關(guān)基因的甲基化水平，從而促進乳汁合成。DNMT1是一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，能夠催化DNA的甲基化修飾，影響基因的表達。miR-148a通過抑制DNMT1的表達，降低了乳汁合成相關(guān)基因啟動子區(qū)域的甲基化水平，使得這些基因能夠更易被轉(zhuǎn)錄，從而促進乳汁蛋白的合成。miR-30a能夠通過靶向抑制mTOR基因的表達，調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細胞的自噬和乳汁合成。mTOR是一種重要的信號分子，在細胞生長、代謝和自噬等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。miR-30a對mTOR的抑制作用，能夠調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細胞的自噬水平，維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，進而影響乳汁合成。在乳腺泌乳過程中，miRNA同樣參與了乳汁合成和分泌的調(diào)控。miR-148a被發(fā)現(xiàn)能夠通過靶向抑制DNMT1基因的表達，影響乳汁合成相關(guān)基因的甲基化水平，從而促進乳汁合成。DNMT1是一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，能夠催化DNA的甲基化修飾，影響基因的表達。miR-148a通過抑制DNMT1的表達，降低了乳汁合成相關(guān)基因啟動子區(qū)域的甲基化水平，使得這些基因能夠更易被轉(zhuǎn)錄，從而促進乳汁蛋白的合成。miR-30a能夠通過靶向抑制mTOR基因的表達，調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細胞的自噬和乳汁合成。mTOR是一種重要的信號分子，在細胞生長、代謝和自噬等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。miR-30a對mTOR的抑制作用，能夠調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細胞的自噬水平，維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，進而影響乳汁合成。1.3miR-29家族研究進展miR-29家族作為miRNA家族中的重要成員，在生物體內(nèi)發(fā)揮著廣泛而關(guān)鍵的作用。該家族主要包括miR-29a、miR-29b和miR-29c三個成員，它們在核苷酸序列上具有高度的同源性，尤其是種子序列區(qū)域高度保守，這使得它們在功能上存在一定的相似性，但由于其靶基因的多樣性以及在不同組織和細胞中的表達差異，也各自展現(xiàn)出獨特的生物學(xué)功能。在細胞增殖與分化方面，miR-29家族發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠胚胎干細胞的分化過程中，miR-29a和miR-29b的表達水平發(fā)生顯著變化。過表達miR-29a和miR-29b能夠抑制胚胎干細胞的增殖，促進其向神經(jīng)細胞方向分化。進一步研究表明，miR-29a和miR-29b是通過靶向抑制多個與細胞增殖相關(guān)的基因，如CCND1、CCND2等，從而影響細胞周期進程，抑制細胞增殖。同時，它們還能夠通過調(diào)控一些神經(jīng)分化相關(guān)基因的表達，如NES、SOX1等，促進胚胎干細胞向神經(jīng)細胞的分化。在成肌細胞的分化過程中，miR-29家族同樣扮演著重要角色。miR-29能夠通過靶向抑制HDAC4基因的表達，促進成肌細胞的分化。HDAC4是一種組蛋白去乙酰化酶，能夠抑制肌肉特異性基因的表達，從而阻礙成肌細胞的分化。miR-29通過抑制HDAC4的表達，解除了對肌肉特異性基因的抑制，促進了成肌細胞向成熟肌纖維的分化。在細胞凋亡的調(diào)控中，miR-29家族也具有重要作用。在多種腫瘤細胞中，miR-29家族成員的表達水平明顯下調(diào)。研究表明，miR-29能夠通過靶向抑制多個抗凋亡基因，如MCL1、BCL2L2等，促進腫瘤細胞的凋亡。MCL1和BCL2L2是Bcl-2家族中的抗凋亡成員，能夠抑制細胞凋亡的發(fā)生。miR-29通過與這些抗凋亡基因的mRNA的3’UTR區(qū)域互補配對，抑制其翻譯過程，降低抗凋亡蛋白的表達水平，從而促進腫瘤細胞的凋亡。在神經(jīng)細胞中，miR-29家族也參與了細胞凋亡的調(diào)控。在缺血性腦損傷模型中，腦缺血會導(dǎo)致神經(jīng)細胞中miR-29的表達水平降低，進而使得其靶基因Bcl-2的表達升高，抑制了神經(jīng)細胞的凋亡。通過上調(diào)miR-29的表達，可以有效促進神經(jīng)細胞的凋亡，減輕腦缺血后的損傷。在纖維化相關(guān)疾病的研究中，miR-29家族受到了廣泛關(guān)注。在肝纖維化、肺纖維化等疾病中，miR-29家族成員的表達水平顯著降低。研究發(fā)現(xiàn)，miR-29能夠通過靶向抑制多個與纖維化相關(guān)的基因，如COL1A1、COL3A1、TGFBR2等，抑制細胞外基質(zhì)的合成，從而減輕組織纖維化程度。COL1A1和COL3A1是膠原蛋白的編碼基因，在纖維化過程中，它們的表達水平會顯著升高，導(dǎo)致膠原蛋白過度沉積，引起組織纖維化。