實驗一、大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化

一、實驗目的

二、1.掌握大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備方法

三、2、解轉(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學研究中的意義，學習將外源質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)

入受體菌細胞并篩選轉(zhuǎn)化體的方法。

四、實驗原理

1.感受態(tài)細胞的概念

重組DNA分子體外構(gòu)建完成后，必須導入特定的宿主（受體）細胞，使之無

性繁殖并高效表達外源基因或直接改變其遺傳性狀，這個導入過程及操作統(tǒng)稱

為重組DNA分子的轉(zhuǎn)化。

在原核生物中，轉(zhuǎn)化是一個較普遍的現(xiàn)象，在細胞間轉(zhuǎn)化是否發(fā)生，一方面

取決于供體菌與受體菌兩者在進化過程中的親緣關(guān)系，另一方面還與受體菌是

否處于一種感受狀態(tài)有著很大的關(guān)系。

所謂的感受態(tài)，即指受體（或者宿主）最易接受外源DNA片段并實現(xiàn)其轉(zhuǎn)化

的一種生理狀態(tài)，它是由受體菌的遺傳性狀所決定的，同時也受菌齡、外界環(huán)境

因子的影響。cAMP可以使感受態(tài)水平提高一萬倍，而Ca2+也可大大促進轉(zhuǎn)化的

作用。細胞的感受態(tài)一般出現(xiàn)在對數(shù)生長期，新鮮幼嫩的細胞是制備感受態(tài)細胞

和進行成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。

制備出的感受態(tài)細胞暫時不用時，可加入占總體積15%的無菌甘油或-70。。

保存（有效期6個月）。

2.轉(zhuǎn)化的概念及原理

在基因克隆技術(shù)中，轉(zhuǎn)化特指將質(zhì)粒DNA或以其為載體構(gòu)建的重組DNA

導入細菌體內(nèi)，使之獲得新的遺傳特性的一種方法。它是微生物遺傳、分子遺傳、

基因工程等研究領(lǐng)域的基本實驗技術(shù)之一。

受體細胞經(jīng)過一些特殊方法，如電擊法、CaQ2等化學試劑法處理后，使細胞

膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源DNA分子通過的感受態(tài)細胞。進入細胞

的DNA分子通過復制、表達實現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細胞出現(xiàn)新的遺傳性

狀。

用CaC12處理大腸桿菌細胞使其處于感受態(tài)后，通過熱激處理可將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入細菌中。進

入細菌細胞的質(zhì)粒能夠自主瑪制并在宿主中實現(xiàn)其攜帶基因的轉(zhuǎn)錄、表達。本實驗使用的

pUC19質(zhì)粒帶有氨葦青霉素抗性基因（Amp）,理論上只有轉(zhuǎn)入了pUC19質(zhì)粒的大腸桿菌才

能在含Amp的培養(yǎng)基上生長。但抗性篩選只是初步的篩選，可能仍有部分未轉(zhuǎn)進質(zhì)粒的細

菌能在抗性培養(yǎng)基.上生存（假陽性），因此尚需提取質(zhì)粒酶切、電泳作進步的鑒定。

三、實驗材料、設備及試劑

1.實驗材料

大腸桿菌單菌落液體培養(yǎng)物

1、2.實驗設備及器具

2、低速冷凍離心機、超凈工作臺、50ml離心管、10ml刻度移液管、玻璃棒（三種

器具均已經(jīng)過滅菌處理）。恒溫水浴箱恒溫搖床無菌離心管標記筆玻璃涂布

器微量移液器

3.試劑及配置

0.1M氯化鈣溶液（配制：稱取1.1g無水氯化鈣，溶于90ml雙蒸

水中，定容至100ml,轉(zhuǎn)移至試劑瓶中，121℃滅菌20min.保

存。75%乙醇

1.LB培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基：

蛋白陳（typtone）1.0%（1g/100ml）

酵母提取物（Yeastextraction）0.5%（0.5g/100ml）

氯化鈉1.0%（1g/100ml）

PH7.0

固體培養(yǎng)基：100ml液體培養(yǎng)基中加入1.5g瓊脂粉

含氨茉青霉素（Amp）50mg/l的固體LB培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基中加1.5%瓊

