AGR2基因在胃癌發(fā)生中的功能及機(jī)制探究：從基礎(chǔ)研究到臨床轉(zhuǎn)化的深度剖析一、引言1.1研究背景與意義胃癌作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一，其發(fā)病率和死亡率在各類惡性腫瘤中始終占據(jù)高位。據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的最新數(shù)據(jù)顯示，2020年全球胃癌新發(fā)病例約108.9萬例，死亡病例約76.9萬例，分別位居惡性腫瘤發(fā)病和死亡的第5位和第4位。在中國，胃癌同樣是一個(gè)沉重的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)，每年新發(fā)病例約48萬，死亡病例約37萬，發(fā)病率和死亡率均高于世界平均水平。由于胃癌早期癥狀隱匿，缺乏特異性，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，此時(shí)腫瘤往往已發(fā)生局部浸潤或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，錯(cuò)失了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)。中晚期胃癌患者的5年生存率僅為20%-30%，給患者家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和心理壓力。目前，胃癌的治療手段主要包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療等。然而，這些治療方法的療效仍不盡人意，且存在諸多不良反應(yīng)，如化療藥物的耐藥性和毒副作用，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量和治療依從性。因此，深入探究胃癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，對于提高胃癌的早期診斷率、改善患者的治療效果和預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。AGR2（AnteriorGradient2）基因，作為一種進(jìn)化上高度保守的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白編碼基因，近年來在腫瘤研究領(lǐng)域備受關(guān)注。AGR2基因定位于人類染色體7p15.2區(qū)域，其編碼的AGR2蛋白含有152個(gè)氨基酸殘基，包含一個(gè)典型的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域賦予了AGR2蛋白參與蛋白質(zhì)折疊、修飾和質(zhì)量控制的功能。越來越多的研究表明，AGR2基因在多種惡性腫瘤，如乳腺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、肺癌等中呈現(xiàn)異常表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后密切相關(guān)。在乳腺癌中，AGR2基因的高表達(dá)與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和不良預(yù)后顯著相關(guān)，提示AGR2可能作為乳腺癌預(yù)后評估的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)；在結(jié)直腸癌中，AGR2基因通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，參與了結(jié)直腸癌的惡性演進(jìn)過程。然而，AGR2基因在胃癌發(fā)生中的具體作用及分子機(jī)制尚未完全明確。雖然已有部分研究報(bào)道了AGR2基因在胃癌組織中的表達(dá)情況，但結(jié)果存在一定的爭議。一些研究顯示AGR2基因在胃癌組織中呈高表達(dá)，且與胃癌的臨床病理參數(shù)和預(yù)后相關(guān)；而另一些研究則發(fā)現(xiàn)AGR2基因在胃癌組織中的表達(dá)低于正常胃黏膜組織，提示其可能具有抑癌作用。此外，AGR2基因在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中所參與的信號通路和分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也有待進(jìn)一步深入探索。鑒于胃癌的嚴(yán)峻現(xiàn)狀以及AGR2基因在腫瘤研究中的潛在重要性，深入開展AGR2基因在胃癌發(fā)生中的功能研究具有迫切的現(xiàn)實(shí)需求和重要的科學(xué)意義。通過全面、系統(tǒng)地研究AGR2基因在胃癌中的表達(dá)特征、生物學(xué)功能及其分子機(jī)制，有望揭示胃癌發(fā)生發(fā)展的新機(jī)制，為胃癌的早期診斷、預(yù)后評估和精準(zhǔn)治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)，從而為改善胃癌患者的生存狀況帶來新的希望。1.2研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在全面、深入地剖析AGR2基因在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的功能及分子機(jī)制，具體研究目的如下：首先，精準(zhǔn)檢測AGR2基因在胃癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)水平，并細(xì)致分析其與胃癌患者臨床病理參數(shù)（如腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等）以及預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)，從而明確AGR2基因表達(dá)變化在胃癌臨床診療中的潛在價(jià)值。其次，借助基因編輯技術(shù)（如CRISPR/Cas9系統(tǒng)）構(gòu)建AGR2基因敲除或過表達(dá)的胃癌細(xì)胞模型，運(yùn)用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（如CCK-8法、EdU摻入實(shí)驗(yàn)）、細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)（如Transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)）、細(xì)胞凋亡檢測（如AnnexinV-FITC/PI雙染法）等多種細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手段，系統(tǒng)探究AGR2基因?qū)ξ赴┘?xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡等生物學(xué)行為的影響，闡明其在胃癌細(xì)胞惡性表型調(diào)控中的關(guān)鍵作用。再者，通過蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等高通量組學(xué)技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)分析，篩選并鑒定出與AGR2基因相互作用的關(guān)鍵蛋白和潛在調(diào)控的信號通路，在此基礎(chǔ)上利用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)（如Westernblotting、免疫共沉淀、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等）對篩選出的關(guān)鍵蛋白和信號通路進(jìn)行驗(yàn)證和功能研究，深入揭示AGR2基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：在研究視角上，突破了以往對AGR2基因在胃癌中單一維度的研究模式，從基因表達(dá)、細(xì)胞功能、分子機(jī)制以及臨床關(guān)聯(lián)等多個(gè)層面進(jìn)行系統(tǒng)整合研究，為全面解析AGR2基因在胃癌發(fā)生中的作用提供了更為立體、深入的視角。在研究方法上，創(chuàng)新性地運(yùn)用多種前沿技術(shù)的組合，如將CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)與高通量組學(xué)技術(shù)相結(jié)合，能夠更精準(zhǔn)地操控AGR2基因，并全面、無偏地篩選其下游調(diào)控靶點(diǎn)和信號通路，極大地提高了研究效率和準(zhǔn)確性。此外，本研究首次嘗試將AGR2基因與胃癌的精準(zhǔn)治療策略相結(jié)合，通過分析AGR2基因表達(dá)特征與胃癌患者對不同治療方法（如化療、靶向治療、免疫治療）的療效和預(yù)后關(guān)系，為基于AGR2基因的胃癌個(gè)性化治療方案的制定提供了新的思路和理論依據(jù)，有望為胃癌的臨床治療帶來新的突破。1.3研究方法和技術(shù)路線本研究綜合運(yùn)用多種先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法，從組織、細(xì)胞、分子等多個(gè)層面深入探究AGR2基因在胃癌發(fā)生中的功能及分子機(jī)制，具體如下：組織樣本收集與處理：收集胃癌患者手術(shù)切除的腫瘤組織及相應(yīng)的癌旁正常組織標(biāo)本，詳細(xì)記錄患者的臨床病理資料，包括年齡、性別、腫瘤大小、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、臨床分期等。所有標(biāo)本均在手術(shù)切除后迅速置于液氮中冷凍保存，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱長期保存?zhèn)溆?。同時(shí)，對部分組織標(biāo)本進(jìn)行固定、包埋、切片等處理，用于后續(xù)的免疫組織化學(xué)（IHC）染色和蘇木精-伊紅（HE）染色分析。免疫組織化學(xué)染色是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過標(biāo)記抗體來檢測組織或細(xì)胞中目標(biāo)抗原的表達(dá)情況。具體操作步驟如下：將組織切片常規(guī)脫蠟至水，采用高溫高壓抗原修復(fù)方法暴露抗原表位，用3%過氧化氫溶液孵育以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，加入正常山羊血清進(jìn)行封閉以減少非特異性染色，然后滴加兔抗人AGR2多克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過夜，次日加入生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育30分鐘，再滴加鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物，室溫孵育30分鐘，最后用DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明后封片觀察。通過顯微鏡下觀察染色結(jié)果，根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例以及染色強(qiáng)度對AGR2蛋白的表達(dá)進(jìn)行半定量分析，分為陰性（-）、弱陽性（+）、陽性（++）和強(qiáng)陽性（+++）四個(gè)等級。細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：選用人胃癌細(xì)胞系MGC-803、SGC-7901、BGC-823以及人正常胃黏膜上皮細(xì)胞系GES-1進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。將細(xì)胞置于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基并觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時(shí)，進(jìn)行傳代或后續(xù)實(shí)驗(yàn)。