TGFBR2是轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號通路中的關(guān)鍵受體，TGF-β信號通路的激活會促進纖維化相關(guān)基因的表達，進而導(dǎo)致組織纖維化。miR-29通過抑制這些基因的表達，阻斷了TGF-β信號通路的激活，減少了膠原蛋白的合成，從而有效抑制了組織纖維化的發(fā)展。在心血管系統(tǒng)中，miR-29家族也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。在心肌梗死模型中，miR-29的表達水平在梗死心肌組織中明顯降低。研究表明，miR-29能夠通過靶向抑制多個與心肌重構(gòu)相關(guān)的基因，如CTGF、CYR61等，抑制心肌成纖維細胞的增殖和膠原蛋白的合成，從而減輕心肌梗死后的心肌重構(gòu)。CTGF和CYR61是細胞外基質(zhì)蛋白，在心肌梗死后，它們的表達水平會顯著升高，促進心肌成纖維細胞的增殖和膠原蛋白的合成，導(dǎo)致心肌重構(gòu)。miR-29通過抑制這些基因的表達，減少了細胞外基質(zhì)的合成，抑制了心肌成纖維細胞的增殖，從而對心肌梗死后的心肌重構(gòu)起到了保護作用。在心臟發(fā)育過程中，miR-29家族也參與了心肌細胞的增殖和分化調(diào)控。miR-29能夠通過靶向抑制一些與心臟發(fā)育相關(guān)的基因，如HAND2、MEF2C等，調(diào)節(jié)心肌細胞的增殖和分化，確保心臟的正常發(fā)育。在奶牛乳腺相關(guān)研究中，miR-29家族也展現(xiàn)出潛在的調(diào)控作用。雖然目前相關(guān)研究相對較少，但已有研究表明，miR-29家族成員在奶牛乳腺組織中存在差異表達。在奶牛泌乳期，乳腺組織中miR-29的表達水平與非泌乳期相比發(fā)生了明顯變化。推測miR-29家族可能通過調(diào)控奶牛乳腺上皮細胞的增殖、分化以及乳汁合成相關(guān)基因的表達，參與奶牛乳腺的泌乳調(diào)控過程。但具體的作用機制和靶基因仍有待進一步深入研究。1.4DNA甲基化及其在乳腺中的研究1.4.1DNA甲基化的作用機制DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾方式，在生物體內(nèi)發(fā)揮著關(guān)鍵作用。這一修飾過程主要發(fā)生在DNA分子的胞嘧啶（C）上，特別是在CpG島區(qū)域，即富含胞嘧啶（C）和鳥嘌呤（G）且二者通過磷酸二酯鍵相連的DNA序列區(qū)域。在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的催化作用下，甲基基團（-CH3）被添加到胞嘧啶的第5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶（5mC）。這種甲基化修飾并不會改變DNA的堿基序列，但卻能夠?qū)虻谋磉_產(chǎn)生顯著影響。DNA甲基化對基因表達的調(diào)控機制主要通過以下幾種方式實現(xiàn)。首先，DNA甲基化可以直接阻礙轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合。許多轉(zhuǎn)錄因子需要識別并結(jié)合到特定的DNA序列上，才能啟動基因的轉(zhuǎn)錄過程。當(dāng)這些結(jié)合位點發(fā)生甲基化時，甲基基團的空間位阻效應(yīng)會干擾轉(zhuǎn)錄因子與DNA的相互作用，使得轉(zhuǎn)錄因子無法正常結(jié)合，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄起始，導(dǎo)致基因表達沉默。其次，DNA甲基化可以招募一些與基因沉默相關(guān)的蛋白質(zhì)，形成染色質(zhì)重塑復(fù)合物，改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)和狀態(tài)。例如，甲基化CpG結(jié)合蛋白（MBDs）能夠特異性地識別并結(jié)合甲基化的CpG位點，然后招募組蛋白去乙?；福℉DACs）等蛋白質(zhì)。HDACs可以去除組蛋白上的乙酰基，使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得更加緊密，DNA難以與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的蛋白質(zhì)和酶接觸，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄。此外，DNA甲基化還可以通過影響DNA與其他調(diào)控元件的相互作用，如增強子、絕緣子等，間接調(diào)控基因的表達。增強子是一種能夠增強基因轉(zhuǎn)錄活性的順式作用元件，它可以與轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶等相互作用，促進基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)增強子區(qū)域發(fā)生甲基化時，其與轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶的結(jié)合能力會受到影響，從而降低基因的轉(zhuǎn)錄活性。絕緣子則是一種能夠阻止增強子或沉默子對其相鄰基因產(chǎn)生影響的調(diào)控元件，當(dāng)絕緣子區(qū)域發(fā)生甲基化時，其絕緣功能可能會喪失，導(dǎo)致基因表達的異常調(diào)控。在胚胎發(fā)育過程中，DNA甲基化發(fā)揮著不可或缺的作用。