脂粉，高壓滅菌消毒，待泠卻至不燙手時加入Amp鋪培養(yǎng)皿。

pUC19質(zhì)粒配制成約50ng/口1。

四、實驗步驟

操作步驟

一.感受態(tài)細胞的制備（0.IMCaCk方法）

1、從LB固體平板挑單克隆于5mlLB液體培養(yǎng)基中（不加抗生素），37cx

200rpmX12-lGh,可過夜培養(yǎng)。

2、將活化菌體按「?5%接種到LB中，擴大培養(yǎng)37℃X200rpmX2h;至

0D600約為0.4。

3、取培養(yǎng)好的菌液1.5ml于一離心管中，4℃離心8OOOrpmXlmin。

4、棄上清，加500ul0.IMCaC12（滅菌預冷）洗菌體,4c冷凍離心800Drpm

XImin0

5、徹底除去殘液，加200ul0.IMCaC12（滅菌預冷），懸浮菌體。

冰浴靜置30min,4℃冷凍離心8000rpmXlmin。

棄上清，加100ul0.IMCaC12（滅菌預冷），懸浮菌體，即為制備好的感

受態(tài)細胞。

附注：

①、整個過程注意無菌操作和保持低溫。

②、培養(yǎng)物處于對數(shù)生長期是制備感受態(tài)細胞的關(guān)鍵。

③、如果要求高轉(zhuǎn)化效率，不建議使用簡單深凍保存的感受態(tài)細胞。

LB液體培養(yǎng)基建議用不加抗生素和加抗生素的兩種培養(yǎng)基，檢查菌體是否污

染。

D600值指細胞密度，用于判斷培養(yǎng)物是否處于對數(shù)生長期。OD600值在0.4-0.5

時，此時培養(yǎng)物處于對數(shù)生長期，細胞數(shù)在20min內(nèi)加倍。

二、質(zhì)粒對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化

1.將連接產(chǎn)物加入100ul制備好的感受態(tài)細胞，冰上放置30mine

2.42℃熱激90S。

3.迅速冰浴3mino

4、加入300ulLB液體培養(yǎng)基，37℃輕搖培養(yǎng)45min。

5.加入30ulX-gal和6ulIPTG,混勻。

6.取100ul涂布在含有50ug/ml氨芳的LB固體培養(yǎng)基中。

7、37c倒置，避光培養(yǎng)16-20ho

8、藍白斑篩選，挑取些菌落進行菌落PCR鑒定。

轉(zhuǎn)化實驗本應設置兩個對照：

對照組1用來判斷不加入質(zhì)粒的大腸桿菌在抗性培養(yǎng)基上生長的狀況，排除

假陽性

對照組2用來判斷制備成感受態(tài)后的大腸桿菌在普通培養(yǎng)基上的生長狀況

五、計算轉(zhuǎn)化率

轉(zhuǎn)化后在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉(zhuǎn)化子，根據(jù)此皿中的菌落數(shù)

（CFU）可計算出轉(zhuǎn)化子總數(shù)和轉(zhuǎn)化頻率，公式如下：

轉(zhuǎn)化子總數(shù)=菌落數(shù)X涂板前離心管中菌液體積/涂板時所用菌液體積

轉(zhuǎn)化頻率=轉(zhuǎn)化子總數(shù)/質(zhì)粒DNA加入量（mg）

轉(zhuǎn)化效率=轉(zhuǎn)化子總數(shù)/感受態(tài)細胞總數(shù)

注意:實驗從第三步開始,整個實驗過程都必須無菌操作!

五、思考題

1.用試劑瓶盛裝的氯化鈣在滅菌時應怎樣操作？

答：可以高溫高壓滅菌，也可以過濾滅菌。高溫高壓滅菌注意蓋子不要蓋得太

緊。

2、步驟3和4中，對離心機應當做什么樣的預處理？

答：由于整個實驗都應在低溫下進行，因此需要對離心機進行4℃的預冷。

3.實驗為什么必須全程在無菌條件下操作？

答：防止雜菌和雜DNA的污染。否則會影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入。

實驗二質(zhì)粒DNA的提取

目的

學習堿裂解法提取質(zhì)粒的原理

原理

質(zhì)粒(plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，具有雙鏈閉環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA分

子。它具有自主復制能力，能使子代細胞保持它們恒定的拷貝數(shù)，可表達它攜帶

的遺傳信息。目前，質(zhì)粒已廣泛用作基因工程中目的基因的運載工具一一載體。

質(zhì)粒DNA的提取是依據(jù)質(zhì)粒DNA分子較染色體DNA分子小，且具有超螺旋共

價閉合環(huán)狀的特點，從而將質(zhì)粒DNA與大腸桿菌染色體DNA分離?，F(xiàn)在常用的

方法有：堿裂解法、密度梯度離心法、煮沸裂解法等。實驗室普遍采用的堿裂解

法具有操作簡便、快速、得率高的優(yōu)點。其主要原理：利用染色體DNA與質(zhì)粒

DNA的變性與復性的差異而達到分離的目的。在堿變性條件下，染色體DNA的

氫鍵斷裂，雙螺旋解開而變性，質(zhì)粒DNA氫鍵也大部分斷裂，雙螺旋也有部分

解開，但共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的兩條互補鏈不會完全分離，當pH=4.8的乙酸鈉將

其pH調(diào)到中性時，變性的質(zhì)粒DNA又恢復到原來的構(gòu)型，而染色體DNA不能

復性，形成纏繞的致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，離心后，由于浮力密度不同，染色體DNA與大

