凝膠電泳分離技術(shù)演講人：日期:CATALOGUE目錄02凝膠類型與特性01技術(shù)原理基礎(chǔ)03實驗操作流程04檢測分析方法05主要應(yīng)用場景06技術(shù)優(yōu)化要點技術(shù)原理基礎(chǔ)01電場驅(qū)動分離原理電場作用下帶電分子遷移在電場中，帶電分子（如DNA、RNA或蛋白質(zhì)）會向與其電荷相反的電極方向移動，遷移速度取決于分子所帶凈電荷量及電場強度。電泳緩沖液的作用緩沖液不僅維持穩(wěn)定的pH環(huán)境，還提供離子導(dǎo)電性以形成均勻電場，避免局部過熱導(dǎo)致凝膠變形或樣品降解。電壓與電流的調(diào)控高電壓可加速分離過程但可能產(chǎn)生焦耳熱，需通過冷卻系統(tǒng)或低導(dǎo)電性緩沖液平衡，確保分離分辨率不受影響。凝膠介質(zhì)篩分效應(yīng)聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成不同孔徑，大分子受阻程度高而遷移慢，小分子則快速穿過，實現(xiàn)按大小分離。凝膠孔徑的選擇性凝膠濃度的影響交聯(lián)劑的作用高濃度凝膠（如12%聚丙烯酰胺）適合小分子分離（<10kDa），低濃度（如0.8%瓊脂糖）適用于大分子DNA片段（>1kb）。雙丙烯酰胺等交聯(lián)劑比例調(diào)整可改變凝膠機械強度和孔徑分布，優(yōu)化特定分子量范圍的分離效果。分子大小與遷移率關(guān)系對數(shù)線性相關(guān)性在恒定電場下，分子遷移距離與分子量對數(shù)呈反比，通過標準品（如DNAMarker）繪制標準曲線可精確估算未知樣品分子量。形狀與電荷密度的影響非線性區(qū)間的識別相同分子量的線性DNA比超螺旋DNA遷移更快；蛋白質(zhì)的遷移率還受SDS涂層后電荷密度均一化的影響。極大或極小分子可能偏離線性關(guān)系，需通過梯度凝膠或脈沖電場電泳（PFGE）擴展分離范圍。123凝膠類型與特性02瓊脂糖凝膠特點孔徑可調(diào)控性強瓊脂糖凝膠的孔徑大小可通過調(diào)整瓊脂糖濃度（0.5%-3%）實現(xiàn)，適用于分離100bp-50kb的DNA片段，低濃度凝膠適合大片段分離，高濃度凝膠適合小片段分辨。操作簡便成本低瓊脂糖凝膠制備僅需加熱溶解后冷卻成型，無需聚合催化劑，且支持EB、GelRed等多種核酸染料染色，在紫外透射儀下即可觀察結(jié)果。生物相容性優(yōu)異瓊脂糖由海藻提取，無毒且無電內(nèi)滲效應(yīng)，不會與核酸發(fā)生相互作用，確保電泳過程中樣本完整性，尤其適合DNA/RNA的常規(guī)分析。高分辨率分離能力通過丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的自由基聚合形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，凝膠機械強度高，可承受高壓電泳（2000V以上），且抗對流和擴散效應(yīng)強。化學交聯(lián)穩(wěn)定性可功能化修飾凝膠可通過添加尿素（變性電泳）或梯度濃度設(shè)計（梯度膠）實現(xiàn)特殊分離需求，如變性條件下RNA二級結(jié)構(gòu)解析或蛋白質(zhì)分子量精確測定。聚丙烯酰胺凝膠可形成均一且更小的孔徑（3%-30%單體濃度），能分離1-1000bp的核酸片段或5-500kDa的蛋白質(zhì)，尤其適用于Sanger測序和SDS分析。聚丙烯酰胺凝膠特性DNA分離通常選擇0.8%-2%瓊脂糖凝膠（對應(yīng)0.1-20kb片段），而蛋白質(zhì)分離需根據(jù)目標分子量選擇8%-15%聚丙烯酰胺凝膠（低濃度膠適合大分子量蛋白）。凝膠濃度選擇依據(jù)目標分子大小匹配原則高濃度凝膠（如12%PAGE）可提高小片段分離度但會延長電泳時間，需結(jié)合實驗?zāi)康模ㄈ缤蛔儥z測需更高分辨率）調(diào)整優(yōu)化。