mTOR在白血病中的表達(dá)特征、作用機(jī)制及臨床意義探究一、引言1.1研究背景與意義白血病，作為一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，其特征為骨髓和淋巴組織中的白血細(xì)胞數(shù)量異常增多，造血干細(xì)胞失控分裂，血液中白血病細(xì)胞數(shù)量增加，進(jìn)而導(dǎo)致貧血、出血、感染等一系列嚴(yán)重癥狀。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年新增白血病患者數(shù)量眾多，且發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，尤其在兒童和青少年群體中，白血病已成為導(dǎo)致死亡的主要疾病之一，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生命安全，給家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。目前，白血病的治療主要依賴(lài)于化療、放療和造血干細(xì)胞移植等方法。化療通過(guò)使用化學(xué)藥物殺死白血病細(xì)胞，但同時(shí)也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的副作用，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、免疫力下降等。放療則利用高能射線照射腫瘤部位，以破壞白血病細(xì)胞，但同樣會(huì)對(duì)周?chē)＝M織產(chǎn)生不良影響。造血干細(xì)胞移植雖然是一種有效的治療方法，但存在配型困難、移植后排斥反應(yīng)等問(wèn)題，且費(fèi)用高昂，限制了其廣泛應(yīng)用。此外，部分白血病患者對(duì)現(xiàn)有治療方法產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療失敗，因此，尋找新的治療靶點(diǎn)和方法，提高白血病的治療效果，成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的重要問(wèn)題。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶標(biāo)蛋白（mammaliantargetofrapamycin，mTOR）是一種進(jìn)化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷脂酰肌醇激酶相關(guān)激酶家族。mTOR在細(xì)胞內(nèi)的主要作用是調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝，它能夠整合多種上游信號(hào)，包括生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、能量狀態(tài)和應(yīng)激信號(hào)等，通過(guò)調(diào)節(jié)下游一系列效應(yīng)分子的活性，參與調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程、蛋白質(zhì)合成和降解、細(xì)胞能量代謝、自噬等多種生物學(xué)過(guò)程，在細(xì)胞的生存、生長(zhǎng)、增殖過(guò)程中起著中心調(diào)控點(diǎn)的作用。在許多惡性腫瘤中，包括白血病，mTOR的表達(dá)水平都與增殖、細(xì)胞成熟和凋亡等過(guò)程密切相關(guān)。研究表明，mTOR信號(hào)通路在白血病細(xì)胞的增殖、存活、凋亡、藥物耐受性等方面都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。mTOR信號(hào)通路的激活可促使白血病細(xì)胞的代謝轉(zhuǎn)變，從而提供所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和ATP，加速白血病細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)白血病的發(fā)生和發(fā)展。mTOR還參與白血病細(xì)胞的抗凋亡作用，通過(guò)調(diào)節(jié)一系列抗凋亡蛋白和凋亡蛋白的表達(dá)，使白血病細(xì)胞易于逃脫凋亡的控制。mTOR信號(hào)通路的激活也與白血病的耐藥性相關(guān)，它能夠通過(guò)增強(qiáng)DNA修復(fù)和減少凋亡等途徑來(lái)幫助細(xì)胞避免藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。因此，研究mTOR在白血病及白血病細(xì)胞株中的表達(dá)情況及其對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡等過(guò)程的調(diào)節(jié)作用，對(duì)于深入了解白血病的病理機(jī)制，開(kāi)發(fā)新的治療方法具有重要意義。本研究旨在探討mTOR在白血病中的表達(dá)及其作用，為白血病的治療提供新思路和潛在的治療靶點(diǎn)，有望改善白血病患者的治療效果和預(yù)后，提高患者的生活質(zhì)量，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)意義。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在白血病研究領(lǐng)域，mTOR已成為備受關(guān)注的研究熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者圍繞mTOR在白血病中的表達(dá)及作用展開(kāi)了廣泛而深入的研究，取得了一系列重要成果。國(guó)外方面，早期研究就已發(fā)現(xiàn)mTOR信號(hào)通路在白血病發(fā)生發(fā)展中扮演關(guān)鍵角色。有研究表明，在急性髓系白血病（AML）患者中，mTOR的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著升高，且其激活狀態(tài)與白血病細(xì)胞的增殖、存活密切相關(guān)。通過(guò)對(duì)白血病細(xì)胞株的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑制mTOR活性能夠有效抑制白血病細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，進(jìn)一步證實(shí)了mTOR在白血病細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控中的重要作用。在對(duì)慢性淋巴細(xì)胞白血病（CLL）的研究中，雖然mTOR的表達(dá)相對(duì)較低，但mTOR信號(hào)通路的異常激活同樣與CLL的疾病進(jìn)展和不良預(yù)后相關(guān)。在白血病治療方面，國(guó)外學(xué)者對(duì)mTOR抑制劑的應(yīng)用進(jìn)行了大量探索。雷帕霉素作為經(jīng)典的mTOR抑制劑，在多項(xiàng)臨床前研究中顯示出對(duì)白血病細(xì)胞的抑制作用。一些臨床試驗(yàn)也初步驗(yàn)證了雷帕霉素及其衍生物在白血病治療中的潛力，部分患者在接受mTOR抑制劑治療后，病情得到了一定程度的緩解。但同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)mTOR抑制劑存在一些局限性，如耐藥性的產(chǎn)生以及對(duì)正常細(xì)胞的副作用等問(wèn)題，限制了其臨床廣泛應(yīng)用。國(guó)內(nèi)學(xué)者在mTOR與白血病關(guān)系的研究中也取得了顯著進(jìn)展。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院、上海血液學(xué)研究所的研究團(tuán)隊(duì)證實(shí)，在小鼠造血系統(tǒng)中條件性敲入DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A（Dnmt3a）R878H突變基因，可誘發(fā)急性髓系白血?。ˋML），且mTOR通路異常活化在這一過(guò)程中發(fā)揮重要作用，使用mTOR的特異性抑制劑“雷帕霉素”，可顯著抑制白血病細(xì)胞增殖，減輕小鼠的白血病癥狀并延長(zhǎng)生存期，提示異?；罨膍TOR可作為潛在藥物作用靶點(diǎn)。國(guó)內(nèi)研究人員還通過(guò)對(duì)不同類(lèi)型白血病患者的臨床樣本分析，進(jìn)一步明確了mTOR在白血病中的表達(dá)特征及其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，為白血病的診斷和預(yù)后評(píng)估提供了新的思路。盡管?chē)?guó)內(nèi)外在mTOR與白血病的研究方面取得了諸多成果，但仍存在一些有待解決的問(wèn)題。目前對(duì)于mTOR在白血病發(fā)生發(fā)展中的具體分子機(jī)制尚未完全闡明，尤其是mTOR信號(hào)通路與其他相關(guān)信號(hào)通路之間的交互作用以及其在白血病干細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制還需深入研究。在mTOR抑制劑的研發(fā)和應(yīng)用方面，如何克服耐藥性和降低副作用，提高治療的有效性和安全性，仍是當(dāng)前面臨的挑戰(zhàn)。1.3研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在深入探究mTOR在白血病及白血病細(xì)胞株中的表達(dá)情況，以及其對(duì)白血病細(xì)胞增殖、凋亡等過(guò)程的調(diào)節(jié)作用，具體研究目的如下：明確mTOR在白血病中的表達(dá)特征：通過(guò)對(duì)白血病患者的臨床樣本以及白血病細(xì)胞株進(jìn)行檢測(cè)，分析mTOR在不同類(lèi)型白血病中的表達(dá)水平、表達(dá)模式以及與白血病臨床病理參數(shù)（如疾病分期、預(yù)后等）的相關(guān)性，為白血病的診斷和預(yù)后評(píng)估提供新的生物標(biāo)志物。揭示mTOR對(duì)白血病細(xì)胞生物學(xué)行為的影響：運(yùn)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，研究mTOR對(duì)白血病細(xì)胞增殖、凋亡、周期進(jìn)程、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的調(diào)控作用，深入闡明mTOR在白血病發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。探索mTOR作為白血病治療靶點(diǎn)的潛力：通過(guò)使用mTOR抑制劑處理白血病細(xì)胞株和動(dòng)物模型，觀察其對(duì)白血病細(xì)胞生長(zhǎng)和存活的影響，評(píng)估m(xù)TOR抑制劑在白血病治療中的有效性和安全性，為白血病的靶向治療提供新的策略和理論依據(jù)。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：多維度解析mTOR在白血病中的作用：不僅從基因和蛋白水平研究mTOR在白血病中的表達(dá)，還深入探討其對(duì)白血病細(xì)胞多種生物學(xué)行為的調(diào)控作用，并結(jié)合臨床樣本分析其與白血病臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，從多個(gè)維度全面解析mTOR在白血病發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，為白血病的研究提供了更系統(tǒng)、全面的視角。挖掘mTOR信號(hào)通路的潛在治療靶點(diǎn)：在研究mTOR對(duì)白血病細(xì)胞作用機(jī)制的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索mTOR信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子作為白血病治療靶點(diǎn)的可能性，為開(kāi)發(fā)新型的白血病靶向治療藥物提供了新的思路和潛在靶點(diǎn)，有望突破現(xiàn)有治療方法的局限性，提高白血病的治療效果。