分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。

試劑與器材

一、試劑

1.LB液體培養(yǎng)基:胰蛋白豚10g,酵母提取物5g,NaCl10g,溶解于1000mL

蒸飾水中，用NaOH調(diào)pH至7.5。高壓滅菌2()min。

2、LB平板培養(yǎng)基：在每1000mLLB液體培養(yǎng)基中中加入15g瓊脂，高壓

滅菌20mino

3.溶液I:50mmol/L葡萄糖/Ommol/LEDTA,25mmol/LTris-HCl(pH8.0)。

4,溶液H:0.2mol/LNaOH,1%SDSo(必須現(xiàn)配)

5、溶液III：pH4.8的醋酸鉀溶液(5mol/L乙酸鉀60mL,冰乙酸11.5mL,

水28.5mL)(>

6、TE緩沖液(pH8.0):10mmol/LTris-HCI,1mmol/LEDTAo

7、無水乙醇和70%乙醇。

二、器材

1、Eppendorf管、離心管架

2、10,100,1000ul微量加樣器

3、臺式高速離心機

4、搖床、高壓滅菌鍋

5、大腸桿菌DH5c（含質(zhì)粒）

操作步驟

一、培養(yǎng)細菌

二、將帶有質(zhì)粒的大腸桿菌接種于LB平板培養(yǎng)基上，37CX24h,然后

從平板上挑取單菌落，接種于5mL液體培養(yǎng)基中，37℃X12h.

三、提取步驟

I.將菌液移入1.5ml離心管，8000rpmXImin,倒置于濾紙上，徹底除去

殘液。

2.加入100ul預冷的溶液I,用渦旋震蕩器充分懸浮菌體。

3.加入4ulRNase,室溫X2min。

4、加入200ul溶液H,快速顛倒，溫和混勻，冰浴此時溶液應

非常粘稠。

5.加入150ul預冷的溶液H【，溫和混勻（此時應有可見沉淀），冰浴5

min?

6.12000rpmX5mino轉(zhuǎn)移上清液至另一1.5ml離心管中。

7、上清液加入2倍體積預冷的無水乙醇，混勻，-20℃X20min。

8、12000rpmX5min,徹底除去殘液。

9、加入500ul70%乙醇洗DNA沉淀。3000rpmXImin,徹底揮發(fā)除去乙醇。

10、加入40ulddH20溶解DNA,待用。（或用TE溶解，-20℃保存）。

實驗三紫外吸收法測定核酸濃度與純度

一、實驗目的：

1、了解紫外線（UV）吸收法測定核酸濃度的原理2、熟悉分光光度計的操作；

3、計算DNA含量，學習核酸濃度的定量技術(shù)。

二、實驗原理

核酸、核甘酸及其衍生物都具有共胡雙鍵系統(tǒng)，能吸收紫外光，在240?290nm的

紫外波段有強烈的吸收峰,DNA鈉鹽的紫外吸收在260nm附近有最大吸收值，其

吸光率（absorbance）以A260表示。A260是核酸的重要性質(zhì)，在核酸的研究中

很有用處。RNA鈉鹽的吸收曲線與DNA無明顯區(qū)別。不同核甘酸有不同的吸收

特性，所以可以用紫外分光光度計通過測定核酸溶液對光的吸收確定核酸的濃

度和純度。但不能區(qū)分DNA與RNA的含量。

純DNA的A260/A280應為1.8,純RNA應為2.0。樣品中如果混雜有蛋白質(zhì)或

苯酚,A260/A280比值會明顯降低。通常在A260nm波長下，以1OD值相當于50

ug/mL雙螺旋DNA,或40口g/mL單鏈DNA（或RNA）,或20ug/mL寡

核昔酸加以計算。此法操作簡便，迅速。但若樣品內(nèi)混雜有大量的核甘酸或蛋白

質(zhì)等能吸收紫外光的物質(zhì)，則測定誤差較大，故為了測定準確應設法預先除去。

三、試劑與儀器設備：

DNA樣品；滅菌雙蒸水（ddFhO）

紫外分光光度計；狹縫石英比色杯；微量移液器、加樣槍頭

四、實驗步驟

1.接通紫外分光光度計電源，使儀器處于紫外測定狀態(tài)下預熱20min；

2.調(diào)波長至所需，吸取1mlddH2O至石英杯中調(diào)節(jié)分光光度計生點；

3.倒掉ddH2O,在石英杯中加入已稀釋好的DNA樣品溶液，進行相應波長

下的光吸收值的測定；

4.測定完畢，將石英杯中的樣品溶液回收回指定的容器中；

5.用洗瓶洗滌石英杯，再重復2-4步驟進行第二個波長下的光吸收值的測定；

6、通過測定的260nm和280nm的0D值,計算A260/A280比率。比率＞1.6

說明DNA純度較高；

7、計算樣品的濃度

雙鏈DNA濃度=50Ng/mlxA26ox稀釋倍數(shù)