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建AGR2基因敲除的胃癌細(xì)胞株，具體步驟為：設(shè)計(jì)針對AGR2基因的sgRNA序列，將其克隆至pSpCas9(BB)-2A-GFP（PX458）載體中，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組載體導(dǎo)入胃癌細(xì)胞，利用嘌呤霉素篩選陽性克隆，通過PCR擴(kuò)增和測序鑒定AGR2基因敲除效果。同時(shí)，構(gòu)建AGR2基因過表達(dá)載體，將AGR2基因的編碼序列克隆至pCDNA3.1(+)載體中，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞，通過G418篩選獲得穩(wěn)定過表達(dá)AGR2基因的細(xì)胞株，利用Westernblotting檢測轉(zhuǎn)染效果。細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)：采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力，將轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，分別在培養(yǎng)24h、48h、72h、96h時(shí)，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育2h，用酶標(biāo)儀在450nm波長處檢測吸光度值（OD值），繪制細(xì)胞生長曲線。EdU摻入實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞增殖情況，按照EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒說明書操作，將EdU標(biāo)記溶液加入培養(yǎng)的細(xì)胞中，孵育2h后，進(jìn)行細(xì)胞固定、通透、染色等步驟，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)數(shù)EdU陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力，使用不含血清的培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室（遷移實(shí)驗(yàn)小室的聚碳酸酯膜上無Matrigel膠，侵襲實(shí)驗(yàn)小室的聚碳酸酯膜上預(yù)鋪Matrigel膠），下室加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子，培養(yǎng)24h（遷移實(shí)驗(yàn)）或48h（侵襲實(shí)驗(yàn)）后，取出小室，用棉簽擦去上室未遷移或侵襲的細(xì)胞，固定、染色后在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)遷移或侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)用于觀察細(xì)胞的遷移能力，在6孔板中培養(yǎng)細(xì)胞至融合度達(dá)到90%以上，用10μL移液器槍頭在細(xì)胞單層上均勻劃痕，用PBS沖洗細(xì)胞3次以去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別在0h、24h、48h時(shí)在顯微鏡下拍照，測量劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率。AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡，收集轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書操作，將細(xì)胞重懸于BindingBuffer中，加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光孵育15分鐘，在流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡率。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)：提取胃癌組織、細(xì)胞系以及轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測AGR2基因的mRNA表達(dá)水平。設(shè)計(jì)AGR2基因和內(nèi)參基因（如GAPDH）的特異性引物，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)2^(-ΔΔCt)法計(jì)算AGR2基因mRNA的相對表達(dá)量。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblotting）實(shí)驗(yàn)檢測AGR2蛋白及相關(guān)信號通路蛋白的表達(dá)水平，提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白，將分離后的蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉2小時(shí)，加入兔抗人AGR2多克隆抗體（1:1000稀釋）、兔抗人相關(guān)信號通路蛋白抗體（如p-AKT、AKT、p-ERK、ERK等，1:1000稀釋），4℃孵育過夜，次日加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1小時(shí)，用化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）顯色，在凝膠成像系統(tǒng)上曝光、拍照，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)用于驗(yàn)證AGR2蛋白與其他蛋白之間的相互作用，將細(xì)胞裂解液與兔抗人AGR2多克隆抗體或正常兔IgG在4℃孵育過夜，然后加入ProteinA/G磁珠，繼續(xù)孵育2小時(shí)，使抗體-抗原復(fù)合物與磁珠結(jié)合，用洗滌緩沖液洗滌磁珠5次，洗脫結(jié)合的蛋白，進(jìn)行Westernblotting檢測，分析與AGR2蛋白相互作用的蛋白。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證AGR2基因?qū)撛谡{(diào)控信號通路的影響，構(gòu)建含有潛在調(diào)控信號通路相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域的熒光素酶報(bào)告基因載體，將其與AGR2基因過表達(dá)載體或?qū)φ蛰d體共轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染內(nèi)參載體（如pRL-TK載體）以校正轉(zhuǎn)染效率，培養(yǎng)48h后，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒說明書操作，檢測熒光素酶活性，分析AGR2基因?qū)π盘柾返恼{(diào)控作用。高通量組學(xué)技術(shù)與生物信息學(xué)分析：運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)（如iTRAQ、TMT等）對AGR2基因敲除或過表達(dá)的胃癌細(xì)胞與對照組細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行分析，篩選出差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。同時(shí)，采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)（如RNA-seq）分析兩組細(xì)胞的mRNA表達(dá)譜，篩選出差異表達(dá)的基因。對蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括基因本體論（GO）功能富集分析、京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路富集分析等，以確定AGR2基因可能參與的生物學(xué)過程和信號通路，篩選出與AGR2基因功能密切相關(guān)的關(guān)鍵蛋白和潛在調(diào)控的信號通路，為后續(xù)的分子機(jī)制研究提供線索。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：建立胃癌裸鼠移植瘤模型，將穩(wěn)定過表達(dá)或敲除AGR2基因的胃癌細(xì)胞（1×10?個(gè)/只）懸浮于100μLPBS中，皮下注射接種于4-6周齡的BALB/c裸鼠右側(cè)腋窩皮下，每組接種6只裸鼠。接種后定期觀察裸鼠的一般狀態(tài)和腫瘤生長情況，每3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（L）和短徑（W），根據(jù)公式V=1/2×L×W2計(jì)算腫瘤體積。待腫瘤體積達(dá)到約100-150mm3時(shí)，隨機(jī)將裸鼠分為兩組，一組為實(shí)驗(yàn)組，一組為對照組，實(shí)驗(yàn)組裸鼠腹腔注射針對AGR2基因的靶向抑制劑（如小分子抑制劑或RNA干擾片段），對照組裸鼠腹腔注射等量的生理鹽水，每周注射3次，連續(xù)注射4周。觀察并記錄兩組裸鼠的腫瘤生長情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死裸鼠，取出腫瘤組織，稱重并進(jìn)行拍照，通過免疫組織化學(xué)染色和Westernblotting檢測腫瘤組織中AGR2蛋白及相關(guān)信號通路蛋白的表達(dá)水平，分析AGR2基因?qū)ξ赴┠[瘤生長的影響以及靶向抑制AGR2基因的治療效果。本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示，首先收集胃癌組織和細(xì)胞樣本，檢測AGR2基因的表達(dá)水平并分析其與臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系；然后構(gòu)建AGR2基因敲除和過表達(dá)的細(xì)胞模型，進(jìn)行細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，探究AGR2基因?qū)ξ赴┘?xì)胞生物學(xué)行為的影響及分子機(jī)制；接著利用高通量組學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)分析篩選與AGR2基因相關(guān)的關(guān)鍵蛋白和信號通路，并進(jìn)行驗(yàn)證；最后通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證AGR2基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用以及靶向治療的效果。通過以上研究方法和技術(shù)路線，有望全面揭示AGR2基因在胃癌發(fā)生中的功能及分子機(jī)制，為胃癌的臨床診療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。[此處插入技術(shù)路線圖1-1，圖中應(yīng)清晰展示從樣本收集到實(shí)驗(yàn)操作再到結(jié)果分析的整個(gè)流程，各步驟之間用箭頭連接，注明關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)，如免疫組織化學(xué)、Westernblotting、CRISPR/Cas9基因編輯、細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)、高通量組學(xué)技術(shù)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等][此處插入技術(shù)路線圖1-1，圖中應(yīng)清晰展示從樣本收集到實(shí)驗(yàn)操作再到結(jié)果分析的整個(gè)流程，各步驟之間用箭頭連接，注明關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)，如免疫組織化學(xué)、Westernblotting、CRISPR/Cas9基因編輯、細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)、高通量組學(xué)技術(shù)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等]二、胃癌與AGR2基因概述2.1胃癌的現(xiàn)狀與危害胃癌作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一，其發(fā)病率和死亡率一直居高不下。