在胚胎早期，基因組經(jīng)歷了廣泛的去甲基化和重新甲基化過程，這一過程對于胚胎細胞的全能性維持和分化命運決定至關(guān)重要。在受精后，精子和卵子的基因組會發(fā)生主動去甲基化，使得胚胎細胞具有較高的可塑性和全能性。隨著胚胎發(fā)育的進行，細胞逐漸分化，基因組開始重新甲基化，不同組織和細胞類型形成特定的甲基化模式。這些甲基化模式標(biāo)記了細胞的身份和功能，調(diào)控了細胞特異性基因的表達，確保胚胎各個組織和器官的正常發(fā)育。例如，在神經(jīng)細胞分化過程中，與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的基因啟動子區(qū)域的甲基化水平會發(fā)生動態(tài)變化，一些基因的甲基化水平降低，使其得以表達，從而促進神經(jīng)細胞的分化和功能形成。在腫瘤發(fā)生過程中，DNA甲基化也起著關(guān)鍵作用。腫瘤細胞常常表現(xiàn)出異常的DNA甲基化模式，包括整體基因組的低甲基化和某些抑癌基因啟動子區(qū)域的高甲基化。整體基因組的低甲基化會導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定性增加，一些原本沉默的轉(zhuǎn)座子和重復(fù)序列可能會被激活，引發(fā)染色體的重排和基因突變。而抑癌基因啟動子區(qū)域的高甲基化則會使這些基因表達沉默，失去對細胞增殖和凋亡的調(diào)控作用，從而促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。例如，在乳腺癌中，BRCA1基因啟動子區(qū)域的高甲基化與乳腺癌的發(fā)生風(fēng)險增加密切相關(guān)，BRCA1是一種重要的抑癌基因，其表達沉默會導(dǎo)致細胞對DNA損傷的修復(fù)能力下降，增加細胞癌變的可能性。1.4.2甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A及DNMT3B的研究進展DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A（DNMT3A）和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B（DNMT3B）是在DNA甲基化過程中起關(guān)鍵作用的兩種酶，它們在結(jié)構(gòu)、功能以及相關(guān)研究方面都備受關(guān)注。DNMT3A和DNMT3B在結(jié)構(gòu)上具有一定的相似性，它們都屬于從頭合成型DNA甲基轉(zhuǎn)移酶。這兩種酶都包含一個高度保守的催化結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域負責(zé)識別DNA底物并催化甲基基團從S-腺苷甲硫氨酸（SAM）轉(zhuǎn)移到DNA的胞嘧啶上。除了催化結(jié)構(gòu)域，它們還含有一些其他的功能結(jié)構(gòu)域，如PWWP結(jié)構(gòu)域、ADD結(jié)構(gòu)域等。PWWP結(jié)構(gòu)域能夠與DNA和組蛋白相互作用，參與染色質(zhì)的識別和結(jié)合，有助于DNMT3A和DNMT3B定位到特定的基因組區(qū)域。ADD結(jié)構(gòu)域則可以結(jié)合未甲基化的組蛋白H3尾部，通過與組蛋白修飾狀態(tài)的相互作用，進一步調(diào)控DNA甲基化的位點特異性。在功能方面，DNMT3A和DNMT3B主要負責(zé)在胚胎發(fā)育和細胞分化過程中建立新的DNA甲基化模式。在胚胎發(fā)育早期，基因組處于相對低甲基化狀態(tài)，隨著胚胎的發(fā)育，DNMT3A和DNMT3B逐漸將甲基基團添加到特定的DNA區(qū)域，形成組織和細胞特異性的甲基化圖譜。它們對于維持細胞的正常分化和發(fā)育至關(guān)重要。研究表明，在小鼠胚胎干細胞中，敲除DNMT3A和DNMT3B會導(dǎo)致基因組甲基化水平顯著降低，胚胎干細胞無法正常分化，出現(xiàn)發(fā)育異常甚至死亡。在造血干細胞分化過程中，DNMT3A和DNMT3B通過調(diào)控與造血分化相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)，影響基因的表達，從而指導(dǎo)造血干細胞向不同類型的血細胞分化。近年來，關(guān)于DNMT3A和DNMT3B的研究取得了許多重要成果。在腫瘤研究領(lǐng)域，DNMT3A和DNMT3B的異常表達與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在急性髓系白血?。ˋML）中，DNMT3A基因的突變頻繁發(fā)生。這些突變會導(dǎo)致DNMT3A的功能異常，進而影響DNA甲基化模式，使得一些與白血病發(fā)生相關(guān)的基因表達失調(diào)，促進白血病細胞的增殖和存活。研究還發(fā)現(xiàn)，DNMT3B在乳腺癌、肺癌等多種實體腫瘤中表達上調(diào)，其高表達與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移能力以及患者的不良預(yù)后相關(guān)。通過抑制DNMT3B的活性，可以降低腫瘤細胞的增殖能力，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，為腫瘤治療提供了新的潛在靶點。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究中，DNMT3A和DNMT3B也被發(fā)現(xiàn)參與了神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生過程。