單鏈DNA濃度=33Ug/mlxA26°x稀釋倍數(shù)

單鏈RAN濃度=40Ng/mlxA26ox稀釋倍數(shù)

核酸總量二樣品濃度X樣品體積（ml）

五、實驗結(jié)果分析

所測樣品純度，可能含有的雜質(zhì)，樣品DNA大致的濃度。

實驗四水平式瓊脂精凝膠電泳法檢測DNA

目的

學習水平式瓊脂糖凝膠電泳，檢測DNA的純度，DNA的構(gòu)型，含量以及分子量

的大小。

原理

水平式瓊脂糖凝膠電泳是基因工程操作中最常規(guī)的實驗方法，它簡單易行,

只需少量的DNA就能檢測，其分辨效果比分光光度計法與溟化乙咤-標準濃度

DNA比較法更高，更直接，檢測DNA范圍更廣，其原理是澳化乙院在紫外光照

射下能發(fā)射熒光，當DNA樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時，瓊脂糖凝膠中的EB就插

入DNA分子中形成熒光絡合物；使得DAN發(fā)射的熒光，增強兒十倍。而熒光的

強度正比于DNA的含量，如將已知濃度的標準樣品做瓊脂糖凝膠電泳的對照,

就可比較出待測樣品的濃度。若用薄層分析掃描儀檢測，則可精確地測得樣品的

濃度。電泳后的瓊脂糖凝膠塊直接在紫外光下照射拍照，只需5~10ngDNA,就

可以從照片上比較鑒別。如肉眼觀察，可檢測到0.01?O.lng的DNA。

在凝膠電泳中，DNA分子的遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比。質(zhì)粒DNA

樣品用單一切點的酣前切后與已知分子量大小的標準DNA片段進行電泳對照,

觀察其遷移距離，就可以該樣品的分子量大小。凝膠電泳不僅可分離不同分子量

的DNA,也可鑒別分子量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子。在抽提質(zhì)粒的過程中,

由于各種因素的影響，使得超螺旋共價閉環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA(SC)的一條鏈斷裂，變

成開環(huán)(OS)分子，如果兩條鏈發(fā)生斷裂，就變成線形分子(L)分子。這三種

構(gòu)型的分子有不同的遷移率。在一般情況下，超螺旋遷移速度最快，其次為線形

分子，最慢的為開環(huán)分子。

當提取到的質(zhì)粒DNA樣品中還有染色體DNA或RNA,在瓊脂糖電泳上也可以

分別觀察到電泳區(qū)帶，由此可以分析樣品的純度。

DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應與分子篩效應，前者由分子所帶

凈電荷的多少而定，后者則主要與分子大小及構(gòu)型有關(guān)。DNA分子在高于其等

電點的溶液中帶負電荷。在電場中向著正極移動，在用電泳法檢測DNA分子時,

應當盡量減少電荷效應。增加凝膠的濃度可以在一定程度上降低電荷效應，使得

分子的遷移速度主要由分子受凝膠阻滯程度差異所決定，提高分辨率。同時適當

降低電泳時的電壓，也可以使分子篩效應相應增強而提高分辨率。

試劑與器材

一、試劑

1、DNA樣品

2、TBE緩沖液(5X)：用時需稀釋10倍

3、點樣緩沖液Loadingbuffer(10X):0.25%澳酚藍,40%甘油

4、溪乙呢染色液(EB)：浪乙唾注意：該試劑具致癌作用，用時要

小心。

5、瓊脂糖

二、器材

1、電泳儀系統(tǒng)

2、紫外燈

3、恒溫水浴箱

操作步驟

1.選擇合適的水平式電泳儀，調(diào)節(jié)電泳槽平面至水平，檢測穩(wěn)壓電源與正

負極的線路。

2.選擇孔徑大小適宜的點樣梳，垂直架在電泳槽負極的一端，使得點樣梳

的底部與2泳槽水平面的距離2

制備瓊脂糖凝膠：按分離線狀DNA分子的有限范

照被分離的DAN分圍(kb)