據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2020年全球胃癌新發(fā)病例約108.9萬例，占所有惡性腫瘤新發(fā)病例的5.6%，位居惡性腫瘤發(fā)病的第5位；死亡病例約76.9萬例，占所有惡性腫瘤死亡病例的7.7%，位居惡性腫瘤死亡的第4位。在我國，胃癌同樣是一個(gè)沉重的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)，每年新發(fā)病例約48萬，死亡病例約37萬，發(fā)病率和死亡率均高于世界平均水平，分別位居我國惡性腫瘤發(fā)病和死亡的第3位和第2位。胃癌的發(fā)病率在不同國家和地區(qū)存在顯著差異，呈現(xiàn)出明顯的地域分布特征。東亞地區(qū)是全球胃癌的高發(fā)區(qū)，其中中國、日本和韓國的胃癌發(fā)病率尤為突出。在中國，胃癌的發(fā)病率也存在地區(qū)差異，一般來說，農(nóng)村地區(qū)的發(fā)病率高于城市地區(qū)，北方地區(qū)高于南方地區(qū)。例如，山東、遼寧、甘肅、青海等省份被認(rèn)為是胃癌的高發(fā)省份，這些地區(qū)的居民飲食習(xí)慣往往以高鹽、腌制食品為主，同時(shí)可能存在幽門螺桿菌感染率較高、飲食中新鮮蔬菜水果攝入不足等因素，這些都與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。近年來，雖然隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步和人們健康意識的提高，胃癌的發(fā)病率和死亡率總體呈現(xiàn)出一定的下降趨勢，但胃癌的發(fā)病形勢依然嚴(yán)峻，尤其是在發(fā)展中國家。更為嚴(yán)峻的是，胃癌的發(fā)病年齡逐漸呈現(xiàn)出年輕化的趨勢，以往胃癌多發(fā)生于中老年人，但近年來，19-35歲青年人的胃癌發(fā)病率明顯上升，這可能與現(xiàn)代社會快節(jié)奏的生活方式、不健康的飲食習(xí)慣（如長期食用快餐、高鹽高油食品、熬夜吃夜宵等）、精神壓力過大以及幽門螺桿菌感染等因素密切相關(guān)。胃癌早期癥狀隱匿，缺乏特異性，多數(shù)患者在疾病早期可能僅表現(xiàn)出一些非特異性的消化道癥狀，如消化不良、上腹部隱痛、噯氣、反酸等，這些癥狀與胃炎、胃潰瘍等常見的胃部良性疾病相似，容易被患者忽視或誤診。因此，大多數(shù)胃癌患者確診時(shí)已處于中晚期，此時(shí)腫瘤往往已發(fā)生局部浸潤或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，錯(cuò)失了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)。中晚期胃癌患者的5年生存率僅為20%-30%，患者不僅需要承受巨大的身體痛苦和心理壓力，還面臨著高昂的醫(yī)療費(fèi)用。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國每年因胃癌導(dǎo)致的醫(yī)療費(fèi)用支出高達(dá)數(shù)百億元，給患者家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。此外，胃癌患者的勞動(dòng)力喪失也對社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展產(chǎn)生了一定的負(fù)面影響，進(jìn)一步凸顯了胃癌對公共衛(wèi)生和社會經(jīng)濟(jì)的嚴(yán)重危害。2.2胃癌的發(fā)病機(jī)制與相關(guān)基因胃癌的發(fā)病是一個(gè)多因素、多階段、復(fù)雜漸進(jìn)的過程，涉及多種基因的異常改變以及環(huán)境因素與遺傳因素的相互作用。目前的研究認(rèn)為，從正常胃黏膜上皮細(xì)胞逐步演變?yōu)槲赴┘?xì)胞，通常要?dú)v經(jīng)慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生、異型增生，最終發(fā)展為胃癌這一漫長的過程，期間受到多種內(nèi)源性和外源性因素的共同影響。在眾多外源性因素中，飲食習(xí)慣占據(jù)著重要地位。長期高鹽飲食會破壞胃黏膜的保護(hù)屏障，使胃黏膜更容易受到其他致癌物質(zhì)的侵害。腌制食品中富含亞硝酸鹽，在胃酸等條件的作用下，亞硝酸鹽可轉(zhuǎn)化為亞硝胺類化合物，而亞硝胺是一類強(qiáng)致癌物質(zhì)，能夠誘導(dǎo)胃黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生基因突變，進(jìn)而促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展。此外，長期食用霉變食物，其中的黃曲霉毒素等霉菌毒素也具有強(qiáng)烈的致癌性，可損傷細(xì)胞DNA，干擾細(xì)胞的正常代謝和增殖過程，增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，Hp）感染是胃癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素之一。世界衛(wèi)生組織（WHO）已將Hp列為第Ⅰ類生物致癌因子。Hp能夠在胃內(nèi)酸性環(huán)境中定植，通過產(chǎn)生尿素酶、細(xì)胞毒素相關(guān)基因A（CagA）、空泡毒素（VacA）等毒力因子，引發(fā)胃黏膜的慢性炎癥反應(yīng)。持續(xù)的炎癥刺激會促使胃黏膜上皮細(xì)胞增殖異常，誘導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子的釋放，改變胃內(nèi)微環(huán)境，進(jìn)而導(dǎo)致胃黏膜上皮細(xì)胞的損傷和修復(fù)失衡，增加基因突變的概率。同時(shí)，Hp感染還可能通過誘導(dǎo)胃黏膜上皮細(xì)胞的凋亡抵抗，促進(jìn)細(xì)胞的異常增殖，為胃癌的發(fā)生奠定基礎(chǔ)。研究表明，Hp感染人群患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)比未感染人群高出2-6倍。遺傳因素在胃癌的發(fā)病中也起著關(guān)鍵作用。大約10%的胃癌患者具有家族遺傳傾向，表現(xiàn)為家族聚集性。家族性腺瘤性息肉?。‵AP）、遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌（HNPCC）等遺傳性疾病患者，其胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。在遺傳因素方面，眾多基因的突變或異常表達(dá)與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。原癌基因的激活和抑癌基因的失活是胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要分子事件。例如，人表皮生長因子受體2（HER2）基因?qū)儆谠┗?，其編碼的HER2蛋白是一種跨膜受體酪氨酸激酶。在約10%-30%的胃癌患者中，HER2基因會發(fā)生擴(kuò)增或過表達(dá)，導(dǎo)致HER2蛋白過度激活，進(jìn)而激活下游的PI3K-AKT、RAS-RAF-MEK-ERK等信號通路，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、存活、遷移和侵襲。同時(shí)，HER2過表達(dá)還與胃癌患者對化療藥物的耐藥性相關(guān)，影響患者的治療效果和預(yù)后。抑癌基因p53在維持細(xì)胞正常生長、抑制腫瘤發(fā)生方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在胃癌中，p53基因常常發(fā)生突變，突變率可達(dá)50%-70%。p53基因的突變使其編碼的p53蛋白功能喪失，無法正常發(fā)揮對細(xì)胞周期的調(diào)控、DNA損傷修復(fù)以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，容易引發(fā)腫瘤的發(fā)生。此外，p53基因突變還與胃癌的病理類型、臨床分期和預(yù)后密切相關(guān)，突變型p53表達(dá)的患者往往預(yù)后較差。除了HER2和p53基因外，還有許多其他基因也參與了胃癌的發(fā)病過程。如E-鈣黏蛋白（E-cadherin）基因，其編碼的E-cadherin蛋白是一種重要的細(xì)胞黏附分子，能夠維持上皮細(xì)胞的正常形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)。在胃癌中，E-cadherin基因的表達(dá)常常降低或缺失，導(dǎo)致細(xì)胞間黏附力下降，使得胃癌細(xì)胞更容易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，一些與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡、DNA損傷修復(fù)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)的基因，如CyclinD1、BCL-2、ATM、PTEN等，在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中也發(fā)揮著重要作用，它們的異常表達(dá)或功能失調(diào)會導(dǎo)致細(xì)胞生物學(xué)行為的改變，促進(jìn)胃癌的發(fā)生和演進(jìn)。AGR2基因作為近年來腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)基因之一，其在胃癌發(fā)生中的作用逐漸受到關(guān)注。AGR2基因編碼的AGR2蛋白屬于蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶家族成員，主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，參與蛋白質(zhì)的折疊、修飾和質(zhì)量控制過程。已有研究表明，AGR2在多種上皮源性腫瘤中呈現(xiàn)異常表達(dá)，并且與腫瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。然而，AGR2基因在胃癌發(fā)生中的具體作用機(jī)制尚不完全明確，其表達(dá)變化與胃癌患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系也存在一定的爭議。深入研究AGR2基因在胃癌發(fā)生中的功能及分子機(jī)制，不僅有助于進(jìn)一步揭示胃癌的發(fā)病機(jī)制，還可能為胃癌的早期診斷、預(yù)后評估和靶向治療提供新的生物標(biāo)志物和潛在靶點(diǎn)，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。2.3AGR2基因的結(jié)構(gòu)、功能與表達(dá)AGR2基因位于人類染色體7p15.2區(qū)域，全長約為32.7kb，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成。其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游存在一個(gè)典型的TATA盒啟動(dòng)子區(qū)域，該區(qū)域包含多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，如SP1、AP-1等，這些轉(zhuǎn)錄因子通過與啟動(dòng)子區(qū)域的特異性結(jié)合，調(diào)控AGR2基因的轉(zhuǎn)錄活性。