在神經(jīng)發(fā)育過程中，它們對神經(jīng)干細胞的增殖、分化和遷移具有重要調(diào)控作用。在阿爾茨海默病模型中，DNMT3A和DNMT3B的表達和活性發(fā)生改變，導(dǎo)致與神經(jīng)功能相關(guān)的基因甲基化異常，影響了神經(jīng)遞質(zhì)的合成、傳遞以及神經(jīng)元的存活和功能。1.4.3DNA甲基化在乳腺中的研究DNA甲基化在乳腺的發(fā)育、泌乳以及疾病發(fā)生過程中都扮演著至關(guān)重要的角色，對其深入研究有助于揭示乳腺生理和病理過程的分子機制。在乳腺發(fā)育方面，DNA甲基化參與了乳腺從胚胎期到成熟期的各個階段調(diào)控。在胚胎期乳腺發(fā)育過程中，DNA甲基化模式的動態(tài)變化對乳腺始基的形成和分化具有重要影響。研究發(fā)現(xiàn)，一些與乳腺發(fā)育相關(guān)的基因，如Wnt信號通路相關(guān)基因，其啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)在胚胎期會發(fā)生改變。在乳腺始基形成階段，Wnt信號通路的激活對于乳腺上皮細胞的增殖和分化至關(guān)重要，而該通路相關(guān)基因啟動子區(qū)域的低甲基化有助于基因的表達，促進乳腺始基的正常發(fā)育。如果這些基因發(fā)生異常甲基化，導(dǎo)致Wnt信號通路受阻，可能會影響乳腺的正常發(fā)育，出現(xiàn)乳腺發(fā)育不全等問題。在青春期乳腺發(fā)育過程中，DNA甲基化同樣發(fā)揮著重要作用。隨著青春期體內(nèi)激素水平的變化，乳腺組織中的DNA甲基化模式也會發(fā)生相應(yīng)改變，以調(diào)控乳腺導(dǎo)管的伸長和分支。雌激素在青春期乳腺發(fā)育中起著關(guān)鍵作用，它可以通過調(diào)節(jié)DNA甲基化相關(guān)酶的活性，影響與乳腺導(dǎo)管發(fā)育相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)。例如，雌激素可以促進DNMT1的表達，使得一些抑制乳腺導(dǎo)管發(fā)育的基因啟動子區(qū)域發(fā)生高甲基化，從而抑制這些基因的表達，有利于乳腺導(dǎo)管的正常生長和分支。在妊娠期乳腺發(fā)育過程中，DNA甲基化進一步調(diào)控乳腺腺泡的增殖和分化，為泌乳做好準(zhǔn)備。胎盤分泌的雌激素和孕激素等激素會影響乳腺組織的DNA甲基化模式，促進與乳腺腺泡發(fā)育相關(guān)基因的表達。研究表明，一些編碼乳腺腺泡特異性蛋白的基因，在妊娠期其啟動子區(qū)域的甲基化水平會降低，使得這些基因能夠大量表達，促進乳腺腺泡的發(fā)育和成熟。在乳腺泌乳過程中，DNA甲基化對乳汁合成相關(guān)基因的表達調(diào)控起著重要作用。乳汁的合成和分泌涉及多種基因的協(xié)同表達，而DNA甲基化可以通過調(diào)節(jié)這些基因的甲基化狀態(tài)，影響其表達水平。研究發(fā)現(xiàn)，酪蛋白是乳汁中的主要蛋白質(zhì)成分之一，其編碼基因的啟動子區(qū)域甲基化水平在泌乳期會發(fā)生顯著變化。在泌乳啟動階段，酪蛋白基因啟動子區(qū)域的甲基化水平降低，使得該基因能夠高效表達，促進酪蛋白的合成。而在泌乳后期，隨著乳汁分泌的減少，酪蛋白基因啟動子區(qū)域的甲基化水平逐漸升高，基因表達受到抑制。這種甲基化水平的動態(tài)變化與乳腺的泌乳生理過程密切相關(guān)，確保了乳汁合成的適時調(diào)控。此外，DNA甲基化還可以通過影響其他與乳汁合成相關(guān)的信號通路和轉(zhuǎn)錄因子的活性，間接調(diào)控乳汁合成。例如，mTOR信號通路在乳汁合成中具有重要作用，DNA甲基化可以通過調(diào)控mTOR信號通路相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)，影響該信號通路的活性，進而調(diào)節(jié)乳汁合成。在乳腺疾病方面，DNA甲基化與乳腺癌等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，研究表明，DNA甲基化異常在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后等方面都發(fā)揮著重要作用。在乳腺癌發(fā)生過程中，許多抑癌基因的啟動子區(qū)域會發(fā)生高甲基化，導(dǎo)致這些基因表達沉默，失去對腫瘤細胞的抑制作用。例如，p16基因是一種重要的抑癌基因，其啟動子區(qū)域的高甲基化在乳腺癌中較為常見。p16基因的高甲基化會使其無法正常表達，導(dǎo)致細胞周期調(diào)控失衡，腫瘤細胞得以異常增殖。此外，DNA甲基化還與乳腺癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。一些與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，如E-cadherin基因，其啟動子區(qū)域的甲基化水平升高會導(dǎo)致E-cadherin蛋白表達降低，使得腫瘤細胞之間的黏附力下降，容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。在乳腺癌的預(yù)后評估方面，DNA甲基化也具有重要價值。研究發(fā)現(xiàn)，某些基因的甲基化狀態(tài)可以作為乳腺癌預(yù)后的生物標(biāo)志物，幫助醫(yī)生預(yù)測患者的預(yù)后情況，制定個性化的治療方案。