子的大小，決定凝

膠中瓊脂糖的百分

含量。一般情況下可

參考下表：

瓊脂糖的含量(％)

g/ml

().360?5

0.620-1

().71()~0.8

0.97-0.5

1.26-0.4

1.54~0.2

2.03-0.1

3.稱取瓊脂糖溶解在電泳緩沖液中，一般配制約40ml凝膠液，置微波爐

中或水浴加

4.熱，至瓊脂糖融化均勻。

將凝膠槽洗凈擦干，兩端用膠布封好，在一端插好梳子。待凝膠溶液冷

卻至60℃

5.左右時，在凝膠溶液中加EB(EB最終濃度為0.5Ng/ml)f搖

勻，輕輕倒入電泳槽水平板上，除掉氣泡。待凝膠完全凝固后，去掉兩

端封條，將凝膠槽移至電泳槽(槽中已加入TBE緩沖液)，然后小心地

拔掉梳子保持點樣孔完整。

6.注意：電極緩沖液要高出凝膠面2-5mm。

待測的DNA樣品中，加入1/5體積的點樣緩沖液，混勻后小心的進行點

樣，記錄樣

品點樣順序和點樣量。

7.開啟電源開關(guān)，最高電壓不超過5V/cm。

電泳時間看實驗的具體要求而異，在電泳中途可用紫外燈直接觀察，DNA各

條區(qū)帶

分開后電泳結(jié)束。一般20min—3h,取電泳凝膠塊直接拍照。

實驗三瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒DNA

一、實驗目的：

學習瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法和技術(shù)，了解質(zhì)粒DNA電泳條帶的多態(tài)性

二、實驗原理

DNA分子在瓊脂糖凝膠中時有電荷效應和分子篩效應。DNA分子在高于等電點的溶液中

帶負電荷，在電場中向正極移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于

分子篩效應.具有不同的相對分子質(zhì)量的DNA片段泳動速度不一樣,可進行分離.凝膠

電泳不僅可分離不同分子質(zhì)量的DNA,也可以分離相對分子質(zhì)量相同,但構(gòu)型不同的

DNA分子。

在細菌細胞內(nèi)，共價閉環(huán)質(zhì)粒以超螺旋形式存在。在提取質(zhì)粒過程中，除了超螺

旋DNA外，還會產(chǎn)生其它形式的質(zhì)粒DNA。如果質(zhì)粒DNA兩條鏈中有一條鏈發(fā)生

一處或多處斷裂,分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成松馳型的環(huán)狀分子,稱開環(huán)

DNA(OpencircularDNA,簡稱ocDNA)；如果質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂,

則形成線狀DNA(LinearDNA)o當提取的質(zhì)粒DNA電泳時，同一質(zhì)粒DNA其超螺

旋形式的泳動速度要比開環(huán)和線狀分子的泳動速度快，開環(huán)與線狀分子的泳動

亦有差異，于是在電泳時會產(chǎn)生三個條帶的現(xiàn)象。

三、試劑與儀器設備：

1.質(zhì)粒DNA

2.瓊脂糖

3.6義載樣曲施..0.25.二甲苯青肝,0.25膜酚藍，30.甘油

4.5()XTAE電泳BufferI2.2gTris,2.85ml冰醋酸，10ml().25mol/L

EDTA(pH8.0),加水至50ml。

5.濱化乙錠(EB)溶液避光保存)，每100ml瓊脂糖凝膠加5Pl貯

存液，即凝膠中EB終濃度為0.5ug/ml,此試劑為強致癌物，要戴手套操作，避

免污染環(huán)境。

6.DN.Marker:共6條帶，2000bp.l()()()bp>75()bp、50()bp、25()bp、lOObp。

上樣6ul時750bp的帶約為lOOng,其余帶約為50ng

7.各種國產(chǎn)移液器(10,20,100u1)

8.消毒的tips槍頭

9.水平電泳槽和電泳儀

四、實驗步驟

L膠液的制備:稱取0.4g瓊脂糖，置于錐形瓶中，加入50ml1XTAE稀釋緩

沖液，放電爐上加熱至竦脂糖全部熔化，取出搖勻，此為0.8%瓊脂糖凝膠液，加

熱過程中要不時搖動，使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液。加熱時應蓋上封口

膜，以減少水份蒸發(fā)。

2.膠板的制備：將有機玻璃膠槽兩端分別用擋板隔出需要制膠的空間，將

膠槽置于水平支持物上,插上樣品梳子，注意觀察梳子齒下緣應與膠槽底面保持

1mm左右的間隙。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封擋板內(nèi)側(cè)，待瓊脂糖溶