分辨率需求權(quán)衡若需回收核酸片段，應(yīng)避免使用高濃度凝膠（>3%瓊脂糖易碎裂）；銀染檢測蛋白質(zhì)時則需選擇低背景干擾的專用聚丙烯酰胺配方。下游應(yīng)用兼容性實驗操作流程03制膠與灌膠標準步驟凝膠濃度選擇根據(jù)目標分子量范圍確定合適的丙烯酰胺濃度，小分子需高濃度膠（12%-15%），大分子宜用低濃度膠（5%-8%）。膠板組裝與密封確保玻璃板清潔無痕，使用1.5mm厚墊片，邊緣涂抹凡士林防止漏膠，灌膠前需進行漏液測試。聚合反應(yīng)控制按比例混合丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、SDS及TEMED，灌膠后覆蓋異丙醇隔絕氧氣以促進均勻聚合。樣品制備與上樣技巧蛋白變性處理樣品需與上樣緩沖液混合，沸水浴加熱使蛋白充分變性，確保二硫鍵被還原劑（如DTT）徹底打開。01上樣量優(yōu)化根據(jù)膠孔大小調(diào)整體積（通常5-20μL），預(yù)染Marker需單獨加樣，避免邊緣效應(yīng)導(dǎo)致條帶扭曲。02加樣槍操作規(guī)范槍頭垂直插入膠孔底部，緩慢推出樣品以防止擴散，避免觸碰膠孔壁造成損傷。03電泳參數(shù)設(shè)置規(guī)范終止時機判斷觀察溴酚藍指示劑遷移至膠板底部1cm時停止電泳，避免小分子蛋白過度擴散導(dǎo)致條帶模糊。03使用預(yù)冷電泳緩沖液（Tris-Glycine-SDS），必要時外接循環(huán)水浴維持溫度在4℃以下。02緩沖液循環(huán)系統(tǒng)電壓梯度控制濃縮膠階段采用80-100V低壓跑膠使樣品聚焦，分離膠階段切換至120-150V提高分辨率。01檢測分析方法04染色技術(shù)選擇（如EB/SYBR）溴化乙錠（EB）染色01EB是一種經(jīng)典的核酸熒光染料，通過與DNA雙鏈結(jié)合在紫外光下發(fā)出橙紅色熒光，靈敏度高且成本低廉，但因其強誘變性需嚴格防護廢棄處理。SYBR系列染料（如SYBRGreen/Safe）02新型無毒替代染料，靈敏度與EB相當且安全性更高，適用于實時熒光檢測和環(huán)保實驗室，但需注意光穩(wěn)定性較差需避光保存。銀染與考馬斯亮藍染色03針對蛋白質(zhì)電泳的染色方案，銀染可檢測低至納克級蛋白但步驟繁瑣，考馬斯亮藍操作簡便適合常規(guī)檢測但靈敏度較低（微克級）。特殊熒光標記（如Cy染料）04適用于多重檢測體系，通過不同熒光標記實現(xiàn)同步分析多條帶，需配合特定激光成像系統(tǒng)且試劑成本較高。成像系統(tǒng)操作方法對轉(zhuǎn)印膜進行HRP/AP酶底物孵育后，立即放入暗箱中設(shè)置自動曝光（通常30s-5min），動態(tài)范圍調(diào)節(jié)需兼顧弱信號與過曝區(qū)域?；瘜W發(fā)光成像流程

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成像后使用真空干燥器60℃處理30分鐘，或密封于聚乙烯袋中避免凝膠開裂，原始數(shù)據(jù)需標注電泳條件及分子量標準。凝膠干燥與存檔開啟紫外光源前需佩戴防護眼鏡，將凝膠置于成像平臺中央，調(diào)整焦距使條帶清晰，通過CCD相機捕獲圖像并保存為TIFF/RAW格式避免壓縮失真。紫外透射/反射成像系統(tǒng)預(yù)先校準各通道激光強度（如Cy3/Cy5），設(shè)置分層掃描參數(shù)避免串擾，圖像疊加時需采用專用軟件進行色差校正。多色熒光掃描儀操作條帶分析與判讀標準分子量校準方法灰度分析定量異常條帶排查結(jié)果報告規(guī)范以已知DNAladder為標準繪制遷移率-對數(shù)分子量曲線，通過回歸方程計算目標條帶大小，誤差范圍需控制在±5%以內(nèi)。使用ImageJ等軟件框選條帶區(qū)域，扣除背景后積分光密度值，建立標準品濃度-信號強度標準曲線進行絕對定量。