例如，通過檢測乳腺癌組織中一些特定基因的甲基化水平，可以判斷患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險和生存時間，為臨床治療提供重要參考。1.5研究目的和意義奶牛養(yǎng)殖作為乳業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其生產(chǎn)性能直接影響著乳業(yè)的經(jīng)濟效益和市場供應(yīng)。在奶牛養(yǎng)殖中，提高奶牛的泌乳性能一直是研究的重點和熱點。奶牛的泌乳過程是一個復(fù)雜而精細的生理過程，受到多種因素的調(diào)控，包括激素、信號通路、轉(zhuǎn)錄因子以及非編碼RNA等。深入了解這些調(diào)控因素及其作用機制，對于提高奶牛的泌乳性能、優(yōu)化奶牛養(yǎng)殖管理以及促進乳業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。本研究聚焦于miR-29家族對奶牛乳腺上皮細胞泌乳調(diào)控機制，旨在揭示miR-29家族在奶牛乳腺泌乳過程中的具體作用和分子機制。通過研究miR-29家族在奶牛乳腺上皮細胞中的表達模式，以及其對乳腺上皮細胞增殖、凋亡和乳汁合成相關(guān)基因表達的影響，尋找受miR-29家族調(diào)控的關(guān)鍵靶基因和信號通路，從分子層面深入解析miR-29家族參與奶牛乳腺泌乳調(diào)控的內(nèi)在機制。從理論層面來看，本研究將豐富和完善奶牛乳腺泌乳調(diào)控的分子理論體系，為深入理解乳腺發(fā)育和泌乳的分子機制提供新的視角和理論依據(jù)。通過揭示miR-29家族在奶牛乳腺泌乳過程中的作用機制，有助于進一步明確miRNA在乳腺生物學(xué)中的功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為后續(xù)相關(guān)研究奠定堅實的理論基礎(chǔ)。在實際應(yīng)用方面，本研究成果對于提高奶牛的泌乳性能具有重要的指導(dǎo)意義。通過調(diào)控miR-29家族及其靶基因的表達，可以為奶牛養(yǎng)殖提供新的技術(shù)手段和策略，從而提高奶牛的產(chǎn)奶量和乳汁品質(zhì)，增加奶牛養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益。研究結(jié)果還可以為奶牛的遺傳育種提供新的分子標(biāo)記和選育靶點，有助于培育出泌乳性能優(yōu)良的奶牛品種，推動乳業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。此外，本研究對于人類乳腺相關(guān)疾病的研究也具有一定的借鑒意義。奶牛乳腺的發(fā)育和泌乳過程與人類乳腺具有一定的相似性，通過研究奶牛乳腺泌乳調(diào)控機制，可以為人類乳腺疾病的發(fā)病機制研究和治療提供新的思路和方法。例如，在乳腺癌等乳腺疾病中，miRNA的表達和功能異常與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，本研究中關(guān)于miR-29家族的研究結(jié)果可能為人類乳腺癌等疾病的研究提供有益的參考。二、材料與方法2.1實驗材料本研究使用的奶牛乳腺組織采集自當(dāng)?shù)卮笮湍膛ｐB(yǎng)殖場。挑選處于泌乳中期、健康狀況良好、產(chǎn)奶性能穩(wěn)定且品種一致的荷斯坦奶牛。在無菌條件下，于奶牛擠奶后2-3小時內(nèi)，從奶牛乳腺的不同象限采集乳腺組織樣本，每個樣本重量約為2-3克。采集后的組織樣本立即放入含有預(yù)冷的PBS緩沖液（含1%雙抗，即青霉素和鏈霉素）的無菌離心管中，迅速帶回實驗室進行后續(xù)處理。為確保實驗結(jié)果的可靠性和重復(fù)性，共采集了10頭不同奶牛的乳腺組織樣本。本實驗選用的奶牛乳腺上皮細胞系DCMECs，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。該細胞系經(jīng)過嚴格的鑒定和質(zhì)量控制，具有穩(wěn)定的生物學(xué)特性和泌乳功能。細胞復(fù)蘇后，用含有10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗（青霉素100U/mL，鏈霉素100μg/mL）的高糖DMEM培養(yǎng)基（Dulbecco'sModifiedEagleMedium），置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。當(dāng)細胞生長至對數(shù)期時，進行傳代培養(yǎng)，傳代比例為1:3-1:4，以維持細胞的良好生長狀態(tài)。2.2實驗主要試劑本實驗所使用的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，具體引物序列及相關(guān)信息如下表1所示：表1實驗所用引物信息表1實驗所用引物信息引物名稱引物序列（5'-3'）用途miR-29a-FCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACCTGGCmiR-29a定量PCR檢測miR-29a-RTGGTGTCGTGGAGTCmiR-29b-FCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACCCAGAmiR-29b定量PCR檢測miR-29b-RTGGTGTCGTGGAGTCmiR-29c-FCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACCTGGGmiR-29c定量PCR檢測miR-29