液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi)，使膠液形成均勻的膠層。倒膠時的

溫度不可太低，否則凝固不均勻,速度也不可太快,否則容易出現(xiàn)氣泡。待膠完全

凝固后撥出梳子,注意不要損傷梳底部的凝膠,然后向槽內(nèi)加入1XTAE緩沖液至

液面恰好沒過膠板上表面。因邊緣效應樣品槽附近會有一些隆起,阻礙緩沖液進

入樣品槽也所以要注意保證樣品槽中應注滿緩沖液。

4.加樣：取1u1DNA溶液與適量載樣緩沖液混勻,用微量移液槍小心加入樣

品槽中。質(zhì)粒DNA加樣完畢，選取一個未加樣點樣孔加入6ulDNAMarker。注

意每加完一個樣品要更換tip槍頭，以防止互相污染,注意上樣時要小心操作,避

免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。

5.電泳：加完樣后,合上電泳槽蓋，立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?V/cm。

當澳酚藍條帶移動到距凝膠前沿約2?1cm時，停上電泳。

6.染色：未加EB的膠板在電泳完畢后移入0.5ug/ml的EB溶液中，室溫下

染色20-25分鐘。

7、觀察：在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色后的電泳膠板。DNA

存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。紫光燈下觀察時應戴上防護眼鏡或有

機玻璃面罩，以免損傷眼睛。

［注意］EB是強誘變劑并有中等毒性，配制和使用時都應戴手套，并且不要把

EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清

洗或丟棄。

五、實驗結(jié)果分析

質(zhì)粒DNA電泳條帶的形態(tài)。根據(jù)DNAmarker分析質(zhì)粒DNA溶液大致的濃

度。

六、思考題

1.電泳時所加電壓值如何確定？

答：可根據(jù)DNA大小來確定，越大的電壓可低點，避免拖尾現(xiàn)象；越小的電

壓可適當大一點縮短電泳時間，避免時間過長DNA擴散導致條帶模糊。

2.就你的理解，DNAmarker的用途是什么？

答：分析DNA大小和濃度的依據(jù)。

3、電泳中用到兩種buffer,各自的作用。

答：

上樣緩沖液主要作用:

（1）螯合Mg2+,防止電泳過程中DNA被降解，一般上樣緩沖液中含

10mmol/l的EDTAo

（2）增加樣品密度以保證DNA沉入加樣孔內(nèi)，一般上樣緩沖液中加入一定

濃度的甘油或蔗糖，這樣可以增加樣品的比重。而在大片段電泳中采用Ficoll（聚

蔗糖），可減少DNA條帶的彎曲和托尾現(xiàn)象。

（3）指示劑監(jiān)測電泳的行進過程，一般加入泳動速率較快的濱酚藍指示電

泳的前沿，它的速率約與3OObp的線狀雙鏈DNA相同。

電泳緩沖液的作用:

一是維持合適的pH；二是使溶液具有一定的導電性.以利于DNA分子的遷

移。此外，電泳緩沖液還有一個組分是EDTA,加入濃度為目的是

螯合Mg2+等離子，防止電泳時激活DNA酶，此外還可防止Mg2+離子與核酸

生成沉淀。

4.如果質(zhì)粒DNA電泳條帶只有一條，說明提取的質(zhì)粒質(zhì)量高還是低，為什

么？

答：質(zhì)量高。這說明產(chǎn)生只有超螺旋的正常質(zhì)粒閉合環(huán)雙鏈DNA。

實驗五質(zhì)粒DNA酶切及瓊脂糖電泳分析鑒定

原理

限制性內(nèi)切酶可以識別雙鏈DNA特定位點.并產(chǎn)生特異的切割，形成粘性

末端或平末端，這樣有利于DNA片段再連接。

限制性內(nèi)切酶對環(huán)狀質(zhì)粒DNA有多少切點，酶切后就能產(chǎn)生多少個片段。因此,

鑒定酶切后的片段在電泳凝膠的區(qū)帶數(shù)，就可以推斷切點的數(shù)目；從片段遷移率

的大小可以判斷酶切片段大小的差別。用已知相對分子量DNA為對照，通過電

泳遷移率的比較，可以粗略地測出分子形狀相同的未知DNA的相對分子質(zhì)量。

質(zhì)粒DNA在細胞內(nèi)有三種構(gòu)象：①共價閉環(huán)DNA,常以超螺旋形式存在；②如

果兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成

開環(huán)DNA；③線狀DNA,雙鏈DNA斷開成線狀。電泳時，三種構(gòu)象中，共價閉

環(huán)DNA遷移率最大，其次是線狀DNA和開環(huán)DNAo因此在本實驗中，質(zhì)粒在

電泳中呈現(xiàn)2?3條區(qū)帶。

試劑與器材

一、試劑

1.EcoRI酶

2.XDNA

4、3.TBE緩沖液(5X)：用時需稀釋10倍

5、點樣緩沖液Loadingbuffer(10X)：0.25%溟酚藍,40%甘油

6、澳乙咤染色液(EB)：澳乙咤注意：該試劑具致癌作用，用時要

小心。

7、瓊脂糖

二、器材

1.電泳儀系統(tǒng)

2.紫外燈

3.恒溫水浴箱

操作步驟

一、質(zhì)粒DNA酶切

1、按下表將各種試劑分別加入每個Eppendorf管中，要注意管號。

管號①②③

質(zhì)粒DNA101010

EcoRI/ul11

酶切Buffer(10X)/ul222

ddH2O/ul876

RNA酶1

加樣后混勻，置于37℃水浴中，保溫2ho然后每個管中迅速加入2ul

EDTA

終止反應。

二、瓊脂糖凝膠電泳

1、瓊脂糖凝膠的制備(1%)