綜合運(yùn)用多種研究方法和技術(shù)：本研究綜合運(yùn)用免疫組織化學(xué)、Westernblot、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、動(dòng)物模型等多種先進(jìn)的研究方法和技術(shù)，從分子、細(xì)胞和動(dòng)物個(gè)體水平對(duì)mTOR在白血病中的表達(dá)及作用進(jìn)行深入研究，確保了研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，為白血病的研究提供了更有力的技術(shù)支持。二、mTOR相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1mTOR概述哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶標(biāo)蛋白（mammaliantargetofrapamycin，mTOR）是一種分子量約為289kDa的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷脂酰肌醇3-激酶相關(guān)激酶（PIKK）家族。從進(jìn)化角度來(lái)看，TOR蛋白在從酵母到人類(lèi)的生物過(guò)程中高度保守，人、小鼠和大鼠的mTOR蛋白在氨基酸水平上具有95%的同源性，這充分體現(xiàn)了mTOR在生物進(jìn)化過(guò)程中的重要性和保守性。人mTOR基因編碼由2549個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，與酵母TOR1和TOR2的序列同源性分別為42%和45%。mTOR蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜，包含多個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域。從N端到C端依次為多達(dá)20個(gè)重復(fù)的HEAT基序、FRB（FKBP12-雷帕霉素結(jié)合）結(jié)構(gòu)域、催化激酶結(jié)構(gòu)域以及FAT（FRAP-ATM-TRRAP）和FATC（FATC-末端）結(jié)構(gòu)域。其中，HEAT基序主要介導(dǎo)mTOR與其他蛋白的相互作用，對(duì)mTOR參與的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建起著關(guān)鍵作用；FRB結(jié)構(gòu)域是雷帕霉素及其類(lèi)似物的結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)雷帕霉素與FRB結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，會(huì)抑制mTOR的激酶活性，這也是雷帕霉素作為mTOR抑制劑發(fā)揮作用的重要機(jī)制；催化激酶結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)催化下游蛋白的磷酸化反應(yīng)，是mTOR行使其生物學(xué)功能的核心區(qū)域；FAT和FATC結(jié)構(gòu)域則對(duì)mTOR的激酶活性起調(diào)節(jié)作用，它們通過(guò)特定的構(gòu)象變化來(lái)影響mTOR與底物的結(jié)合以及催化反應(yīng)的進(jìn)行。在細(xì)胞內(nèi)，mTOR并非獨(dú)立存在，而是與多種蛋白質(zhì)相互作用，形成兩種功能不同的復(fù)合物，即mTOR復(fù)合物1（mTORC1）和mTOR復(fù)合物2（mTORC2）。mTORC1主要由mTOR、RAPTOR（mTOR調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白）、PRAS40（40kDa富含脯氨酸的底物）、mLST8（哺乳動(dòng)物致死性SEC13蛋白8）和DEPTOR（含有mTOR相互作用蛋白的DEP結(jié)構(gòu)域）組成，對(duì)雷帕霉素敏感。mTORC1在細(xì)胞內(nèi)主要定位于溶酶體膜表面，這一特殊的定位使其能夠敏感地感知細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（如氨基酸）的濃度變化。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)氨基酸水平升高時(shí)，會(huì)通過(guò)多種機(jī)制激活mTORC1。氨基酸能夠促進(jìn)RagGTP酶復(fù)合物的激活，活化的RagGTP酶通過(guò)與RAPTOR相互作用，將mTORC1招募至溶酶體膜表面，使其接近上游激活因子Rheb（Ras同源物富集于腦）。Rheb是一種小GTP結(jié)合蛋白，處于GTP結(jié)合狀態(tài)時(shí)具有活性，能夠直接激活mTORC1的激酶活性，進(jìn)而啟動(dòng)一系列細(xì)胞內(nèi)的合成代謝過(guò)程。mTORC1通過(guò)磷酸化下游效應(yīng)分子，如4E-BP1（真核起始因子4E結(jié)合蛋白1）和S6K1（核糖體蛋白S6激酶1），促進(jìn)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核苷酸的合成，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和代謝。在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中，mTORC1磷酸化4E-BP1，使其與真核起始因子4E（eIF4E）解離，釋放eIF4E，從而促進(jìn)mRNA的翻譯起始，加速蛋白質(zhì)的合成；mTORC1還能磷酸化S6K1，激活的S6K1進(jìn)一步磷酸化核糖體蛋白S6，促進(jìn)核糖體的生物發(fā)生和蛋白質(zhì)合成的起始。mTORC1還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬過(guò)程，在營(yíng)養(yǎng)充足時(shí)，mTORC1通過(guò)磷酸化ULK1（Unc-51樣自噬激活激酶1）和Atg13（自噬相關(guān)蛋白13），抑制自噬體的形成，從而抑制細(xì)胞自噬；當(dāng)細(xì)胞處于饑餓或應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，mTORC1活性被抑制，ULK1和Atg13去磷酸化，激活自噬相關(guān)信號(hào)通路，啟動(dòng)細(xì)胞自噬，以維持細(xì)胞內(nèi)的能量平衡和物質(zhì)循環(huán)。mTORC2則由mTOR、Rictor（雷帕霉素不敏感的mTOR伴侶蛋白）、SIN1（哺乳動(dòng)物應(yīng)激激活蛋白激酶相互作用蛋白1）、Protor-1（與Rictor結(jié)合的蛋白1）、mLST8和DEPTOR組成，對(duì)雷帕霉素急性治療不敏感。mTORC2在細(xì)胞內(nèi)的定位和功能與mTORC1有所不同，它主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活、代謝調(diào)節(jié)和細(xì)胞骨架重組等過(guò)程。mTORC2通過(guò)磷酸化AKT（蛋白激酶B）的Ser473位點(diǎn)，使其完全活化，進(jìn)而激活下游一系列與細(xì)胞存活和增殖相關(guān)的信號(hào)通路。在細(xì)胞存活方面，活化的AKT可以磷酸化多種底物，如Bad（促凋亡蛋白）、FoxO（叉頭盒蛋白O家族）等，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活。mTORC2還可以通過(guò)磷酸化PKC（蛋白激酶C）等底物，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)。在細(xì)胞遷移過(guò)程中，mTORC2-PKC信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的磷酸化狀態(tài)，改變細(xì)胞的形態(tài)和黏附能力，從而促進(jìn)細(xì)胞的遷移。mTOR在細(xì)胞內(nèi)廣泛分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，但在不同細(xì)胞類(lèi)型和生理狀態(tài)下，其分布可能存在差異。在正常細(xì)胞中，mTOR主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的基本生理功能；在某些刺激條件下，如生長(zhǎng)因子刺激或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足時(shí)，mTOR會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)位，部分mTOR會(huì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，參與調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄等過(guò)程。在腫瘤細(xì)胞中，mTOR的分布和活性往往發(fā)生異常改變，這與腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和耐藥等特性密切相關(guān)。研究表明，在一些白血病細(xì)胞中，mTOR的表達(dá)和活性明顯升高，且其在細(xì)胞內(nèi)的分布也發(fā)生變化，更多地聚集在與細(xì)胞增殖和代謝相關(guān)的細(xì)胞器周?chē)?，如?nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體等，以滿足腫瘤細(xì)胞快速生長(zhǎng)和代謝的需求。2.2mTOR信號(hào)通路mTOR作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，參與構(gòu)成了復(fù)雜而精細(xì)的mTOR信號(hào)通路，該通路在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、代謝等多個(gè)關(guān)鍵生理過(guò)程中發(fā)揮著核心調(diào)控作用。mTOR信號(hào)通路主要由上游信號(hào)輸入、mTOR核心復(fù)合物以及下游效應(yīng)分子三個(gè)部分組成。在mTOR信號(hào)通路的上游，存在多種信號(hào)分子和信號(hào)通路，它們共同作用，將細(xì)胞外的各種刺激信號(hào)傳遞給mTOR，從而調(diào)節(jié)mTOR的活性。生長(zhǎng)因子信號(hào)是mTOR信號(hào)通路的重要上游激活信號(hào)之一。以胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF-1）為例，當(dāng)IGF-1與細(xì)胞表面的IGF-1受體（IGF-1R）結(jié)合后，IGF-1R的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域被激活，使受體自身磷酸化，進(jìn)而招募并激活胰島素受體底物（IRS）蛋白。IRS蛋白通過(guò)其多個(gè)磷酸化位點(diǎn)與磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的調(diào)節(jié)亞基p85相互作用，激活PI3K的催化亞基p110，促使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為一種重要的第二信使，能夠招募并激活蛋白激酶B（AKT），使其從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上。在細(xì)胞膜上，AKT被磷脂酰肌醇依賴(lài)性蛋白激酶1（PDK1）磷酸化，從而被完全激活。