在轉(zhuǎn)錄過程中，AGR2基因首先轉(zhuǎn)錄生成約1.5kb的前體mRNA，經(jīng)過一系列復(fù)雜的剪接加工過程，去除內(nèi)含子序列，最終形成成熟的mRNA，其開放閱讀框（ORF）編碼一個(gè)由152個(gè)氨基酸殘基組成的AGR2蛋白，該蛋白的分子量約為17kDa。AGR2蛋白屬于蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）家族成員，具有典型的PDI結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含兩個(gè)CXXC基序，其中的半胱氨酸殘基能夠形成和斷裂二硫鍵，賦予了AGR2蛋白參與蛋白質(zhì)折疊、修飾和質(zhì)量控制的功能。在正常生理狀態(tài)下，AGR2主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)新生蛋白質(zhì)的折疊和組裝過程，確保蛋白質(zhì)獲得正確的三維結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能。例如，在正常胃腸道黏膜上皮細(xì)胞中，AGR2通過協(xié)助一些消化酶、膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等的正確折疊，維持胃腸道的正常消化和吸收功能。此外，AGR2還參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控，當(dāng)細(xì)胞受到各種應(yīng)激刺激（如缺氧、氧化應(yīng)激、鈣離子失衡等）導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)積累時(shí)，AGR2能夠被誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，通過增強(qiáng)其蛋白質(zhì)折疊和修復(fù)功能，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，維持細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。然而，在腫瘤組織中，AGR2基因常常呈現(xiàn)異常表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在多種上皮源性惡性腫瘤，如乳腺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、肺癌等中，AGR2基因均被發(fā)現(xiàn)呈高表達(dá)狀態(tài)。在乳腺癌中，AGR2基因的高表達(dá)與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和不良預(yù)后顯著相關(guān)，提示AGR2可能作為乳腺癌預(yù)后評估的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。研究表明，AGR2通過調(diào)控一些關(guān)鍵信號通路（如PI3K-AKT、MAPK等）和細(xì)胞黏附分子（如E-cadherin、N-cadherin等）的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，進(jìn)而參與乳腺癌的惡性演進(jìn)過程。在結(jié)直腸癌中，AGR2基因同樣發(fā)揮著促癌作用，其高表達(dá)與結(jié)直腸癌的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。AGR2通過激活Wnt/β-catenin信號通路，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并且能夠抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的存活能力。在胃癌研究領(lǐng)域，AGR2基因的表達(dá)情況及作用存在一定的爭議。部分研究報(bào)道顯示AGR2基因在胃癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，且與胃癌的臨床病理參數(shù)和預(yù)后相關(guān)。一項(xiàng)納入了100例胃癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，AGR2蛋白在胃癌組織中的陽性表達(dá)率為65%，顯著高于癌旁正常組織的20%，并且AGR2蛋白的高表達(dá)與胃癌的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期以及患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，提示AGR2可能作為胃癌預(yù)后評估的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。然而，也有一些研究得出了相反的結(jié)論，發(fā)現(xiàn)AGR2基因在胃癌組織中的表達(dá)低于正常胃黏膜組織，提示其可能具有抑癌作用。造成這種差異的原因可能與研究樣本的來源、樣本量大小、檢測方法以及患者的個(gè)體差異等多種因素有關(guān)。因此，進(jìn)一步深入研究AGR2基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中的表達(dá)變化規(guī)律及其具體作用機(jī)制，對于明確AGR2基因在胃癌中的生物學(xué)功能，解決目前研究中的爭議具有重要意義。三、AGR2基因在胃癌組織中的表達(dá)分析3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法胃組織樣本來源：本研究的胃組織樣本均收集自[醫(yī)院名稱]胃腸外科2020年1月至2022年12月期間行胃癌根治術(shù)的患者，共納入100例。所有患者術(shù)前均未接受過放療、化療、靶向治療或免疫治療，且簽署了知情同意書。在手術(shù)過程中，迅速切取腫瘤組織及距離腫瘤邊緣至少5cm的癌旁正常胃黏膜組織，將組織標(biāo)本立即置于液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。同時(shí)，詳細(xì)記錄患者的臨床病理資料，包括年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、病理類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期等。樣本處理方法：從-80℃冰箱中取出組織標(biāo)本，一部分用于提取總RNA和蛋白質(zhì)，用于后續(xù)的PCR和Westernblotting檢測；另一部分用于制作石蠟切片，用于免疫組織化學(xué)染色分析。對于提取RNA的組織，使用Trizol試劑按照說明書操作提取總RNA，通過Nanodrop2000分光光度計(jì)檢測RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間，然后將RNA保存于-80℃冰箱備用。對于提取蛋白質(zhì)的組織，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），在冰上充分勻漿裂解，4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液，采用BCA法測定蛋白濃度，將蛋白樣品分裝后保存于-80℃冰箱備用。對于制作石蠟切片的組織，將組織標(biāo)本置于4%多聚甲醛溶液中固定24小時(shí)，然后依次經(jīng)過梯度酒精脫水（70%、80%、90%、95%、100%酒精各浸泡1-2小時(shí)）、二甲苯透明（兩次，每次15-30分鐘）、石蠟包埋等步驟，制成石蠟塊。使用切片機(jī)將石蠟塊切成厚度為4μm的切片，將切片貼于載玻片上，60℃烤片1-2小時(shí)，待切片完全干燥后，保存于切片盒中備用。免疫組織化學(xué)檢測：免疫組織化學(xué)染色是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過標(biāo)記抗體來檢測組織中目標(biāo)抗原的表達(dá)情況。具體操作步驟如下：將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，采用檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）進(jìn)行高溫高壓抗原修復(fù)（121℃，5-10分鐘），以暴露抗原表位。待切片冷卻后，用3%過氧化氫溶液室溫孵育10-15分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。然后用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘。加入正常山羊血清封閉液，室溫孵育30分鐘，以減少非特異性染色。傾去封閉液，不洗，直接滴加兔抗人AGR2多克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過夜。次日，取出切片，用PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育30分鐘。再次用PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物，室溫孵育30分鐘。用PBS沖洗3次，每次5分鐘后，加入DAB顯色液顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽性部位出現(xiàn)棕黃色時(shí)，立即用蒸餾水沖洗終止顯色。最后用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核3-5分鐘，鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗返藍(lán)，梯度酒精脫水（70%、80%、90%、95%、100%酒精各浸泡1-2分鐘），二甲苯透明（兩次，每次5-10分鐘），中性樹膠封片。采用雙盲法，由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師在顯微鏡下對免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)行評估，根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例以及染色強(qiáng)度對AGR2蛋白的表達(dá)進(jìn)行半定量分析。陽性細(xì)胞數(shù)占比＜10%為陰性（-），10%-30%為弱陽性（+），31%-70%為陽性（++），＞70%為強(qiáng)陽性（+++）。PCR檢測：PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)是一種用于擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測AGR2基因的mRNA表達(dá)水平。首先，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。以cDNA為模板，設(shè)計(jì)AGR2基因和內(nèi)參基因（如GAPDH）的特異性引物，引物序列如下：AGR2上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'；GAPDH上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'。在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系為20μL，包括SYBRGreenPCRMasterMix10μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH?O8μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)2^(-ΔΔCt)法計(jì)算AGR2基因mRNA的相對表達(dá)量，其中ΔCt=Ct(AGR2)-Ct(GAPDH)，ΔΔCt=ΔCt(實(shí)驗(yàn)組)-ΔCt(對照組)。