DB15Real-timePCRMethodforDetectionofProcapraGutturosa-DerivedMaterials2020-02-25發(fā)布內(nèi)蒙古自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王伊琴、陳少博、包勇敢、楊帆、寇福軍、張志峰、荊文魁、I黃羊源性成分檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動(dòng)物源性產(chǎn)品中黃羊源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢本標(biāo)準(zhǔn)適用于動(dòng)物源性產(chǎn)品（肉制品、皮毛類產(chǎn)品、飼料等）中黃羊源性成分的鑒定，靈敏度為GB4789.1食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)總則GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和3.3Real-timePCR4.3離心機(jī)。4.4旋渦振蕩器。14.7刻度量筒：100mL，500mL，1000mL。4.8試劑瓶和洗滌瓶：500mL。5試劑與材料5.2試劑盒：按說明書使用試劑盒提供的相應(yīng)試劑。5.3自備的試劑：CTAB提取緩沖液（十六烷基三甲基溴化銨CTAB-沉淀液，蛋白酶K（1.2mol/L）5.4實(shí)時(shí)熒光預(yù)混液。-上游：5’-CTAGGCAACATGCATATC-3’-下游：5’-CGAGAAGAGAAATCCTTG-3’-探針序列：5’-FAM-CACGAGCTTAATGACCATGCCG-TAMRA-3’5.6質(zhì)控物質(zhì)5.6.1陽性對(duì)照樣品：采用已知含有黃羊源性成分的樣品或經(jīng)測(cè)序確認(rèn)的陽性質(zhì)粒。5.6.3空白對(duì)照：采用與模板等體積的雙蒸水。參照附錄A中方法提取樣品基因組DNA，也可采用商品化的組織基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行。當(dāng)A260/A280比值在1.7～1.9之間時(shí)，適宜于2—111—2—7.2.1樣品2個(gè)平行樣檢測(cè)結(jié)果Ct≥40.0，同時(shí)各種試驗(yàn)對(duì)34A.1CTAB-提取緩沖液A.2CTAB-沉淀液稱0.2gCTAB，0.234gN稱取28gNaCL，定容至400mL，115℃高壓15A.5DNA提取方法A.5.1稱取樣品0.5g～1g加入1.5mL～3.5mLCTAB量調(diào)節(jié)每個(gè)樣品提取2管，同時(shí)用水做空白對(duì)照?；靹蚝?5℃至少1h(過夜孵育最好)，如樣品膨脹，則可再多加CTAB，每次多1mL，最多10A.5.2低溫4000rpm～5000rpm離心10miA.5.3將上清（約1mL）加入無菌EP中（2mL管），加入700μL氯仿，旋渦30s后，再12000rpm離μL溶液）。A.5.6加入350μL氯仿，渦旋30s，再12000rpm離心10min。A.5.7取上清液至無菌EP管中（確定體積），加入0.8倍體積的異丙醇，手搖混勻，室溫孵化至少20min,12000rpm離心10min，去上清，沉淀用500μL75%的乙醇洗滌，再12000rpm離心10min。5CTAGGCAACATG