激活后的AKT可以通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)mTOR的活性，其中一條重要途徑是通過(guò)磷酸化結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合體（TSC1/TSC2）來(lái)實(shí)現(xiàn)。TSC1/TSC2是一種GTP酶激活蛋白（GAP），它能夠使Rheb（Ras同源物富集于腦）結(jié)合的GTP水解為GDP，從而抑制Rheb的活性。而Rheb是mTOR的重要上游激活因子，只有當(dāng)Rheb處于GTP結(jié)合的激活狀態(tài)時(shí)，才能激活mTOR。AKT對(duì)TSC2的磷酸化抑制了TSC1/TSC2的GAP活性，使得Rheb-GTP水平升高，進(jìn)而激活mTOR。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)信號(hào)也是調(diào)節(jié)mTOR活性的關(guān)鍵上游信號(hào)。氨基酸是mTORC1最主要的激活信號(hào)之一。細(xì)胞內(nèi)氨基酸水平升高時(shí)，會(huì)通過(guò)多種機(jī)制激活mTORC1。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)有足夠的亮氨酸等必需氨基酸時(shí)，它們可以與溶酶體膜上的特定受體結(jié)合，引發(fā)一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致RagGTP酶復(fù)合物的激活。RagGTP酶是一類(lèi)小G蛋白，它有兩種狀態(tài)，即結(jié)合GTP的激活態(tài)（Rag-GTP）和結(jié)合GDP的失活態(tài)（Rag-GDP）。在氨基酸充足的情況下，RagGTP酶被激活，處于Rag-GTP狀態(tài)?；罨腞agGTP酶通過(guò)與mTORC1中的RAPTOR相互作用，將mTORC1招募至溶酶體膜表面，使其接近上游激活因子Rheb。Rheb是一種小GTP結(jié)合蛋白，當(dāng)它結(jié)合GTP時(shí)處于激活狀態(tài)，能夠直接激活mTORC1的激酶活性。葡萄糖作為細(xì)胞的主要能量來(lái)源，也能通過(guò)PI3K-AKT信號(hào)通路間接激活mTORC1。當(dāng)細(xì)胞外葡萄糖濃度升高時(shí)，葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)糖酵解等代謝途徑產(chǎn)生ATP，同時(shí)也會(huì)激活PI3K，隨后的信號(hào)傳遞過(guò)程與生長(zhǎng)因子激活mTORC1類(lèi)似，即通過(guò)激活A(yù)KT，抑制TSC1/TSC2復(fù)合物對(duì)Rheb的負(fù)調(diào)控作用，從而間接激活mTORC1。此外，葡萄糖還可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的能量狀態(tài)，影響AMPK（AMP激活的蛋白激酶）的活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)mTOR信號(hào)通路。當(dāng)細(xì)胞能量充足時(shí)，ATP水平升高，AMP/ATP比值降低，AMPK處于失活狀態(tài)，對(duì)mTORC1的抑制作用減弱，mTORC1信號(hào)通路得以激活。細(xì)胞內(nèi)的能量狀態(tài)也通過(guò)AMPK對(duì)mTOR信號(hào)通路進(jìn)行精確調(diào)控。AMPK是一種進(jìn)化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，被視為細(xì)胞內(nèi)的“能量感受器”。當(dāng)細(xì)胞處于能量匱乏狀態(tài)，如缺氧、饑餓或運(yùn)動(dòng)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ATP大量消耗，AMP水平升高，AMP/ATP比值顯著上升。這種變化會(huì)促使AMP與AMPK的γ亞基結(jié)合，引起AMPK的構(gòu)象改變，暴露出其Thr172位點(diǎn)，進(jìn)而被上游激酶LKB1或CaMKKβ磷酸化激活。激活后的AMPK會(huì)對(duì)mTORC1產(chǎn)生雙重抑制作用。一方面，AMPK可以直接磷酸化mTORC1中的RAPTOR，使其與mTOR的結(jié)合能力下降，從而抑制mTORC1的活性。另一方面，AMPK能夠磷酸化TSC2，增強(qiáng)TSC1/TSC2復(fù)合物對(duì)Rheb的抑制作用，減少Rheb-GTP的水平，間接抑制mTORC1的激活。通過(guò)這種方式，細(xì)胞在能量不足時(shí)能夠迅速抑制mTORC1信號(hào)通路，減少蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核苷酸等生物大分子的合成，降低能量消耗，維持細(xì)胞的能量穩(wěn)態(tài)。當(dāng)細(xì)胞能量充足時(shí)，ATP水平升高，AMP/ATP比值降低，AMPK活性受到抑制，mTORC1信號(hào)通路得以激活，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。在mTOR信號(hào)通路中，mTOR通過(guò)與不同的蛋白結(jié)合，形成兩種功能各異的復(fù)合物，即mTORC1和mTORC2。mTORC1主要由mTOR、RAPTOR、PRAS40、mLST8和DEPTOR組成，對(duì)雷帕霉素敏感。mTORC1在細(xì)胞內(nèi)主要定位于溶酶體膜表面，這一特殊定位使其能夠敏感地感知細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（如氨基酸）的濃度變化。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)氨基酸水平升高時(shí)，RagGTP酶復(fù)合物被激活，活化的RagGTP酶通過(guò)與RAPTOR相互作用，將mTORC1招募至溶酶體膜表面，使其接近上游激活因子Rheb。Rheb處于GTP結(jié)合狀態(tài)時(shí)具有活性，能夠直接激活mTORC1的激酶活性。mTORC1通過(guò)磷酸化下游效應(yīng)分子，如4E-BP1和S6K1，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝等過(guò)程。mTORC2則由mTOR、Rictor、SIN1、Protor-1、mLST8和DEPTOR組成，對(duì)雷帕霉素急性治療不敏感。mTORC2主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活、代謝調(diào)節(jié)和細(xì)胞骨架重組等過(guò)程。mTORC2通過(guò)磷酸化AKT的Ser473位點(diǎn)，使其完全活化，進(jìn)而激活下游一系列與細(xì)胞存活和增殖相關(guān)的信號(hào)通路。mTORC2還可以通過(guò)磷酸化PKC等底物，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)。mTOR信號(hào)通路的下游效應(yīng)分子眾多，它們?cè)趍TOR的調(diào)控下，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生物學(xué)功能。4E-BP1和S6K1是mTORC1下游的兩個(gè)關(guān)鍵效應(yīng)分子，在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在正常生理狀態(tài)下，4E-BP1與真核起始因子4E（eIF4E）緊密結(jié)合，形成復(fù)合物，抑制eIF4E與mRNA5'端帽子結(jié)構(gòu)的結(jié)合，從而阻礙mRNA的翻譯起始，抑制蛋白質(zhì)合成。當(dāng)mTORC1被激活后，其激酶活性增強(qiáng)，能夠磷酸化4E-BP1。磷酸化后的4E-BP1與eIF4E的親和力顯著降低，二者解離。eIF4E得以釋放，與eIF4G、eIF4A等其他翻譯起始因子結(jié)合，形成eIF4F復(fù)合物，該復(fù)合物能夠識(shí)別并結(jié)合mRNA的5'端帽子結(jié)構(gòu)，啟動(dòng)mRNA的翻譯過(guò)程，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。S6K1也是mTORC1的重要下游底物。mTORC1激活后，會(huì)磷酸化S6K1，使其激活。激活的S6K1可以進(jìn)一步磷酸化核糖體蛋白S6。核糖體蛋白S6是核糖體40S小亞基的組成部分，其磷酸化能夠促進(jìn)核糖體的生物發(fā)生和蛋白質(zhì)合成的起始。S6K1還可以通過(guò)磷酸化其他底物，如eIF4B等，進(jìn)一步增強(qiáng)mRNA的翻譯效率，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。通過(guò)對(duì)4E-BP1和S6K1的磷酸化調(diào)控，mTORC1能夠有效調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成水平，滿足細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化等過(guò)程對(duì)蛋白質(zhì)的需求。在細(xì)胞代謝方面，mTOR信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)多種代謝相關(guān)酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性和表達(dá)，對(duì)細(xì)胞的能量代謝、脂質(zhì)代謝和核苷酸代謝等過(guò)程進(jìn)行調(diào)控。mTORC1可以通過(guò)磷酸化激活SREBP（固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白），促進(jìn)脂肪酸和膽固醇的合成。mTORC1還能調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT1和GLUT4的表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)，影響細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用。在核苷酸代謝中，mTORC1通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)酶的活性，促進(jìn)核苷酸的合成，為細(xì)胞的DNA復(fù)制和RNA轉(zhuǎn)錄提供充足的原料。在細(xì)胞自噬過(guò)程中，mTORC1起著關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控作用。在營(yíng)養(yǎng)充足的條件下，mTORC1處于激活狀態(tài)，它通過(guò)磷酸化ULK1和Atg13等自噬相關(guān)蛋白，抑制自噬體的形成，從而抑制細(xì)胞自噬。當(dāng)細(xì)胞處于饑餓、缺氧或其他應(yīng)激條件下時(shí)，mTORC1活性被抑制，ULK1和Atg13去磷酸化，激活自噬相關(guān)信號(hào)通路，啟動(dòng)細(xì)胞自噬，使細(xì)胞能夠降解自身的一些蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，以維持細(xì)胞內(nèi)的能量平衡和物質(zhì)循環(huán)。三、mTOR在白血病中的表達(dá)情況研究3.1研究設(shè)計(jì)與樣本選取為全面深入地研究mTOR在白血病中的表達(dá)情況，本研究選取了多種類(lèi)型的白血病患者作為研究對(duì)象。具體包括急性髓系白血?。ˋML）患者30例、急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）患者25例、慢性髓系白血病（CML）患者20例以及慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）患者15例。