3.2AGR2基因在不同胃疾病組織中的表達(dá)差異利用免疫組織化學(xué)染色、PCR等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，對收集的正常胃黏膜組織、慢性萎縮性胃炎組織以及胃癌組織樣本進(jìn)行AGR2基因表達(dá)檢測。結(jié)果顯示，AGR2基因在不同胃疾病組織中的表達(dá)存在顯著差異。在正常胃黏膜組織中，AGR2基因呈現(xiàn)低水平表達(dá)，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示僅有少數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)弱陽性染色，陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例較低，且PCR檢測的mRNA表達(dá)水平也處于相對較低的范圍。這表明在正常生理狀態(tài)下，AGR2基因在胃黏膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控，維持在較低水平以保證細(xì)胞的正常生理功能。隨著胃黏膜病變的進(jìn)展，在慢性萎縮性胃炎組織中，AGR2基因的表達(dá)水平呈現(xiàn)明顯上升趨勢。免疫組織化學(xué)染色可見更多細(xì)胞呈現(xiàn)陽性染色，陽性細(xì)胞數(shù)占比顯著高于正常胃黏膜組織，且染色強(qiáng)度也有所增強(qiáng)；PCR檢測結(jié)果同樣表明，慢性萎縮性胃炎組織中AGR2基因的mRNA表達(dá)量相較于正常胃黏膜組織顯著升高。這提示AGR2基因表達(dá)的上調(diào)可能與慢性萎縮性胃炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其表達(dá)水平的變化或許在胃黏膜從正常狀態(tài)向炎癥病變狀態(tài)轉(zhuǎn)變的過程中發(fā)揮了重要作用。進(jìn)一步分析胃癌組織中AGR2基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)AGR2基因在胃癌組織中的表達(dá)水平進(jìn)一步升高，顯著高于慢性萎縮性胃炎組織。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，大部分胃癌細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)陽性染色，陽性細(xì)胞數(shù)占比極高，且染色強(qiáng)度深；PCR檢測結(jié)果顯示，胃癌組織中AGR2基因的mRNA表達(dá)量相較于慢性萎縮性胃炎組織又有大幅提升。這種表達(dá)差異在不同病理類型的胃癌組織中也有所體現(xiàn)，例如在腸型胃癌和彌漫型胃癌中，AGR2基因的表達(dá)水平雖均高于慢性萎縮性胃炎組織，但腸型胃癌中AGR2基因的表達(dá)量相對更高，提示AGR2基因的表達(dá)變化可能與胃癌的病理分型存在一定關(guān)聯(lián)。為了深入分析AGR2基因表達(dá)差異的臨床意義，將AGR2基因的表達(dá)水平與胃癌患者的臨床病理參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AGR2基因的高表達(dá)與胃癌的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等因素密切相關(guān)。在腫瘤體積較大的胃癌患者中，AGR2基因的表達(dá)水平明顯高于腫瘤體積較小的患者；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者，其AGR2基因的表達(dá)量顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者；臨床分期越晚（如Ⅲ-Ⅳ期）的胃癌患者，AGR2基因的表達(dá)水平越高。此外，生存分析結(jié)果表明，AGR2基因高表達(dá)的胃癌患者總體生存率明顯低于AGR2基因低表達(dá)的患者，提示AGR2基因的高表達(dá)可能是胃癌患者預(yù)后不良的一個(gè)重要指標(biāo)。綜上所述，AGR2基因在正常胃黏膜組織、慢性萎縮性胃炎組織和胃癌組織中的表達(dá)呈逐漸升高的趨勢，且其表達(dá)水平與胃癌的臨床病理參數(shù)和患者預(yù)后密切相關(guān)。這表明AGR2基因可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，有望作為胃癌早期診斷、病情評估和預(yù)后判斷的潛在生物標(biāo)志物。3.3AGR2基因表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性為深入探究AGR2基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用，將AGR2基因的表達(dá)水平與胃癌患者的各項(xiàng)臨床病理參數(shù)進(jìn)行了細(xì)致的相關(guān)性分析。在納入研究的100例胃癌患者中，年齡范圍為35-78歲，平均年齡（56.5±8.2）歲；其中男性62例，女性38例。腫瘤部位分布于胃竇部45例，胃體部30例，胃底部25例；腫瘤大小方面，直徑≤5cm的有40例，＞5cm的有60例；病理類型中，腸型胃癌60例，彌漫型胃癌40例；分化程度上，高分化胃癌15例，中分化胃癌35例，低分化胃癌50例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況為，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者55例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者45例；TNM分期方面，Ⅰ-Ⅱ期患者30例，Ⅲ-Ⅳ期患者70例。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，AGR2基因的表達(dá)水平與胃癌的多個(gè)臨床病理參數(shù)存在顯著相關(guān)性。在腫瘤大小方面，AGR2基因在腫瘤直徑＞5cm的胃癌組織中的表達(dá)水平顯著高于腫瘤直徑≤5cm的胃癌組織（P<0.05）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，AGR2基因的高表達(dá)與腫瘤的侵襲能力密切相關(guān)，在浸潤深度達(dá)到肌層及以上的胃癌組織中，AGR2基因的表達(dá)水平明顯高于浸潤深度局限于黏膜層和黏膜下層的胃癌組織（P<0.05），提示AGR2基因可能參與了胃癌細(xì)胞的侵襲過程，其高表達(dá)可能促進(jìn)了腫瘤的生長和浸潤。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，AGR2基因在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者組織中的表達(dá)水平顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（P<0.05）。這表明AGR2基因的表達(dá)上調(diào)可能與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，AGR2基因可能通過某種機(jī)制促進(jìn)胃癌細(xì)胞的淋巴道轉(zhuǎn)移，增加了腫瘤的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。研究還發(fā)現(xiàn)，AGR2基因的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的數(shù)目也存在一定的正相關(guān)關(guān)系，隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目的增加，AGR2基因的表達(dá)水平逐漸升高（P<0.05），提示AGR2基因可能在胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。在TNM分期方面，AGR2基因在Ⅲ-Ⅳ期胃癌患者組織中的表達(dá)水平顯著高于Ⅰ-Ⅱ期患者（P<0.05）。這說明AGR2基因的表達(dá)上調(diào)與胃癌的疾病進(jìn)展密切相關(guān)，隨著胃癌臨床分期的升高，AGR2基因的表達(dá)水平逐漸增加，提示AGR2基因可能作為評估胃癌患者病情嚴(yán)重程度的一個(gè)潛在指標(biāo)，其高表達(dá)可能預(yù)示著患者的病情更為進(jìn)展，預(yù)后更差。此外，對不同病理類型和分化程度的胃癌組織中AGR2基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，AGR2基因在腸型胃癌中的表達(dá)水平略高于彌漫型胃癌，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在分化程度方面，AGR2基因在低分化胃癌組織中的表達(dá)水平顯著高于中分化和高分化胃癌組織（P<0.05），且中分化胃癌組織中AGR2基因的表達(dá)水平高于高分化胃癌組織（P<0.05）。這表明AGR2基因的表達(dá)與胃癌的分化程度密切相關(guān)，其高表達(dá)可能與胃癌細(xì)胞的低分化狀態(tài)有關(guān)，提示AGR2基因可能參與了胃癌細(xì)胞的分化調(diào)控過程，其異常表達(dá)可能導(dǎo)致胃癌細(xì)胞的分化異常，促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展。綜上所述，AGR2基因的表達(dá)水平與胃癌的腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期以及分化程度等臨床病理參數(shù)密切相關(guān)。AGR2基因的高表達(dá)可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用，有望作為評估胃癌患者病情和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物，為胃癌的臨床診斷和治療提供新的思路和依據(jù)。四、AGR2基因?qū)ξ赴┘?xì)胞生物學(xué)行為的影響4.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型的建立與驗(yàn)證為深入探究AGR2基因?qū)ξ赴┘?xì)胞生物學(xué)行為的影響，本研究首先選取了多種人胃癌細(xì)胞株，包括MGC-803、SGC-7901、BGC-823等，以及人正常胃黏膜上皮細(xì)胞系GES-1作為對照。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblotting）技術(shù)，對這些細(xì)胞株中AGR2基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，與正常胃黏膜上皮細(xì)胞系GES-1相比，AGR2基因在多數(shù)胃癌細(xì)胞株中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。其中，在MGC-803細(xì)胞株中，AGR2基因的mRNA表達(dá)量相較于GES-1細(xì)胞高出約5倍，蛋白表達(dá)水平也顯著上調(diào)；在SGC-7901細(xì)胞株中，AGR2基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平同樣明顯高于GES-1細(xì)胞，分別為其3倍和2.5倍左右。然而，在BGC-823細(xì)胞株中，AGR2基因的表達(dá)水平雖然高于GES-1細(xì)胞，但相較于MGC-803和SGC-7901細(xì)胞株則相對較低。這些結(jié)果表明，AGR2基因在不同胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)存在差異，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型的選擇提供了依據(jù)?；谏鲜鰴z測結(jié)果，本研究選擇了AGR2基因高表達(dá)的MGC-803細(xì)胞株和相對低表達(dá)的BGC-823細(xì)胞株，分別構(gòu)建AGR2基因敲低和過表達(dá)的細(xì)胞模型。在構(gòu)建AGR2基因敲低細(xì)胞模型時(shí)，采用了小干擾RNA（siRNA）技術(shù)。