2、稱0.4g瓊脂糖加40ml0.5XTBE緩沖液,加熱熔解。冷卻至60℃加2ul

EB,混勻。

3、膠板制備

4、將凝膠槽洗凈擦干，兩端用膠布封好，然后倒入熔好的瓊脂糖，并在一

端插好梳子。待凝膠完全凝固后，去掉兩端封條，將凝膠槽移至電泳槽,

垂直拔掉梳子。

5、注意：電極緩沖液要高出凝膠面2-5mm。

6、加樣

7、每個樣品中加入中加體積Loadingbuffer（10X）,混勻后小心地加入

樣品槽中，要避免相互污染。

8、電泳觀察

9、接通電源，電壓為80VXlh左右，當漠酚藍到達下沿1一2cm處時，停止

電泳。

10、觀察及照相

將膠板拿出，用自來水小心地沖洗一下。在紫外燈下觀察結(jié)果，如果有條件也可

用凝膠成像系統(tǒng)照相。

實驗六質(zhì)粒DNA的限制性酶切、PCR擴增與檢測

一、實驗目的

掌握PCR、限制性內(nèi)切酶酶切的技術(shù)原理和操作要點，增進對理論知識的理解。

二、實驗原理

1.限制性內(nèi)切酶酶切限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性

酶識別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點上，并切割雙鏈DNAo它可分

為三類：I類和HI類能在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切害IJ和修飾（甲基化）作用且依賴

于ATP的存在。I類酶結(jié)合于識別位點并隨機的切割識別位點不遠處的DNA,

而m類酶在識別位點上切割DNA分子,然后從底物上解離。II類由兩種酶組成:

一種為限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶），它切割某一特異的核甘酸序列；另一種為獨

立的甲基化酶，它修飾同一識別序列。II類中的限制性內(nèi)切酶在分子克隆中得到

了廣泛應用，它們是重組DNA的基礎。絕大多數(shù)11類限制酶識別長度為4至6

個核甘酸的回文對稱特異核甘酸序列，有少數(shù)酶識別更長的序列或簡并序列。II

類酶切割位點在識別序列中，有的在對稱軸處切割產(chǎn)生平末端的DNA片段，有的

切割位點在對稱軸一側(cè)產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性末端。DNA純

度、緩沖液、溫度條件及限制性內(nèi)切酶本身都會影響限制性內(nèi)切酶的活性。大部

分限制性內(nèi)切酶不受RNA或單鏈DNA的影響。當微量的污染物進入限制性內(nèi)

切酶貯存液中時，會影響其進一步使用,因此在吸取限制性內(nèi)切酶時，每次都要用

新的吸管頭。如果采用兩種限制性內(nèi)切酶，必須要注意分別提供各白的最適鹽濃

度。若兩者可用同一緩沖液，則可同時水解。若需要不同的鹽濃度，則低鹽濃度的

限制性內(nèi)切酶必須首先使用，隨后調(diào)節(jié)鹽濃度，再用高鹽濃度的限制性內(nèi)切酶水

解。限制性內(nèi)切酶的晦解反應最適條件各不相同，各種酶有其相應的酶切緩沖液

和最適反應溫度（大多數(shù)為37℃）。對質(zhì)粒DNA函切反應而言，限制性內(nèi)切酶用

量可按標準體系1ugDNA加1單位酶，消化1-2小時。

2、PCRPCR即聚合鏈式反應，它是近年發(fā)展起來的一種體外擴增特異

性DNA的技術(shù)。PCR技術(shù)實際上是在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核甘酸

（dNTP）存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應。PCR技術(shù)的特異性取

決于引物和模板DNA結(jié)合的特異性。反應分3步：①變性：通過加熱使DNA雙

螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA；②退火：當溫度突然降低時，由于模

板分子結(jié)構(gòu)較引物要復雜得多，而且反應體系中引物DNA量大大多于模板DNA,

使引物和其互補的模板在局部形成雜交鏈，而模板DNA雙鏈之間互補的機會較

少。③延伸：在DNA聚合酶和4種dNTP底物及Mg2+存在的條件下，5,一31的

聚合酶催化以引物為起始點的DNA鏈延伸反應，以上3步為一個循環(huán)，每一循

環(huán)的產(chǎn)物可以作為下一個循環(huán)的模板，數(shù)小時之后，介于兩個引物之間的特異性

DNA片段得到了大量復制，數(shù)量可達2X106?7拷貝。

3.瓊脂糖凝膠電泳參見實驗三。

三、實驗材料、設備及試劑

1.上下游引物.濃度為各l.pmol/ulo

5,AATCTAGACATATGAGCAGCTCAGAGGAGGT3',

5'AAGGATCCAAGCTTCAGCGAATCGTCTTGACTGG3',

2.DNA模板：大豆基因組，濃度為100ng/ul。

4.10Xbuffer(購買Taq酶配套buffer)：500mmol/LKC1,l()()mmol/LTris-Cl,

pH9.0,1%Triton-X100

5.MgC12:25mmolzLo

6.dNTP2.5mmol./L：分別取等體積的l()mol/L的dATP,dGTP,dTTP,dCTP

四種混合即成

7.TaqDNA聚合酶：濃度為2.5U/uL

8.滅菌雙蒸水

9.10.buffer(購買限制性內(nèi)切酶配套buffer)