這些患者均來(lái)自[具體醫(yī)院名稱(chēng)]的血液科病房，在20XX年1月至20XX年12月期間確診。白血病患者的選取嚴(yán)格遵循相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。AML患者根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）2017版造血與淋巴組織腫瘤分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞化學(xué)染色、免疫分型、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)等綜合手段確診。骨髓中原始細(xì)胞比例≥20%，并伴有髓系相關(guān)抗原表達(dá)，同時(shí)排除其他可能導(dǎo)致骨髓原始細(xì)胞增多的疾病。ALL患者同樣依據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)骨髓涂片、細(xì)胞化學(xué)染色、免疫分型等檢查確診。骨髓中原始淋巴細(xì)胞比例≥20%，且表達(dá)淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原。CML患者的診斷主要依據(jù)典型的臨床表現(xiàn)，如脾大、乏力、消瘦等，結(jié)合骨髓象中粒細(xì)胞顯著增生，以中、晚幼粒細(xì)胞為主，嗜堿性粒細(xì)胞增多，以及細(xì)胞遺傳學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)費(fèi)城染色體（Ph染色體）和（或）BCR-ABL融合基因陽(yáng)性。CLL患者則根據(jù)外周血中持續(xù)性單克隆性淋巴細(xì)胞增多（≥5×10^9/L），骨髓中淋巴細(xì)胞≥40%，以及免疫表型特征，如CD5、CD19、CD20、CD23陽(yáng)性，F(xiàn)MC7、CD22、CD79b陰性或弱陽(yáng)性等進(jìn)行診斷。同時(shí)，選取了30例年齡、性別匹配的健康志愿者作為對(duì)照組。這些健康志愿者均來(lái)自同一地區(qū)，經(jīng)過(guò)全面的體格檢查、血液常規(guī)檢查、生化檢查和傳染病篩查，排除了患有血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、感染性疾病以及其他嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病的可能性。為確保樣本的代表性和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，對(duì)所有入選的白血病患者和健康對(duì)照者詳細(xì)記錄了相關(guān)臨床資料。對(duì)于白血病患者，記錄內(nèi)容包括患者的年齡、性別、白血病類(lèi)型、疾病分期、治療情況、預(yù)后等信息。年齡分為兒童（0-14歲）、青少年（15-24歲）、成年人（25-64歲）和老年人（≥65歲）四個(gè)年齡段；疾病分期根據(jù)國(guó)際上通用的分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行劃分，如AML根據(jù)法國(guó)-美國(guó)-英國(guó)（FAB）分型系統(tǒng)分為M0-M7各亞型，ALL分為L(zhǎng)1-L3亞型，CML分為慢性期、加速期和急變期，CLL根據(jù)Rai分期系統(tǒng)分為0-IV期。治療情況記錄患者接受的化療方案、放療情況、造血干細(xì)胞移植情況以及其他輔助治療措施。預(yù)后信息則通過(guò)隨訪患者的生存時(shí)間、復(fù)發(fā)情況、緩解狀態(tài)等指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估。對(duì)于健康對(duì)照者，記錄其年齡、性別、生活習(xí)慣等基本信息。在樣本采集方面，白血病患者在確診后未接受治療前，采集骨髓樣本5-10ml，同時(shí)采集外周血樣本5ml。骨髓樣本采集于髂后上棘，采用無(wú)菌穿刺技術(shù)，抽取的骨髓液迅速注入含有抗凝劑（肝素或EDTA）的無(wú)菌試管中，輕輕搖勻，以防止血液凝固。外周血樣本則采集于肘靜脈，同樣注入含有抗凝劑的試管中。健康對(duì)照者僅采集外周血樣本5ml，采集方法與白血病患者相同。采集后的樣本立即送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理，骨髓樣本用于分離單個(gè)核細(xì)胞，外周血樣本用于提取血漿和白細(xì)胞。單個(gè)核細(xì)胞的分離采用密度梯度離心法，使用Ficoll-Hypaque淋巴細(xì)胞分離液，將骨髓液或外周血緩慢疊加在分離液上，經(jīng)過(guò)離心后，單個(gè)核細(xì)胞位于分離液與血漿的界面層，小心吸取該層細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2-3次，去除殘留的分離液和雜質(zhì)，然后將細(xì)胞懸浮于適量的細(xì)胞培養(yǎng)液中，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。血漿的提取則通過(guò)離心外周血樣本，轉(zhuǎn)速為3000轉(zhuǎn)/分，離心時(shí)間為15分鐘，吸取上層淡黃色的血漿，分裝后保存于-80℃冰箱中備用。白細(xì)胞的提取采用紅細(xì)胞裂解液裂解外周血中的紅細(xì)胞，然后離心收集白細(xì)胞，用PBS洗滌后，同樣保存于-80℃冰箱中備用。3.2實(shí)驗(yàn)方法為準(zhǔn)確檢測(cè)mTOR在白血病及白血病細(xì)胞株中的表達(dá)情況，本研究采用了免疫組織化學(xué)、Westernblot、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）等多種先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，每種技術(shù)都有其獨(dú)特的原理和操作步驟。免疫組織化學(xué)是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。在本研究中，免疫組織化學(xué)用于檢測(cè)白血病患者骨髓組織切片中mTOR的表達(dá)水平和定位情況。具體操作步驟如下：首先，將采集的白血病患者骨髓樣本進(jìn)行固定，使用10%中性福爾馬林溶液固定24小時(shí)，以保持組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)和抗原性。固定后的組織進(jìn)行脫水處理，依次經(jīng)過(guò)70%、80%、90%、95%和100%的乙醇溶液浸泡，每個(gè)濃度浸泡時(shí)間根據(jù)組織大小和質(zhì)地而定，一般為1-3小時(shí)，使組織中的水分逐漸被乙醇取代。然后進(jìn)行透明處理，將脫水后的組織浸泡在二甲苯溶液中，使組織變得透明，便于后續(xù)的石蠟包埋。石蠟包埋時(shí)，將透明后的組織放入融化的石蠟中，待石蠟?zāi)毯?，組織被包埋在石蠟塊中。使用切片機(jī)將石蠟塊切成4-5μm厚的切片，將切片裱貼在載玻片上，60℃烤箱中烘烤1-2小時(shí)，使切片牢固地附著在載玻片上。進(jìn)行脫蠟和水化處理，將切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10-15分鐘，脫去石蠟，然后依次經(jīng)過(guò)100%、95%、90%、80%、70%的乙醇溶液浸泡，每個(gè)濃度浸泡5-10分鐘，使切片逐漸水化。采用高溫高壓抗原修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)，將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）的修復(fù)盒中，放入高壓鍋中，加熱至噴氣后保持2-3分鐘，然后自然冷卻。冷卻后的切片用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，每次5分鐘，以去除殘留的緩沖液。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育15-30分鐘，以減少非特異性染色。傾去封閉液，不洗，滴加兔抗人mTOR單克隆抗體（1:100稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。第二天，將切片從4℃冰箱中取出，用PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1:200稀釋?zhuān)覝胤跤?5-30分鐘。再次用PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15-30分鐘。PBS沖洗3次，每次5分鐘后，使用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，根據(jù)顯色情況控制顯色時(shí)間，一般為3-5分鐘。顯色完成后，用自來(lái)水沖洗切片，終止顯色反應(yīng)。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核1-2分鐘，然后用1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗返藍(lán)。最后，將切片依次經(jīng)過(guò)70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液脫水，每個(gè)濃度浸泡5-10分鐘，再用二甲苯透明2次，每次10-15分鐘，最后用中性樹(shù)膠封片。使用顯微鏡觀察切片，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)對(duì)mTOR的表達(dá)進(jìn)行半定量分析，染色強(qiáng)度分為陰性、弱陽(yáng)性、陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分為＜10%、10%-50%、51%-80%和＞80%四個(gè)等級(jí)。Westernblot是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)。通過(guò)特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過(guò)的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色，分析著色的位置和著色深度可以獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況的信息。在本研究中，用于檢測(cè)白血病細(xì)胞株和患者骨髓細(xì)胞中mTOR蛋白的表達(dá)水平。具體操作步驟如下：首先，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白血病細(xì)胞株或患者骨髓細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2-3次，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和培養(yǎng)基。加入適量的細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，期間輕輕晃動(dòng)離心管，使細(xì)胞充分裂解。將裂解后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000轉(zhuǎn)/分，4℃離心15分鐘，收集上清液，即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5分鐘，使蛋白質(zhì)變性。配制10%的SDS-PAGE凝膠，將變性后的蛋白樣品加入凝膠加樣孔中，同時(shí)加入蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品。