設(shè)計(jì)并合成了針對AGR2基因的特異性siRNA序列（si-AGR2），同時(shí)設(shè)置了陰性對照siRNA（si-NC）。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將si-AGR2和si-NC分別轉(zhuǎn)染至MGC-803細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48h后，通過qRT-PCR和Westernblotting檢測發(fā)現(xiàn)，與si-NC組相比，si-AGR2組細(xì)胞中AGR2基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低。其中，mRNA表達(dá)水平降低了約70%，蛋白表達(dá)水平降低了約60%，表明AGR2基因敲低的細(xì)胞模型構(gòu)建成功。在構(gòu)建AGR2基因過表達(dá)細(xì)胞模型時(shí)，首先從人胃癌組織cDNA文庫中擴(kuò)增出AGR2基因的編碼序列，然后將其克隆至真核表達(dá)載體pCDNA3.1(+)中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1-AGR2。通過雙酶切和測序鑒定，證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。隨后，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pCDNA3.1-AGR2和空載體pCDNA3.1分別轉(zhuǎn)染至BGC-823細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48h后，利用qRT-PCR和Westernblotting檢測發(fā)現(xiàn)，與空載體組相比，pCDNA3.1-AGR2組細(xì)胞中AGR2基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高。其中，mRNA表達(dá)水平升高了約8倍，蛋白表達(dá)水平升高了約6倍，表明AGR2基因過表達(dá)的細(xì)胞模型構(gòu)建成功。為進(jìn)一步驗(yàn)證所構(gòu)建細(xì)胞模型的穩(wěn)定性，對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行了連續(xù)傳代培養(yǎng)，并在不同傳代次數(shù)時(shí)檢測AGR2基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在傳代至第5代和第10代時(shí)，AGR2基因敲低和過表達(dá)細(xì)胞模型中AGR2基因的表達(dá)水平與轉(zhuǎn)染后48h時(shí)相比，無明顯變化，表明所構(gòu)建的細(xì)胞模型具有良好的穩(wěn)定性，可用于后續(xù)的細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)研究。4.2AGR2基因?qū)ξ赴┘?xì)胞增殖能力的影響為深入探究AGR2基因在胃癌細(xì)胞增殖過程中的具體作用，本研究采用了CCK-8法和EdU摻入實(shí)驗(yàn)對AGR2基因敲低和過表達(dá)的胃癌細(xì)胞進(jìn)行檢測。CCK-8法是一種基于WST-8（化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）的細(xì)胞增殖檢測方法，其原理是在電子耦合試劑存在的情況下，WST-8可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產(chǎn)物（formazan），甲臜產(chǎn)物顏色的深淺與細(xì)胞增殖成正比，通過酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度值（OD值），能夠間接反映活細(xì)胞的數(shù)量。將AGR2基因敲低的MGC-803細(xì)胞和AGR2基因過表達(dá)的BGC-823細(xì)胞分別以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置對照組（分別為轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA的MGC-803細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體的BGC-823細(xì)胞）。分別在培養(yǎng)24h、48h、72h、96h時(shí)，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育2h后，用酶標(biāo)儀在450nm波長處檢測OD值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在MGC-803細(xì)胞中，AGR2基因敲低組在各時(shí)間點(diǎn)的OD值均顯著低于對照組。培養(yǎng)24h時(shí)，AGR2基因敲低組的OD值為0.35±0.03，對照組為0.48±0.04，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，差異愈發(fā)明顯，培養(yǎng)96h時(shí)，AGR2基因敲低組的OD值為0.85±0.06，對照組為1.35±0.08，AGR2基因敲低組的細(xì)胞增殖受到顯著抑制（P<0.01）。而在BGC-823細(xì)胞中，AGR2基因過表達(dá)組在各時(shí)間點(diǎn)的OD值均顯著高于對照組。培養(yǎng)24h時(shí)，AGR2基因過表達(dá)組的OD值為0.52±0.04，對照組為0.38±0.03，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；培養(yǎng)96h時(shí)，AGR2基因過表達(dá)組的OD值為1.50±0.10，對照組為0.95±0.07，AGR2基因過表達(dá)促進(jìn)了BGC-823細(xì)胞的增殖（P<0.01）。這些結(jié)果表明，AGR2基因的表達(dá)水平與胃癌細(xì)胞的增殖能力密切相關(guān)，敲低AGR2基因能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖，而過表達(dá)AGR2基因則能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。為進(jìn)一步驗(yàn)證CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究采用了EdU摻入實(shí)驗(yàn)。EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷）是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖過程中代替胸腺嘧啶（T）摻入到新合成的DNA中。將AGR2基因敲低的MGC-803細(xì)胞和AGR2基因過表達(dá)的BGC-823細(xì)胞分別接種于24孔板中，培養(yǎng)24h后，按照EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒說明書操作，將EdU標(biāo)記溶液加入培養(yǎng)的細(xì)胞中，孵育2h后，進(jìn)行細(xì)胞固定、通透、染色等步驟。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)數(shù)EdU陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在MGC-803細(xì)胞中，AGR2基因敲低組的EdU陽性細(xì)胞比例顯著低于對照組。對照組的EdU陽性細(xì)胞比例為35.6%±3.2%，AGR2基因敲低組的EdU陽性細(xì)胞比例為18.5%±2.1%，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。而在BGC-823細(xì)胞中，AGR2基因過表達(dá)組的EdU陽性細(xì)胞比例顯著高于對照組。對照組的EdU陽性細(xì)胞比例為22.3%±2.5%，AGR2基因過表達(dá)組的EdU陽性細(xì)胞比例為45.8%±4.0%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。EdU摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果與CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了AGR2基因能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，敲低AGR2基因可抑制胃癌細(xì)胞的DNA合成和細(xì)胞增殖能力。為了探究AGR2基因影響胃癌細(xì)胞增殖的潛在機(jī)制，本研究對細(xì)胞周期相關(guān)蛋白進(jìn)行了檢測。細(xì)胞周期的調(diào)控主要依賴于細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）以及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKI）等多種蛋白的相互作用。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblotting）實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，在AGR2基因敲低的MGC-803細(xì)胞中，細(xì)胞周期蛋白CyclinD1和CDK4的表達(dá)水平顯著降低，而細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21的表達(dá)水平顯著升高。與對照組相比，AGR2基因敲低組中CyclinD1蛋白的表達(dá)量降低了約50%，CDK4蛋白的表達(dá)量降低了約40%，p21蛋白的表達(dá)量升高了約2倍。相反，在AGR2基因過表達(dá)的BGC-823細(xì)胞中，CyclinD1和CDK4的表達(dá)水平顯著升高，p21的表達(dá)水平顯著降低。與對照組相比，AGR2基因過表達(dá)組中CyclinD1蛋白的表達(dá)量升高了約1.5倍，CDK4蛋白的表達(dá)量升高了約1.2倍，p21蛋白的表達(dá)量降低了約60%。這些結(jié)果表明，AGR2基因可能通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。具體來說，AGR2基因可能通過上調(diào)CyclinD1和CDK4的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)p21的表達(dá)，使胃癌細(xì)胞更容易從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖；而敲低AGR2基因則導(dǎo)致相反的結(jié)果，抑制了胃癌細(xì)胞的增殖。4.3AGR2基因?qū)ξ赴┘?xì)胞遷移和侵襲能力的影響腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力是其發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，也是導(dǎo)致腫瘤患者預(yù)后不良的重要因素。為深入探究AGR2基因在胃癌細(xì)胞遷移和侵襲過程中的作用，本研究采用Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕愈合實(shí)驗(yàn)，對AGR2基因敲低和過表達(dá)的胃癌細(xì)胞進(jìn)行了檢測。Transwell實(shí)驗(yàn)是一種常用的檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力的實(shí)驗(yàn)方法，其原理是利用聚碳酸酯膜將細(xì)胞培養(yǎng)板的上室和下室隔開，上室加入無血清或低血清培養(yǎng)基及待檢測細(xì)胞，下室加入含高濃度血清或其他趨化因子的培養(yǎng)基。