c-RTGGTGTCGTGGAGTCDNMT3A-FCCACAGCCTGAAGACGAAGADNMT3A定量PCR檢測DNMT3A-RGTCCTCCACCTTCCACAGTCDNMT3B-FTGGAAGAGCAAGACCAGCAADNMT3B定量PCR檢測DNMT3B-RCAGCGGAGTCAGAAAGGTCAβ-actin-FTGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA內(nèi)參基因定量PCR檢測β-actin-RCTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG本實驗所使用的抗體相關(guān)信息如下表2所示：表2實驗所用抗體信息表2實驗所用抗體信息抗體名稱宿主克隆性規(guī)格生產(chǎn)廠家用途抗DNMT3A抗體兔多克隆100μLAbcam公司免疫熒光、Westernblot檢測抗DNMT3B抗體小鼠單克隆50μLCST公司免疫熒光、Westernblot檢測抗β-actin抗體山羊多克隆200μLSantaCruz公司W(wǎng)esternblot內(nèi)參對照HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體羊多克隆1mLJacksonImmunoResearch公司W(wǎng)esternblot檢測FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體羊多克隆50μLSigma公司免疫熒光檢測本實驗所使用的轉(zhuǎn)染試劑為Lipofectamine3000TransfectionReagent，購自Invitrogen公司，規(guī)格為1mL，用于將miR-29家族模擬物、抑制劑以及相關(guān)表達載體轉(zhuǎn)染至奶牛乳腺上皮細胞中。細胞培養(yǎng)相關(guān)試劑中，高糖DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司，規(guī)格為500mL；胎牛血清（FBS）購自BiologicalIndustries公司，規(guī)格為500mL；青霉素-鏈霉素雙抗溶液購自Solarbio公司，規(guī)格為100mL，濃度為青霉素100U/mL，鏈霉素100μg/mL。核酸提取與檢測試劑方面，TRIzol試劑購自Invitrogen公司，規(guī)格為50mL，用于提取奶牛乳腺組織和細胞中的總RNA；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser購自TaKaRa公司，規(guī)格為50次反應(yīng)，用于將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；實時熒光定量PCR試劑盒SYBRPremixExTaqⅡ購自TaKaRa公司，規(guī)格為50次反應(yīng)，用于進行實時熒光定量PCR檢測基因表達水平。其他試劑還包括：Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen，1mL）用于細胞轉(zhuǎn)染；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（Promega，E1910），規(guī)格為50次反應(yīng)，用于檢測熒光素酶活性；甲基化DNA免疫沉淀試劑盒（MethylampMethylatedDNAImmunoprecipitationKit，Epigentek，P-2005），規(guī)格為50次反應(yīng)，用于DNA甲基化水平檢測；5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-Aza-dc，Sigma，A3656），規(guī)格為100mg，用于DNA甲基化抑制劑處理細胞實驗；CCK-8細胞增殖及毒性檢測試劑盒（Dojindo，CK04），規(guī)格為100次反應(yīng)，用于檢測細胞活性和增殖能力；甘油三酯檢測試劑盒（Applygen，TC0110），規(guī)格為50T，用于檢測細胞內(nèi)甘油三酯含量；乳糖檢測試劑盒（Megazyme，K-LACTOSE），規(guī)格為100次反應(yīng)，用于檢測細胞內(nèi)乳糖含量；ELISA試劑盒（Cloud-CloneCorp），規(guī)格為96T，包括檢測IL-6、TNF-α等細胞因子的試劑盒，用于檢測細胞培養(yǎng)上清中相關(guān)細胞因子的含量。2.3實驗儀器本實驗使用的主要儀器如下表3所示：表3實驗主要儀器信息表3實驗主要儀器信息儀器名稱型號生產(chǎn)廠家用途實時熒光定量PCR儀CFX96TouchBio-Rad公司用于檢測基因表達水平，通過對PCR擴增過程中熒光信號的實時監(jiān)測，實現(xiàn)對miR-29家族成員、DNMT3A、DNMT3B以及其他相關(guān)基因表達量的精確測定。普通PCR儀T100Bio-Rad公司用于基因的擴增，通過設(shè)置不同的溫度循環(huán)條件，實現(xiàn)對目的基因的大量擴增，為后續(xù)實驗提供足夠的DNA模板。高速冷凍離心機5424REppendorf公司用于細胞、組織勻漿等樣品的離心分離，在低溫條件下，能夠快速、高效地將不同密度的物質(zhì)分離開來，例如分離細胞碎片、細胞器以及核酸等。低溫離心機Centrifuge5810REppendorf公司可用于較低轉(zhuǎn)速下的離心操作，適用于對溫度敏感的樣品，如蛋白質(zhì)樣品的分離和濃縮等。