lO.Sall限制性內(nèi)切酶：10U/ul

11.質(zhì)粒DNA:20()ng/5ul

12.6X載樣buffer:0.25.二甲苯青FF,0.25.澳酚藍,30.甘油

13.50XTAE電泳Buffer：12.2gTris,2.85ml冰醋酸，10ml0.25mol/L

EDTA(pH8.0),加水至5()ml。

14.演化乙錠(EB)溶液：10mg/ml(避光保存)，每100ml瓊脂糖凝膠加5ul

貯存液，即凝膠中EB終濃度為0.5ug/ml,此試劑為強致癌物，要戴手套操作,

避免污染環(huán)境。

15.DN.Marke.

16.各種國產(chǎn)移液器(10,20,100L1)

17.消毒的0.2ml1.5mlPCR管,1()u1,10()u1tips

18.恒溫水浴鍋

19.PCR儀

2（）.水平電泳槽和電泳儀

四、實驗步驟

(一)PCR:

各種試劑置冰盒中，取加入量終濃度（或含量）

己滅菌的0.2mlPCR管，

于冰上按下表操作（注：

根據(jù)質(zhì)粒濃度求決定質(zhì)

粒模板的加入量）：反應

體系配制（10U1體系）

試劑

DNA模板1U1lOOng

10Xbuffer21n1Xbuffer

dNTP1Ui2.5mmol

MgCh0.5ul約2.5mM/L

上下游引物1u1(各10pmol/u1)各1Opmol

TaqDNA聚合酶().5u1(2.5U/u1)1.25U

無菌ddfhO補足20u1

總體積10P1

用槍混勻反應液，稍高心,蓋緊蓋子，編號。于PCR儀上進行PCR反應。

反應程序設置為:94℃預變性5min

以下35次循環(huán)

94℃變性55S

55℃退火45s

72℃延伸55s

最后72℃7min

（-）限制性內(nèi)切酶酶加入量終濃度（或含量）

切：

試劑

質(zhì)粒DNAXH1500ng~lug

10Xbuffer1P11Xbuffer

SalI0.1ul(10U/ul)1U

無菌ddHzO補足10MI

總體積10Pl

注：加入質(zhì)粒DNA溶液的體積根據(jù)實驗五電泳結(jié)果決定，取的體積保證加入

的質(zhì)粒為500ng-lug即可。

加蓋，混勻后稍離心,37℃水浴反應3h。反應完畢，于80C水浴20min使醒失

活。

（三）瓊脂糖凝膠電泳

步驟略，請自行設計實驗步驟。

五.實驗結(jié)果分析

由瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析PCR結(jié)果如何？限制性內(nèi)切酶酶切結(jié)果如何?

預期應是怎樣的電泳結(jié)果？如果電泳結(jié)果與預期不符，請分析原因。

實驗二堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA

一實驗目的

了解少量質(zhì)粒制備方法與原理，掌握堿法小量提取質(zhì)粒DNA的操作步驟。

二實驗原理

本實驗利用NaOH破壞菌體細胞使核酸物質(zhì)從細胞中釋放出來，因此稱為堿裂解

法抽提。十二烷基磺酸鈉(SDS)能裂解細菌細胞膜，但更重要的作用在于其與鉀

離子反應后所引起的溶液中絕大部分蛋白質(zhì)以及基因組DNA共沉淀。由于還有很

多蛋白質(zhì)不能被共沉淀掉，因此要進一步用酚、氯仿對溶液進行抽提。最后加入

2倍體積的無水乙醇或0.7倍體積的異丙醇沉淀就能得到質(zhì)量穩(wěn)定的質(zhì)粒DNA。從

細菌中分離質(zhì)粒DNA的方法主要包括3個基本步驟：培養(yǎng)細菌使質(zhì)粒擴增；收集和

裂解細胞；分離和純化質(zhì)粒DNA。

三實驗材料

轉(zhuǎn)化質(zhì)粒PUC19后經(jīng)氨節(jié)抗性篩選獲得的E.col.DH5Q系列菌株

四實驗設備

微量取液器(100U1,1000U1),臺式高速離心機

五試劑

溶液I:50mmol/L葡萄糖,25mmol/LTris.Cl(pH8.0),lOmmol/LEDTA

(pH8.0)o溶液I可成批配制,每瓶100ml,高壓滅菌15分鐘,儲存于4C冰箱。

溶液H:0.2mol/LN