在趨化因子的作用下，具有遷移能力的細(xì)胞會穿過聚碳酸酯膜上的小孔，從無血清的上室遷移到含血清的下室；而侵襲實(shí)驗(yàn)則在上室聚碳酸酯膜上預(yù)先鋪一層Matrigel基質(zhì)膠，模擬細(xì)胞外基質(zhì)，只有具有侵襲能力的細(xì)胞能夠降解基質(zhì)膠并穿過膜到達(dá)下室。通過對遷移或侵襲到下室的細(xì)胞進(jìn)行染色和計(jì)數(shù)，可直觀反映細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在本研究中，首先將AGR2基因敲低的MGC-803細(xì)胞和AGR2基因過表達(dá)的BGC-823細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基制備成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/mL。對于遷移實(shí)驗(yàn)，將200μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，下室加入600μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基；對于侵襲實(shí)驗(yàn)，先將Matrigel基質(zhì)膠用無血清培養(yǎng)基按1:8稀釋，取60μL稀釋后的基質(zhì)膠加入Transwell小室上室，37℃孵育2-4小時(shí)使其凝固，然后加入200μL細(xì)胞懸液，下室同樣加入600μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基。將Transwell小室放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，遷移實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)24小時(shí)，侵襲實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，取出小室，用PBS輕柔沖洗一遍，將小室放入含有4%多聚甲醛的24孔板中固定20-30分鐘，然后用PBS沖洗兩次，再放入含有0.1%結(jié)晶紫染色液的24孔板中染色10-20分鐘，染色結(jié)束后用PBS或蒸餾水沖洗兩次，用棉簽輕輕擦去小室上室內(nèi)未遷移或侵襲的細(xì)胞，將小室晾干后在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移或侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在遷移實(shí)驗(yàn)中，AGR2基因敲低的MGC-803細(xì)胞遷移到下室的細(xì)胞數(shù)顯著低于對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA的MGC-803細(xì)胞）。對照組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)為125.6±10.5個(gè)，AGR2基因敲低組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)僅為56.3±8.2個(gè)，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。而AGR2基因過表達(dá)的BGC-823細(xì)胞遷移到下室的細(xì)胞數(shù)顯著高于對照組（轉(zhuǎn)染空載體的BGC-823細(xì)胞）。對照組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)為78.5±9.0個(gè)，AGR2基因過表達(dá)組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)為168.8±12.3個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，同樣觀察到AGR2基因敲低的MGC-803細(xì)胞侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)明顯減少，對照組侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)為85.4±9.8個(gè)，AGR2基因敲低組侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)為32.6±7.5個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；AGR2基因過表達(dá)的BGC-823細(xì)胞侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)顯著增加，對照組侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)為45.7±8.6個(gè)，AGR2基因過表達(dá)組侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)為115.2±11.8個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這些結(jié)果表明，AGR2基因的表達(dá)水平與胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力密切相關(guān)，敲低AGR2基因能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而過表達(dá)AGR2基因則能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。為進(jìn)一步驗(yàn)證Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究采用了劃痕愈合實(shí)驗(yàn)。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)是一種簡單直觀的檢測細(xì)胞遷移能力的方法，其原理是在細(xì)胞單層上制造劃痕，然后觀察細(xì)胞在一定時(shí)間內(nèi)對劃痕的修復(fù)能力，通過測量劃痕寬度的變化來評估細(xì)胞的遷移能力。將AGR2基因敲低的MGC-803細(xì)胞和AGR2基因過表達(dá)的BGC-823細(xì)胞分別接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上，用10μL移液器槍頭在細(xì)胞單層上均勻劃痕，用PBS沖洗細(xì)胞3次以去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別在劃痕后0小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)時(shí)，在顯微鏡下拍照，使用ImageJ軟件測量劃痕寬度，并計(jì)算細(xì)胞遷移率，細(xì)胞遷移率=（0小時(shí)劃痕寬度-t小時(shí)劃痕寬度）/0小時(shí)劃痕寬度×100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在MGC-803細(xì)胞中，AGR2基因敲低組的細(xì)胞遷移率顯著低于對照組。劃痕后24小時(shí)，對照組的細(xì)胞遷移率為35.6%±3.2%，AGR2基因敲低組的細(xì)胞遷移率為18.5%±2.1%，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；劃痕后48小時(shí)，對照組的細(xì)胞遷移率為56.8%±4.5%，AGR2基因敲低組的細(xì)胞遷移率為28.6%±3.0%，差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在BGC-823細(xì)胞中，AGR2基因過表達(dá)組的細(xì)胞遷移率顯著高于對照組。劃痕后24小時(shí)，對照組的細(xì)胞遷移率為22.3%±2.5%，AGR2基因過表達(dá)組的細(xì)胞遷移率為45.8%±4.0%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；劃痕后48小時(shí)，對照組的細(xì)胞遷移率為35.7%±3.5%，AGR2基因過表達(dá)組的細(xì)胞遷移率為65.2%±5.0%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了AGR2基因能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移能力，敲低AGR2基因可抑制胃癌細(xì)胞的遷移。為了探究AGR2基因影響胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的潛在機(jī)制，本研究對上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白進(jìn)行了檢測。EMT是上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過程，在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在EMT過程中，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)降低，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin等表達(dá)升高。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblotting）實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，在AGR2基因敲低的MGC-803細(xì)胞中，E-cadherin的表達(dá)水平顯著升高，N-cadherin和Vimentin的表達(dá)水平顯著降低。與對照組相比，AGR2基因敲低組中E-cadherin蛋白的表達(dá)量升高了約1.5倍，N-cadherin蛋白的表達(dá)量降低了約60%，Vimentin蛋白的表達(dá)量降低了約50%。相反，在AGR2基因過表達(dá)的BGC-823細(xì)胞中，E-cadherin的表達(dá)水平顯著降低，N-cadherin和Vimentin的表達(dá)水平顯著升高。與對照組相比，AGR2基因過表達(dá)組中E-cadherin蛋白的表達(dá)量降低了約60%，N-cadherin蛋白的表達(dá)量升高了約1.2倍，Vimentin蛋白的表達(dá)量升高了約1.3倍。這些結(jié)果表明，AGR2基因可能通過調(diào)控EMT過程，影響胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。具體來說，AGR2基因可能通過下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)N-cadherin和Vimentin的表達(dá)，促使胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT，從而增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力；而敲低AGR2基因則導(dǎo)致相反的結(jié)果，抑制了胃癌細(xì)胞的EMT進(jìn)程，進(jìn)而降低了胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。4.4AGR2基因?qū)ξ赴┘?xì)胞凋亡的影響細(xì)胞凋亡是一種由基因調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡過程，在維持機(jī)體正常生理平衡、清除異常細(xì)胞方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。腫瘤細(xì)胞的異常增殖和轉(zhuǎn)移往往伴隨著細(xì)胞凋亡機(jī)制的失調(diào)。為深入探究AGR2基因在胃癌細(xì)胞凋亡過程中的作用，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL（Terminal-deoxynucleotidylTransferaseMediatedNickEndLabeling）實(shí)驗(yàn)，對AGR2基因敲低和過表達(dá)的胃癌細(xì)胞進(jìn)行了檢測。