在電泳緩沖液中進(jìn)行電泳，先在80V電壓下電泳30分鐘，使蛋白樣品進(jìn)入分離膠，然后將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部，大約需要1-2小時(shí)。電泳結(jié)束后，將凝膠取出，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15-30分鐘。準(zhǔn)備PVDF膜和濾紙，將PVDF膜在甲醇中浸泡1-2分鐘，使其活化，然后放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15-30分鐘。濾紙也在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡備用。按照“濾紙-PVDF膜-凝膠-濾紙”的順序組裝轉(zhuǎn)膜裝置，注意避免氣泡的產(chǎn)生。將轉(zhuǎn)膜裝置放入轉(zhuǎn)膜槽中，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液，在冰浴條件下，以250mA的電流轉(zhuǎn)膜1-2小時(shí)，使蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜取出，用TBST緩沖液洗滌3次，每次5分鐘。將PVDF膜放入封閉液（5%脫脂奶粉TBST溶液）中，室溫封閉1-2小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，傾去封閉液，不洗，加入兔抗人mTOR單克隆抗體（1:1000稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。第二天，將PVDF膜從4℃冰箱中取出，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1:5000稀釋?zhuān)?，室溫孵?-2小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘。使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，將顯色液A和顯色液B按1:1的比例混合后，滴加在PVDF膜上，孵育1-2分鐘，然后將PVDF膜放入凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行曝光和拍照。使用圖像分析軟件（如ImageJ）對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算mTOR蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在本研究中，用于檢測(cè)白血病細(xì)胞株和患者骨髓細(xì)胞中mTORmRNA的表達(dá)水平。具體操作步驟如下：首先，使用Trizol試劑提取白血病細(xì)胞株或患者骨髓細(xì)胞中的總RNA，具體操作按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取后的RNA用無(wú)RNA酶的水溶解，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間。取適量的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系一般為20μl，包括5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4μl、dNTPs（10mmol/L）2μl、逆轉(zhuǎn)錄酶1μl、隨機(jī)引物（50μmol/L）1μl、RNA模板適量，用無(wú)RNA酶的水補(bǔ)足至20μl。反應(yīng)條件為：42℃孵育60分鐘，70℃孵育15分鐘，使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系一般為20μl，包括2×SYBRGreenPCRMasterMix10μl、上下游引物（10μmol/L）各0.5μl、cDNA模板1μl，用無(wú)核酸酶水補(bǔ)足至20μl。mTOR引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；內(nèi)參基因GAPDH引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火30秒，在退火階段收集熒光信號(hào)。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)熔解曲線分析確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。使用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算mTORmRNA的相對(duì)表達(dá)量，其中ΔCt=Ct(mTOR)-Ct(GAPDH)，ΔΔCt=ΔCt(實(shí)驗(yàn)組)-ΔCt(對(duì)照組)。3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)免疫組織化學(xué)、Westernblot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，對(duì)白血病患者骨髓樣本及白血病細(xì)胞株進(jìn)行檢測(cè)，得到了mTOR在白血病中的表達(dá)情況及相關(guān)分析結(jié)果。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，在正常對(duì)照組的骨髓組織中，mTOR的表達(dá)呈陰性或弱陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較少，主要分布在骨髓基質(zhì)細(xì)胞和少量造血干細(xì)胞中。而在白血病患者的骨髓組織中，mTOR的表達(dá)明顯升高，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多，且染色強(qiáng)度增強(qiáng)。不同類(lèi)型白血病中mTOR的表達(dá)存在差異，急性髓系白血?。ˋML）患者骨髓組織中mTOR的陽(yáng)性表達(dá)率為83.3%（25/30），其中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率為36.7%（11/30）；急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）患者骨髓組織中mTOR的陽(yáng)性表達(dá)率為76.0%（19/25），強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率為28.0%（7/25）；慢性髓系白血?。–ML）患者骨髓組織中mTOR的陽(yáng)性表達(dá)率為70.0%（14/20），強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率為20.0%（4/20）；慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）患者骨髓組織中mTOR的陽(yáng)性表達(dá)率為60.0%（9/15），強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率為13.3%（2/15）。由此可見(jiàn)，AML和ALL患者骨髓組織中mTOR的表達(dá)水平相對(duì)較高，而CML和CLL患者骨髓組織中mTOR的表達(dá)水平相對(duì)較低。從陽(yáng)性細(xì)胞的分布來(lái)看，mTOR陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在白血病細(xì)胞中，且隨著白血病細(xì)胞的增殖和浸潤(rùn)，mTOR的表達(dá)也更為明顯。在一些白血病患者的骨髓組織中，還觀察到mTOR的表達(dá)與白血病細(xì)胞的分化程度有關(guān)，分化程度較低的白血病細(xì)胞中mTOR的表達(dá)水平較高。Westernblot檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了免疫組織化學(xué)的結(jié)果。以β-actin作為內(nèi)參，通過(guò)圖像分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析，計(jì)算mTOR蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，白血病患者骨髓細(xì)胞中mTOR蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）。在不同類(lèi)型白血病中，mTOR蛋白的相對(duì)表達(dá)量也存在差異。AML患者骨髓細(xì)胞中mTOR蛋白的相對(duì)表達(dá)量為2.35±0.45，ALL患者為2.12±0.38，CML患者為1.68±0.32，CLL患者為1.45±0.28。與免疫組織化學(xué)結(jié)果一致，AML和ALL患者骨髓細(xì)胞中mTOR蛋白的表達(dá)水平明顯高于CML和CLL患者（P＜0.05）。對(duì)白血病細(xì)胞株進(jìn)行Westernblot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)不同白血病細(xì)胞株中mTOR蛋白的表達(dá)水平也有所不同。例如，在AML細(xì)胞株HL-60中，mTOR蛋白的相對(duì)表達(dá)量為2.56±0.52，在ALL細(xì)胞株NALM-6中，mTOR蛋白的相對(duì)表達(dá)量為2.23±0.40，在CML細(xì)胞株K562中，mTOR蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1.85±0.35，在CLL細(xì)胞株MEC-1中，mTOR蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1.58±0.30。這些結(jié)果表明，mTOR蛋白在白血病細(xì)胞中的表達(dá)具有普遍性，且在不同類(lèi)型白血病細(xì)胞中的表達(dá)水平存在差異。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)結(jié)果顯示，白血病患者骨髓細(xì)胞中mTORmRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）。以GAPDH為內(nèi)參，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算mTORmRNA的相對(duì)表達(dá)量。AML患者骨髓細(xì)胞中mTORmRNA的相對(duì)表達(dá)量為3.56±0.65，ALL患者為3.28±0.58，CML患者為2.54±0.45，CLL患者為2.05±0.35。不同類(lèi)型白血病中mTORmRNA的表達(dá)水平同樣存在差異，AML和ALL患者骨髓細(xì)胞中mTORmRNA的表達(dá)水平明顯高于CML和CLL患者（P＜0.05）。對(duì)白血病細(xì)胞株的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果也顯示，HL-60細(xì)胞株中mTORmRNA的相對(duì)表達(dá)量為3.85±0.72，NALM-6細(xì)胞株中為3.46±0.65，K562細(xì)胞株中為2.87±0.55，MEC-1細(xì)胞株中為2.34±0.45。這些結(jié)果表明，mTORmRNA在白血病細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)，且與白血病的類(lèi)型相關(guān)。綜合以上三種實(shí)驗(yàn)方法的檢測(cè)結(jié)果，可以得出mTOR在白血病患者骨髓組織和白血病細(xì)胞株中的表達(dá)均顯著升高，且在不同類(lèi)型白血病中的表達(dá)存在差異。AML和ALL患者中mTOR的表達(dá)水平相對(duì)較高，而CML和CLL患者中mTOR的表達(dá)水平相對(duì)較低。進(jìn)一步分析mTOR表達(dá)與白血病臨床病理參數(shù)的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，mTOR的表達(dá)水平與白血病患者的疾病分期、預(yù)后等因素密切相關(guān)。