恒溫振蕩培養(yǎng)箱HZQ-F160哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司用于細胞培養(yǎng)過程中的振蕩培養(yǎng)，能夠提供恒定的溫度和振蕩頻率，促進細胞與培養(yǎng)液的充分接觸，保證細胞生長環(huán)境的均一性。CO?細胞培養(yǎng)箱3111ThermoFisherScientific公司為細胞培養(yǎng)提供適宜的環(huán)境條件，精確控制溫度（37℃）、CO?濃度（5%）和濕度，模擬細胞在體內(nèi)的生長環(huán)境，維持細胞的正常生長和代謝。倒置顯微鏡IX73Olympus公司用于觀察細胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和增殖情況，能夠在不破壞細胞結(jié)構(gòu)的前提下，實時觀察細胞在培養(yǎng)過程中的變化。酶標(biāo)儀InfiniteM200ProTecan公司用于檢測細胞培養(yǎng)上清中相關(guān)細胞因子的含量，如IL-6、TNF-α等，通過酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中細胞因子的濃度。多功能成像儀ChemiDocMPBio-Rad公司用于蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）結(jié)果的檢測和分析，能夠?qū)τ≯E膜上的蛋白條帶進行成像和定量分析，確定蛋白質(zhì)的表達水平。熒光顯微鏡BX53Olympus公司用于免疫熒光實驗中，觀察細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的定位和表達情況，通過熒光標(biāo)記的抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)出特定的熒光信號，從而確定目標(biāo)蛋白的分布位置。超凈工作臺SW-CJ-2FD蘇州凈化設(shè)備有限公司為細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染等實驗操作提供無菌環(huán)境，通過過濾空氣中的塵埃和微生物，減少實驗過程中的污染風(fēng)險，保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。電子天平ME204E梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司用于精確稱量實驗試劑，如引物、抗體、細胞培養(yǎng)試劑等，確保實驗中各種試劑的用量準(zhǔn)確無誤。2.4實驗方法2.4.1miR-29家族在不同乳品質(zhì)奶牛乳腺組織中的表達檢測分別采集乳蛋白含量高（≥3.5%）和乳蛋白含量低（≤3.0%）的健康奶牛乳腺組織樣本各10例，樣本采集時奶牛均處于泌乳中期且無乳腺疾病。采用TRIzol試劑按照說明書操作提取乳腺組織總RNA，利用超微量分光光度計測定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，觀察28S和18SrRNA條帶是否清晰、明亮且比例約為2:1。取總RNA1μg，使用莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser將miR-29家族成員（miR-29a、miR-29b、miR-29c）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以U6作為內(nèi)參基因，U6的逆轉(zhuǎn)錄引物為：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20μL，包括5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物（10μM）1μL，總RNA1μg，RNaseFreedH?O補足至20μL。反應(yīng)條件為：37℃15min，85℃5s，4℃保存。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系為20μL，包含SYBRPremixExTaqⅡ10μL，上下游引物（10μM）各0.8μL，cDNA模板2μL，ddH?O6.4μL。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。每個樣本設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)，采用2?ΔΔCt法計算miR-29家族成員在不同乳品質(zhì)奶牛乳腺組織中的相對表達量。同時，隨機選取部分樣本進行小RNA測序，進一步驗證miR-29家族成員在不同乳品質(zhì)奶牛乳腺組織中的表達差異，測序文庫構(gòu)建和測序工作由專業(yè)測序公司完成，測序數(shù)據(jù)通過生物信息學(xué)分析，比對到參考基因組，統(tǒng)計miR-29家族成員的表達量，并進行差異分析。2.4.2miR-29s靶基因的預(yù)測與分析運用生物信息學(xué)軟件miRanda、TargetScan和PicTar對miR-29家族成員的靶基因進行預(yù)測。在預(yù)測過程中，設(shè)定miRanda軟件的參數(shù)為：得分閾值≥140，能量閾值≤-20kcal/mol；TargetScan軟件基于保守性和種子序列匹配原則進行預(yù)測；PicTar軟件通過整合多個物種的保守性信息和mRNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測靶基因。