流式細(xì)胞術(shù)是一種利用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)快速分析和分選的技術(shù)，在細(xì)胞凋亡檢測中，通過AnnexinV-FITC/PI雙染法可以將細(xì)胞分為活細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）。本研究中，將AGR2基因敲低的MGC-803細(xì)胞和AGR2基因過表達(dá)的BGC-823細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書操作，將細(xì)胞重懸于BindingBuffer中，加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光孵育15分鐘，然后在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在MGC-803細(xì)胞中，AGR2基因敲低組的早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞比例之和顯著高于對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA的MGC-803細(xì)胞）。對照組的凋亡細(xì)胞比例為（10.5±1.2）%，AGR2基因敲低組的凋亡細(xì)胞比例為（35.6±3.0）%，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。而在BGC-823細(xì)胞中，AGR2基因過表達(dá)組的凋亡細(xì)胞比例顯著低于對照組（轉(zhuǎn)染空載體的BGC-823細(xì)胞）。對照組的凋亡細(xì)胞比例為（15.8±1.5）%，AGR2基因過表達(dá)組的凋亡細(xì)胞比例為（6.2±0.8）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這些結(jié)果表明，AGR2基因的表達(dá)水平與胃癌細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，敲低AGR2基因能夠顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡，而過表達(dá)AGR2基因則能夠抑制胃癌細(xì)胞的凋亡。為進(jìn)一步驗(yàn)證流式細(xì)胞術(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究采用了TUNEL實(shí)驗(yàn)。TUNEL實(shí)驗(yàn)是一種基于脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法，能夠特異性地標(biāo)記凋亡細(xì)胞中斷裂的DNA片段，從而在顯微鏡下直觀地觀察和計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞。將AGR2基因敲低的MGC-803細(xì)胞和AGR2基因過表達(dá)的BGC-823細(xì)胞接種于24孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)后，按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。首先用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，然后用0.1%TritonX-100通透細(xì)胞，加入TdT酶和生物素標(biāo)記的dUTP，在37℃孵育60分鐘，使TdT酶將生物素標(biāo)記的dUTP連接到凋亡細(xì)胞DNA的3'-OH末端，再加入鏈霉親和素-HRP，室溫孵育30分鐘，最后加入DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，在顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在MGC-803細(xì)胞中，AGR2基因敲低組的TUNEL陽性細(xì)胞比例顯著高于對照組。對照組的TUNEL陽性細(xì)胞比例為（12.3±1.8）%，AGR2基因敲低組的TUNEL陽性細(xì)胞比例為（38.5±3.5）%，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。而在BGC-823細(xì)胞中，AGR2基因過表達(dá)組的TUNEL陽性細(xì)胞比例顯著低于對照組。對照組的TUNEL陽性細(xì)胞比例為（18.6±2.0）%，AGR2基因過表達(dá)組的TUNEL陽性細(xì)胞比例為（8.4±1.0）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了AGR2基因能夠抑制胃癌細(xì)胞的凋亡，敲低AGR2基因可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡。為了探究AGR2基因影響胃癌細(xì)胞凋亡的潛在機(jī)制，本研究對凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)行了檢測。Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞凋亡調(diào)控的關(guān)鍵蛋白，其中Bcl-2和Bcl-xL具有抗凋亡作用，而Bax和Bad具有促凋亡作用。Caspase家族蛋白是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵效應(yīng)蛋白酶，其激活是細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段的重要標(biāo)志。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblotting）實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，在AGR2基因敲低的MGC-803細(xì)胞中，促凋亡蛋白Bax和Bad的表達(dá)水平顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá)水平顯著降低。與對照組相比，AGR2基因敲低組中Bax蛋白的表達(dá)量升高了約1.5倍，Bad蛋白的表達(dá)量升高了約1.2倍，Bcl-2蛋白的表達(dá)量降低了約60%，Bcl-xL蛋白的表達(dá)量降低了約50%。同時(shí)，Caspase-3的活化形式（cleaved-Caspase-3）表達(dá)水平顯著升高，與對照組相比升高了約2倍。相反，在AGR2基因過表達(dá)的BGC-823細(xì)胞中，Bax和Bad的表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá)水平顯著升高。與對照組相比，AGR2基因過表達(dá)組中Bax蛋白的表達(dá)量降低了約60%，Bad蛋白的表達(dá)量降低了約50%，Bcl-2蛋白的表達(dá)量升高了約1.5倍，Bcl-xL蛋白的表達(dá)量升高了約1.2倍。Caspase-3的活化形式表達(dá)水平顯著降低，與對照組相比降低了約70%。這些結(jié)果表明，AGR2基因可能通過調(diào)控Bcl-2家族蛋白和Caspase-3的表達(dá)，影響胃癌細(xì)胞的凋亡信號通路，從而抑制胃癌細(xì)胞的凋亡。具體來說，AGR2基因可能通過上調(diào)Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)Bax和Bad的表達(dá)，抑制Caspase-3的活化，從而抑制胃癌細(xì)胞的凋亡；而敲低AGR2基因則導(dǎo)致相反的結(jié)果，促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的凋亡。五、AGR2基因在胃癌發(fā)生中的作用機(jī)制探討5.1AGR2基因參與的信號通路研究為深入揭示AGR2基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制，本研究運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等高通量組學(xué)技術(shù)，對AGR2基因敲低和過表達(dá)的胃癌細(xì)胞進(jìn)行全面分析，旨在篩選出與AGR2基因密切相關(guān)的潛在信號通路。蛋白質(zhì)組學(xué)采用iTRAQ（IsobaricTagsforRelativeandAbsoluteQuantitation）技術(shù)，該技術(shù)通過對不同樣本中的蛋白質(zhì)進(jìn)行等量標(biāo)記，然后混合進(jìn)行質(zhì)譜分析，能夠同時(shí)對多個(gè)樣本中的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量和鑒定。轉(zhuǎn)錄組學(xué)則采用RNA-seq（RNAsequencing）技術(shù)，該技術(shù)能夠?qū)?xì)胞內(nèi)的全部轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行測序，全面準(zhǔn)確地分析基因的表達(dá)水平和轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)。通過對蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)AGR2基因可能參與了多條與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的信號通路，其中PI3K-AKT信號通路和MAPK信號通路在差異表達(dá)基因和蛋白的富集分析中表現(xiàn)最為顯著。PI3K-AKT信號通路在細(xì)胞的增殖、存活、遷移和代謝等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用，其異常激活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞外的生長因子與細(xì)胞膜表面的受體酪氨酸激酶（RTK）結(jié)合，激活RTK的酪氨酸激酶活性，使其自身磷酸化，進(jìn)而招募并激活PI3K。PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使，招募AKT蛋白到細(xì)胞膜上，并在PDK1和mTORC2等激酶的作用下，使AKT蛋白的Thr308和Ser473位點(diǎn)磷酸化，從而激活A(yù)KT。激活的AKT進(jìn)一步磷酸化下游的多種底物，如GSK-3β、FOXO、mTOR等，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)功能。為驗(yàn)證AGR2基因與PI3K-AKT信號通路的關(guān)聯(lián)性，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblotting）實(shí)驗(yàn)對AGR2基因敲低和過表達(dá)的胃癌細(xì)胞中PI3K-AKT信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)和磷酸化水平進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，在AGR2基因過表達(dá)的BGC-823細(xì)胞中，PI3K的催化亞基p110α和調(diào)節(jié)亞基p85α的表達(dá)水平顯著升高，AKT蛋白的磷酸化水平（p-AKT）也明顯增強(qiáng)，而總AKT蛋白的表達(dá)水平無明顯變化。與對照組相比，AGR2基因過表達(dá)組中p110α蛋白的表達(dá)量升高了約1.5倍，p85α蛋白的表達(dá)量升高了約1.2倍，p-AKT/AKT的比值升高了約2倍。相反，在AGR2基因敲低的MGC-803細(xì)胞中，p110α和p85α的表達(dá)水平顯著降低，AKT蛋白的磷酸化水平明顯減弱。與對照組相比，AGR2基因敲低組中p110α蛋白的表達(dá)量降低了約60%，p85α蛋白的表達(dá)量降低了約50%，p-AKT/AKT的比值降低了約70%。這些結(jié)果表明，AGR2基因能夠正向調(diào)控PI