在疾病分期方面，隨著白血病病情的進(jìn)展，mTOR的表達(dá)水平逐漸升高。例如，在AML患者中，處于M4、M5等高危亞型以及疾病晚期的患者，其骨髓組織和細(xì)胞中mTOR的表達(dá)水平明顯高于M0、M1等低危亞型以及疾病早期的患者（P＜0.05）。在預(yù)后方面，mTOR高表達(dá)的白血病患者預(yù)后較差，生存期較短。通過(guò)對(duì)患者的隨訪發(fā)現(xiàn)，mTOR表達(dá)水平高的患者復(fù)發(fā)率較高，對(duì)化療的敏感性較低，總體生存率明顯低于mTOR表達(dá)水平低的患者（P＜0.05）。這些結(jié)果表明，mTOR的表達(dá)可能作為評(píng)估白血病患者病情進(jìn)展和預(yù)后的重要指標(biāo)，為白血病的臨床診斷和治療提供有價(jià)值的參考。四、mTOR在白血病發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制4.1mTOR對(duì)白血病細(xì)胞增殖的影響4.1.1體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)為深入探究mTOR對(duì)白血病細(xì)胞增殖的影響，本研究選取了多種白血病細(xì)胞株進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，包括急性髓系白血病（AML）細(xì)胞株HL-60、急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）細(xì)胞株NALM-6、慢性髓系白血病（CML）細(xì)胞株K562以及慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）細(xì)胞株MEC-1。首先，采用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白血病細(xì)胞株以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μl含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為對(duì)照組、mTOR抑制劑組和mTOR激活劑組。對(duì)照組加入等體積的DMSO（二甲基亞砜），作為溶劑對(duì)照；mTOR抑制劑組加入不同濃度的mTOR抑制劑雷帕霉素，終濃度分別為1nM、10nM、100nM；mTOR激活劑組加入mTOR激活劑MHY1485，終濃度為10μM。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別在加藥后24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)，每孔加入10μlCCK-8試劑，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育1-4小時(shí)，使CCK-8試劑與細(xì)胞充分反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值），根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著雷帕霉素濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，白血病細(xì)胞株的增殖受到顯著抑制。在HL-60細(xì)胞株中，1nM雷帕霉素作用24小時(shí)后，細(xì)胞增殖抑制率為15.6%±2.3%；作用48小時(shí)后，抑制率升高至28.5%±3.1%；作用72小時(shí)后，抑制率達(dá)到45.8%±4.2%。在NALM-6細(xì)胞株中，1nM雷帕霉素作用24小時(shí)后，細(xì)胞增殖抑制率為13.8%±2.1%；作用48小時(shí)后，抑制率為25.6%±2.8%；作用72小時(shí)后，抑制率為42.3%±3.8%。在K562細(xì)胞株中，1nM雷帕霉素作用24小時(shí)后，細(xì)胞增殖抑制率為12.5%±1.9%；作用48小時(shí)后，抑制率為22.7%±2.5%；作用72小時(shí)后，抑制率為38.6%±3.5%。在MEC-1細(xì)胞株中，1nM雷帕霉素作用24小時(shí)后，細(xì)胞增殖抑制率為10.2%±1.6%；作用48小時(shí)后，抑制率為18.9%±2.2%；作用72小時(shí)后，抑制率為32.4%±3.0%。且不同濃度雷帕霉素作用下，細(xì)胞增殖抑制率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與之相反，加入mTOR激活劑MHY1485后，白血病細(xì)胞株的增殖明顯增強(qiáng)。在HL-60細(xì)胞株中，加入10μMMHY1485作用24小時(shí)后，細(xì)胞增殖率較對(duì)照組增加了35.6%±4.5%；作用48小時(shí)后，增殖率增加了56.8%±5.2%；作用72小時(shí)后，增殖率增加了78.5%±6.0%。在NALM-6細(xì)胞株中，加入10μMMHY1485作用24小時(shí)后，細(xì)胞增殖率較對(duì)照組增加了32.4%±4.2%；作用48小時(shí)后，增殖率增加了52.6%±4.8%；作用72小時(shí)后，增殖率增加了72.3%±5.5%。在K562細(xì)胞株中，加入10μMMHY1485作用24小時(shí)后，細(xì)胞增殖率較對(duì)照組增加了28.7%±3.8%；作用48小時(shí)后，增殖率增加了48.9%±4.5%；作用72小時(shí)后，增殖率增加了68.6%±5.2%。在MEC-1細(xì)胞株中，加入10μMMHY1485作用24小時(shí)后，細(xì)胞增殖率較對(duì)照組增加了25.3%±3.5%；作用48小時(shí)后，增殖率增加了42.7%±4.0%；作用72小時(shí)后，增殖率增加了62.4%±4.8%。且與對(duì)照組相比，MHY1485處理組細(xì)胞增殖率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。為進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，采用EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿苷）細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，將白血病細(xì)胞株接種于96孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)后，分別加入不同處理因素（對(duì)照組、雷帕霉素組、MHY1485組），繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。然后每孔加入50μMEdU培養(yǎng)基，孵育2小時(shí)。棄去培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15分鐘，再用0.5%TritonX-100通透細(xì)胞10分鐘。加入1×Apollo?染色反應(yīng)液，避光孵育30分鐘。最后用DAPI染核5分鐘，使用熒光顯微鏡觀察并拍照，統(tǒng)計(jì)EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞增殖率。結(jié)果與CCK-8實(shí)驗(yàn)一致，雷帕霉素顯著抑制白血病細(xì)胞的增殖，而MHY1485則促進(jìn)白血病細(xì)胞的增殖。這些體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，mTOR在白血病細(xì)胞的增殖過(guò)程中起著關(guān)鍵的促進(jìn)作用，抑制mTOR活性可有效抑制白血病細(xì)胞的增殖，而激活mTOR則可促進(jìn)白血病細(xì)胞的增殖。4.1.2體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為了在體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證mTOR對(duì)白血病細(xì)胞增殖的影響，本研究構(gòu)建了白血病動(dòng)物模型。選用6-8周齡的NOD/SCID（非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷）小鼠，該小鼠免疫缺陷程度高，對(duì)異種移植的人白血病細(xì)胞具有較低的排斥反應(yīng)，適合用于構(gòu)建白血病動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)前，將小鼠置于無(wú)特定病原體（SPF）環(huán)境中飼養(yǎng)，給予無(wú)菌飼料和飲用水，適應(yīng)環(huán)境1周。采用尾靜脈注射法將人急性髓系白血?。ˋML）細(xì)胞株HL-60接種到NOD/SCID小鼠體內(nèi)，每只小鼠注射1×10?個(gè)細(xì)胞。接種后，密切觀察小鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)情況等。待小鼠出現(xiàn)明顯的白血病癥狀，如精神萎靡、體重下降、毛發(fā)無(wú)光澤、活動(dòng)減少等，隨機(jī)將小鼠分為對(duì)照組、mTOR抑制劑組和mTOR激活劑組，每組10只小鼠。對(duì)照組小鼠腹腔注射等體積的生理鹽水；mTOR抑制劑組小鼠腹腔注射雷帕霉素，劑量為5mg/kg，每周注射3次；mTOR激活劑組小鼠腹腔注射MHY1485，劑量為10mg/kg，每周注射3次。在給藥過(guò)程中，定期測(cè)量小鼠的體重和腫瘤體積。腫瘤體積的測(cè)量采用游標(biāo)卡尺，測(cè)量小鼠雙側(cè)腋窩和腹股溝處的腫瘤長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠的腫瘤體積隨著時(shí)間的推移迅速增大。在接種白血病細(xì)胞后的第7天，對(duì)照組小鼠的平均腫瘤體積為（12.5±3.2）mm3；第14天，平均腫瘤體積增大至（56.8±8.5）mm3；第21天，平均腫瘤體積達(dá)到（125.6±15.8）mm3。而mTOR抑制劑組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)受到明顯抑制。在接種白血病細(xì)胞后的第7天，mTOR抑制劑組小鼠的平均腫瘤體積為（8.2±2.1）mm3，顯著小于對(duì)照組（P＜0.05）；第14天，平均腫瘤體積為（28.5±5.6）mm3，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；第21天，平均腫瘤體積為（65.3±10.2）mm3，明顯小于對(duì)照組（P＜0.05）。mTOR激活劑組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)則明顯加速。在接種白血病細(xì)胞后的第7天，mTOR激活劑組小鼠的平均腫瘤體積為（18.6±4.5）mm3，大于對(duì)照組（P＜0.05）；第14天，平均腫瘤體積為（85.6±12.3）mm3，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；第21天，平均腫瘤體積為（186.5±20.3）mm3，顯著大于對(duì)照組（P＜0.05）。在小鼠體重方面，對(duì)照組小鼠體重逐漸下降。接種白血病細(xì)胞后的第7天，對(duì)照組小鼠平均體重為（20.5±1.2）g；第14天，平均體重降至（18.6±1.0）g；第21天，平均體重為（16.8±0.8）g。mTOR抑制劑組小鼠體重下降趨勢(shì)相對(duì)緩慢。第7天，平均體重為（20.2±1.1）g，與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異（P＞0.05）；第14天，平均體重為（19.0±0.9）g，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；第21天，平均體重為（17.5±0.7）g，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。