將三個軟件預(yù)測結(jié)果取交集，篩選出共同預(yù)測到的靶基因，以提高預(yù)測的準(zhǔn)確性。對篩選出的靶基因進行功能富集分析，使用DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery）在線工具對靶基因進行GO（GeneOntology）功能富集分析和KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）信號通路富集分析。GO功能富集分析從生物過程（BiologicalProcess）、細胞組分（CellularComponent）和分子功能（MolecularFunction）三個方面對靶基因的功能進行注釋和富集分析；KEGG信號通路富集分析確定靶基因參與的主要信號通路，通過超幾何分布檢驗計算富集的顯著性，篩選出P＜0.05的富集結(jié)果，從而找出與乳腺泌乳相關(guān)的關(guān)鍵靶基因和信號通路。2.4.3DNMT3A和-3B在不同乳品質(zhì)奶牛乳腺組織中的表達與定位分別采集乳蛋白含量高（≥3.5%）和乳蛋白含量低（≤3.0%）的健康奶牛乳腺組織樣本各10例，樣本采集時奶牛均處于泌乳中期且無乳腺疾病。采用TRIzol試劑提取乳腺組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以β-actin為內(nèi)參基因，通過實時熒光定量PCR檢測DNMT3A和DNMT3B基因的mRNA表達水平。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同2.4.1，DNMT3A和DNMT3B的引物序列見2.2。每個樣本設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)，采用2?ΔΔCt法計算基因的相對表達量。將乳腺組織樣本用4%多聚甲醛固定24h，然后進行脫水、透明、浸蠟、包埋等常規(guī)石蠟切片處理，制成厚度為4μm的石蠟切片。切片脫蠟至水后，進行抗原修復(fù)，用3%過氧化氫溶液室溫孵育10min以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。隨后，滴加正常山羊血清封閉液室溫封閉30min，以減少非特異性染色。分別滴加抗DNMT3A抗體（1:200稀釋）和抗DNMT3B抗體（1:100稀釋），4℃孵育過夜。次日，PBS沖洗3次，每次5min，滴加HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（1:500稀釋）或HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體（1:500稀釋），室溫孵育1h。PBS沖洗后，使用DAB顯色試劑盒進行顯色，蘇木精復(fù)染細胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍，脫水、透明后用中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察DNMT3A和DNMT3B蛋白在乳腺組織中的表達和定位情況，陽性產(chǎn)物呈棕黃色，分析不同乳品質(zhì)奶牛乳腺組織中DNMT3A和DNMT3B蛋白表達的差異。2.4.4奶牛乳腺上皮細胞的培養(yǎng)與鑒定從液氮中取出凍存的奶牛乳腺上皮細胞系DCMECs，迅速放入37℃水浴鍋中快速解凍，將解凍后的細胞懸液轉(zhuǎn)移至含有10mL完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基）的離心管中，1000r/min離心5min，棄上清，加入適量完全培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細胞生長至80%-90%融合時，進行傳代培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化細胞，待細胞變圓、脫落時，加入完全培養(yǎng)基終止消化，吹打均勻后按1:3-1:4的比例傳代。取對數(shù)生長期的細胞，用PBS清洗2次，加入4%多聚甲醛固定30min，PBS清洗3次，每次5min。用0.2%TritonX-100室溫通透10min，PBS清洗后，滴加正常山羊血清封閉液室溫封閉30min。滴加抗細胞角蛋白18抗體（1:100稀釋），4℃孵育過夜。次日，PBS沖洗3次，每次5min，滴加FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（1:200稀釋），室溫避光孵育1h。PBS沖洗后，用DAPI染液染細胞核，室溫避光孵育5min。PBS沖洗后，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察，細胞角蛋白18陽性細胞呈現(xiàn)綠色熒光，DAPI染核呈現(xiàn)藍色熒光，以此鑒定細胞是否為乳腺上皮細胞。同時，檢測細胞中β-酪蛋白的表達，提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，通過實時熒光定量PCR檢測β-酪蛋白基因的mRNA表達水平，引物序列為：β-酪蛋白-F：5'-GGAGAAGCCAGACATCCAGA-3'，β-酪蛋白-R：5'-CCACAGTGGACACCTTCTCC-3'，以驗證細胞的泌乳功能。2.4.5免疫熒光檢測DNMT3A、-3B在奶牛乳腺上皮細胞中的定位表達將奶牛乳腺上皮細胞接種于放置有蓋玻片的24孔板中，待細胞生長至50%-60%融合時，進行免疫熒光實驗。用PBS清洗細胞2次，加入4%多聚甲醛固定30min，PBS清洗3次，每次5min。用0.2%TritonX-100室溫通透