出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象需檢查膠濃度是否匹配樣品分子量，縱向條紋可能由電泳緩沖液離子強度不均或加樣過量導(dǎo)致。需包含電泳參數(shù)（電壓/時間/膠濃度）、分子量標記信息、染色方法及軟件分析版本，臨界值結(jié)果應(yīng)通過重復(fù)實驗驗證。主要應(yīng)用場景05DNA片段分離鑒定限制性酶切片段分析遺傳病診斷克隆載體構(gòu)建驗證通過凝膠電泳分離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后的DNA片段，根據(jù)條帶大小和數(shù)量進行基因組結(jié)構(gòu)分析或遺傳多態(tài)性研究，廣泛應(yīng)用于基因分型和突變檢測。在分子克隆實驗中，利用瓊脂糖凝膠電泳驗證插入片段與載體的連接效率，通過比較Marker判斷重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功，是基因工程的核心步驟之一。結(jié)合Southernblot技術(shù)，通過電泳分離患者DNA樣本，可檢測特定基因缺失、重復(fù)或重排，為遺傳性疾病如地中海貧血、杜氏肌營養(yǎng)不良提供診斷依據(jù)。蛋白質(zhì)分子量測定SDS精確測定采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）消除蛋白質(zhì)電荷差異，使遷移率僅與分子量相關(guān)，通過與已知標準蛋白對比計算目標蛋白分子量，誤差范圍可控制在5%以內(nèi)。翻譯后修飾研究通過比較天然PAGE與SDS的遷移差異，可初步判斷磷酸化、糖基化等修飾對蛋白質(zhì)表觀分子量的影響，為功能研究提供線索。復(fù)合蛋白組分解析對復(fù)雜樣本如細胞裂解液進行電泳分離后，可直觀顯示不同分子量蛋白的分布情況，結(jié)合考馬斯亮藍或銀染技術(shù)實現(xiàn)微量蛋白檢測，為后續(xù)Westernblot提供基礎(chǔ)。PCR產(chǎn)物驗證分析擴增特異性評估通過電泳檢測PCR產(chǎn)物條帶數(shù)量、位置及亮度，判斷引物二聚體、非特異性擴增或污染情況，優(yōu)化退火溫度、Mg2?濃度等參數(shù)以提高擴增效率。定量PCR產(chǎn)物純化切取目標條帶所在凝膠區(qū)域，采用凍融法或商業(yè)試劑盒回收DNA片段，用于后續(xù)測序、克隆等操作，回收率可達80%以上。微衛(wèi)星標記分型在群體遺傳學研究中，利用高分辨率聚丙烯酰胺凝膠分離熒光標記的PCR產(chǎn)物，通過片段長度多態(tài)性分析個體基因型，應(yīng)用于親子鑒定和種群多樣性研究。技術(shù)優(yōu)化要點06分辨率提升策略凝膠濃度優(yōu)化根據(jù)目標分子量范圍調(diào)整凝膠濃度，低濃度凝膠適合大分子分離，高濃度凝膠可提高小分子分辨率。聚丙烯酰胺凝膠通常采用梯度濃度設(shè)計以實現(xiàn)更寬范圍的分離效果。電場強度調(diào)節(jié)適當提高電場強度可縮短電泳時間并減少擴散效應(yīng)，但需避免過熱導(dǎo)致條帶扭曲。恒壓模式適用于DNA電泳，恒流模式更適合蛋白質(zhì)分離。緩沖系統(tǒng)改良采用Tris-甘氨酸、Tris-硼酸等不同緩沖體系可改變分子遷移率。添加SDS（十二烷基硫酸鈉）能消除蛋白質(zhì)電荷差異，實現(xiàn)按分子量精確分離。常見問題解決方案條帶拖尾現(xiàn)象通常由樣品過量或降解引起，需優(yōu)化上樣量并確保使用新鮮制備的樣品。添加蛋白酶抑制劑可防止蛋白質(zhì)降解，DNA樣品應(yīng)避免反復(fù)凍融。凝膠背景過高可能源于染色過度或未充分洗滌，建議控制考馬斯亮藍/EB染色時間，采用甲醇-乙酸溶液進行脫色。預(yù)電泳步驟可減少凝膠中的游離自由基干擾。電泳速度異常檢查緩沖液pH是否偏離標準值（如TAE緩沖液應(yīng)為8.3），電極接觸不良時需清理電泳槽氧化觸點，凝膠厚度不均需重新制膠。安