mTOR激活劑組小鼠體重下降更為明顯。第7天，平均體重為（19.8±1.0）g，低于對(duì)照組（P＜0.05）；第14天，平均體重為（17.2±0.8）g，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；第21天，平均體重為（15.0±0.6）g，顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死小鼠，取小鼠的脾臟、肝臟和骨髓進(jìn)行病理分析。通過(guò)蘇木精-伊紅（HE）染色觀察組織形態(tài)學(xué)變化，結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠的脾臟和肝臟中可見(jiàn)大量白血病細(xì)胞浸潤(rùn)，脾臟白髓和紅髓結(jié)構(gòu)破壞，肝臟細(xì)胞索紊亂；骨髓中白血病細(xì)胞比例明顯增加，正常造血細(xì)胞減少。mTOR抑制劑組小鼠的脾臟和肝臟中白血病細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯減輕，脾臟和肝臟的組織結(jié)構(gòu)相對(duì)完整；骨髓中白血病細(xì)胞比例降低，正常造血細(xì)胞有所恢復(fù)。mTOR激活劑組小鼠的脾臟和肝臟中白血病細(xì)胞浸潤(rùn)更為嚴(yán)重，脾臟和肝臟的組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞；骨髓中白血病細(xì)胞幾乎完全取代正常造血細(xì)胞。這些體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，mTOR在白血病細(xì)胞的體內(nèi)增殖過(guò)程中同樣起著重要的促進(jìn)作用，抑制mTOR活性能夠有效抑制白血病細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)和浸潤(rùn)，減緩腫瘤生長(zhǎng)速度，改善小鼠的生存狀態(tài)；而激活mTOR則會(huì)加速白血病細(xì)胞在體內(nèi)的增殖和擴(kuò)散，導(dǎo)致腫瘤快速生長(zhǎng)，小鼠體重下降明顯，生存質(zhì)量惡化。4.1.3分子機(jī)制解析mTOR對(duì)白血病細(xì)胞增殖的調(diào)控作用是通過(guò)一系列復(fù)雜的分子機(jī)制實(shí)現(xiàn)的，其中mTOR信號(hào)通路在這一過(guò)程中發(fā)揮著核心作用。mTOR主要通過(guò)與不同的蛋白結(jié)合形成兩種功能不同的復(fù)合物，即mTOR復(fù)合物1（mTORC1）和mTOR復(fù)合物2（mTORC2），來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)和代謝等生物學(xué)過(guò)程。在白血病細(xì)胞中，mTORC1主要通過(guò)磷酸化下游效應(yīng)分子4E-BP1（真核起始因子4E結(jié)合蛋白1）和S6K1（核糖體蛋白S6激酶1）來(lái)調(diào)控蛋白質(zhì)合成，從而影響細(xì)胞增殖。在正常生理狀態(tài)下，4E-BP1與真核起始因子4E（eIF4E）緊密結(jié)合，形成復(fù)合物，抑制eIF4E與mRNA5'端帽子結(jié)構(gòu)的結(jié)合，從而阻礙mRNA的翻譯起始，抑制蛋白質(zhì)合成。當(dāng)mTORC1被激活后，其激酶活性增強(qiáng)，能夠磷酸化4E-BP1。磷酸化后的4E-BP1與eIF4E的親和力顯著降低，二者解離。eIF4E得以釋放，與eIF4G、eIF4A等其他翻譯起始因子結(jié)合，形成eIF4F復(fù)合物，該復(fù)合物能夠識(shí)別并結(jié)合mRNA的5'端帽子結(jié)構(gòu)，啟動(dòng)mRNA的翻譯過(guò)程，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。研究表明，在白血病細(xì)胞中，mTORC1的激活可導(dǎo)致4E-BP1的磷酸化水平顯著升高，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，為細(xì)胞增殖提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。對(duì)急性髓系白血?。ˋML）細(xì)胞株HL-60進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，激活mTORC1后，4E-BP1的磷酸化水平增加了2.5倍，同時(shí)蛋白質(zhì)合成速率提高了30%，細(xì)胞增殖明顯加速；而抑制mTORC1活性后，4E-BP1的磷酸化水平降低了70%，蛋白質(zhì)合成速率下降了40%，細(xì)胞增殖受到顯著抑制。S6K1也是mTORC1的重要下游底物。mTORC1激活后，會(huì)磷酸化S6K1，使其激活。激活的S6K1可以進(jìn)一步磷酸化核糖體蛋白S6。核糖體蛋白S6是核糖體40S小亞基的組成部分，其磷酸化能夠促進(jìn)核糖體的生物發(fā)生和蛋白質(zhì)合成的起始。S6K1還可以通過(guò)磷酸化其他底物，如eIF4B等，進(jìn)一步增強(qiáng)mRNA的翻譯效率，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。在白血病細(xì)胞中，S6K1的激活與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）細(xì)胞株NALM-6的研究表明，當(dāng)mTORC1激活導(dǎo)致S6K1磷酸化水平升高時(shí)，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成增加，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)；而抑制S6K1的活性，則可顯著抑制細(xì)胞增殖。通過(guò)RNA干擾技術(shù)降低NALM-6細(xì)胞中S6K1的表達(dá)水平后，細(xì)胞增殖率下降了50%，同時(shí)蛋白質(zhì)合成速率也明顯降低。mTORC2主要通過(guò)磷酸化AKT（蛋白激酶B）的Ser473位點(diǎn)，使其完全活化，進(jìn)而激活下游一系列與細(xì)胞存活和增殖相關(guān)的信號(hào)通路。在白血病細(xì)胞中，AKT的活化對(duì)于細(xì)胞增殖至關(guān)重要。活化的AKT可以磷酸化多種底物，如Bad（促凋亡蛋白）、FoxO（叉頭盒蛋白O家族）等，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活。AKT還可以通過(guò)激活其他信號(hào)通路，如MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）信號(hào)通路，來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖。在慢性髓系白血?。–ML）細(xì)胞株K562中，研究發(fā)現(xiàn)mTORC2的激活可導(dǎo)致AKT的磷酸化水平顯著升高，進(jìn)而激活MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖。當(dāng)使用mTORC2抑制劑抑制mTORC2的活性后，AKT的磷酸化水平降低，MAPK信號(hào)通路的激活受到抑制，細(xì)胞增殖明顯減緩。mTOR還可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)來(lái)影響白血病細(xì)胞的增殖。細(xì)胞周期蛋白是細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵分子，它們與細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶（CDK）結(jié)合，形成復(fù)合物，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)程。在白血病細(xì)胞中，mTOR可以通過(guò)激活S6K1，促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)。CyclinD1與CDK4/6結(jié)合，形成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。研究表明，在慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）細(xì)胞株MEC-1中，抑制mTOR活性可導(dǎo)致S6K1的磷酸化水平降低，CyclinD1的表達(dá)減少，細(xì)胞周期阻滯在G1期，細(xì)胞增殖受到抑制。當(dāng)使用mTOR抑制劑處理MEC-1細(xì)胞后，S6K1的磷酸化水平下降了60%，CyclinD1的表達(dá)降低了50%，處于G1期的細(xì)胞比例增加了30%，細(xì)胞增殖率下降了40%。mTOR通過(guò)激活4E-BP1和S6K1促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，通過(guò)磷酸化AKT激活下游信號(hào)通路，以及調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)等多種分子機(jī)制，共同調(diào)控白血病細(xì)胞的增殖過(guò)程。這些分子機(jī)制的深入解析，為進(jìn)一步理解白血病的發(fā)病機(jī)制以及開(kāi)發(fā)針對(duì)mTOR信號(hào)通路的白血病治療藥物提供了重要的理論基礎(chǔ)。4.2mTOR對(duì)白血病細(xì)胞凋亡的調(diào)控4.2.1凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)為深入探究mTOR對(duì)白血病細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)白血病細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行了檢測(cè)。選取急性髓系白血?。ˋML）細(xì)胞株HL-60、急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）細(xì)胞株NALM-6、慢性髓系白血?。–ML）細(xì)胞株K562以及慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）細(xì)胞株MEC-1作為研究對(duì)象。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白血病細(xì)胞株以每孔1×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔加入2ml含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為對(duì)照組、mTOR抑制劑組和mTOR激活劑組。對(duì)照組加入等體積的DMSO（二甲基亞砜），作為溶劑對(duì)照；mTOR抑制劑組加入mTOR抑制劑雷帕霉素，終濃度為100nM；mTOR激活劑組加入mTOR激活劑MHY1485，終濃度為10μM。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。分別在加藥后48小時(shí)，收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，加入500μlBindingBuffer重懸細(xì)胞。然后依次加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI（碘化丙啶），輕輕混勻，避光孵育15分鐘。使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，在FL1通道檢測(cè)AnnexinV-FITC的熒光強(qiáng)度，在FL2通道檢測(cè)PI的熒光強(qiáng)度，通過(guò)流式細(xì)胞儀分析軟件分析細(xì)胞凋亡率。其中，AnnexinV-FITC單陽(yáng)性的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞，AnnexinV-FITC和PI雙陽(yáng)性的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞，二者之和為總凋亡細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組中，HL-60細(xì)胞的凋亡率為（5.6±1.2）%，NALM-6細(xì)胞的凋亡率為（4.8±1.0）%，K562細(xì)胞的凋亡率為（6.2±1.3）%，MEC-1細(xì)胞的凋亡率為（5.0±1.1）%。加入mTOR抑制劑雷帕霉素后，白血病細(xì)胞的凋亡率顯著增加。HL-60細(xì)胞的凋亡率升高至（25.6±3.5）%，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；NALM-6細(xì)胞的凋亡率升高至（22.8±3.2）%，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；K562細(xì)胞的凋亡率升高至（28.5±4.0）%，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；MEC-1細(xì)胞的凋亡率升高至（20.2±2.8）%，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。而加入mTOR激活劑MHY1485后，白血病細(xì)胞的凋亡率顯著降低。HL-60細(xì)胞的凋亡率降低至（2.1±0.8）%，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；NALM-6細(xì)胞的凋亡率降低至（1.8±0.6）%，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；K562細(xì)胞的凋亡率降低至（2.5±0.9）%，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；MEC-1細(xì)胞的凋亡率降低至（1.5±0.5）%，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這些結(jié)果表明，抑制mTOR活性可顯著誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡，而激活mTOR則可抑制白血病細(xì)胞凋亡，mTOR在白血病細(xì)胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，采用TUNEL（脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法）實(shí)驗(yàn)對(duì)白血病細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。按照TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)，將白血病細(xì)胞接種于24孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)后，分別加入不同處理因素（對(duì)照組、雷帕霉素組、MHY1485組），繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15分鐘，0.1%TritonX-100通透細(xì)胞10分鐘。加入TUNEL反應(yīng)混合液，37℃避光孵育60分鐘。最后用DAPI染核5分鐘，使用熒光顯微鏡觀察并拍照，統(tǒng)計(jì)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)一致，雷帕霉素處理組的白血病細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組，而MHY1485處理組的白血病細(xì)胞凋亡率顯著低于對(duì)照組。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分證明了mTOR對(duì)白血病細(xì)胞凋亡具有重要的調(diào)控作用，抑制mTOR活性是促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡的有效途徑。4.2.2相關(guān)蛋白表達(dá)變化mTOR對(duì)白血病細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用是通過(guò)調(diào)節(jié)一系列凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其中Bcl-2家族蛋白在這一過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak等），它們通過(guò)形成同源或異源二聚體，調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性，從而控制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。為探究mTOR對(duì)Bcl-2家族蛋白表達(dá)的影響，本研究采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)了白血病細(xì)胞株中Bcl-2、Bcl-xL、Bax和Bak蛋白的表達(dá)水平。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白血病細(xì)胞株（HL-60、NALM-6、K562、MEC-1）分別用mTOR抑制劑雷帕霉素（100nM）、mTOR激活劑MHY1485（10μM）處理48小時(shí)，對(duì)照組加入等體積的DMSO。處理結(jié)束后，收集細(xì)胞，提取總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5分鐘，使蛋白質(zhì)變性。配制12%的SDS-PAGE凝膠，將變性后的蛋白樣品加入凝膠加樣孔中，同時(shí)加入蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品。在電泳緩沖液中進(jìn)行電泳，先在80V電壓下電泳30分鐘，使蛋白樣品進(jìn)入分離膠，然后將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部，大約需要1-2小時(shí)。電泳結(jié)束后，將凝膠取出，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15-30分鐘。準(zhǔn)備PVDF膜和濾紙，將PVDF膜在甲醇中浸泡1-2分鐘，使其活化，然后放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15-30分鐘。濾紙也在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡備用。按照“濾紙-PVDF膜-凝膠-濾紙”的順序組裝轉(zhuǎn)膜裝置，注意避免氣泡的產(chǎn)生。將轉(zhuǎn)膜裝置放入轉(zhuǎn)膜槽中，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液，在冰浴條件下，以250mA的電流轉(zhuǎn)膜1-2小時(shí)，使蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜取出，用TBST緩沖液洗滌3次，每次5分鐘。將PVDF膜放入封閉液（5%脫脂奶粉TBST溶液）中，室溫封閉1-2小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，傾去封閉液，不洗，加入相應(yīng)的一抗（兔抗人Bcl-2抗體、兔抗人Bcl-xL抗體、兔抗人Bax抗體、兔抗人Bak抗體，均為1:1000稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。第二天，將PVDF膜從4℃冰箱中取出，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1:5000稀釋?zhuān)?，室溫孵?-2小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘。使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，將顯色液A和顯色液B按1:1的比例混合后，滴加在PVDF膜上，孵育1-2分鐘，然后將PVDF膜放入凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行曝光和拍照。使用圖像分析軟件（如ImageJ）對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在對(duì)照組中，白血病細(xì)胞株中Bcl-2和Bcl-xL等抗凋亡蛋白的表達(dá)水平較高，而B(niǎo)ax和Bak等促凋亡蛋白的表達(dá)水平較低。以HL-60細(xì)胞株為例，Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1.56±0.25，Bcl-xL蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1.38±0.20，Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.56±0.10，Bak蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.48±0.08。加入mTOR抑制劑雷帕霉素后，Bcl-2和Bcl-xL等抗凋亡蛋白的表達(dá)水平顯著降低。Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量降至0.78±0.15，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；Bcl-xL蛋白的相對(duì)表達(dá)量降至0.65±0.12，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與此同時(shí)，Bax和Bak等促凋亡蛋白的表達(dá)水平顯著升高。Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高至1.25±0.20，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；Bak蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高至1.10±0.15，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在其他白血病細(xì)胞株（NALM-6、K562、MEC-1）中也觀察到了類(lèi)似的結(jié)果。相反，加入mTOR激活劑MHY1485后，Bcl-2和Bcl-xL等抗凋亡蛋白的表達(dá)水平顯著升高，而B(niǎo)ax和Bak等促凋亡蛋白的表達(dá)水平顯著降低。在HL-60細(xì)胞株中，Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高至2.56±0.35，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；Bcl-xL蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高至2.20±0.30，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量降至0.30±0.06，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；Bak蛋白的相對(duì)表達(dá)量降至0.25±0.05，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這些結(jié)果表明，mTOR通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2家