二代測(cè)序法在滅活疫苗候選株篩選應(yīng)用的技術(shù)要求2025-04-23實(shí)施2025-04-23實(shí)施I 1范圍 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)和定義 14利用宏基因組測(cè)序?qū)缁钜呙绾蜻x株的外源因子污染進(jìn)行檢測(cè)與評(píng)估 24.1宏基因組測(cè)序流程 24.2滅活疫苗候選株宏基因組測(cè)序的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo) 24.3宏基因組比對(duì)的數(shù)據(jù)庫(kù)要求 24.4滅活疫苗候選株的外源因子污染評(píng)估 3 35利用二代測(cè)序?qū)缁钜呙绾蜻x株的全基因組遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)與評(píng)估 35.1全基因組檢測(cè)流程 35.2滅活疫苗候選株全基因組二代測(cè)序的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo) 35.3滅活疫苗候選株的全基因組遺傳穩(wěn)定性評(píng)估 35.4其他 36利用宏基因組測(cè)序?qū)缁钜呙绶N子批系統(tǒng)外源因子污染的檢測(cè)與評(píng)估 46.1滅活疫苗種子批系統(tǒng)宏基因組測(cè)序的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo) 46.2宏基因組比對(duì)的數(shù)據(jù)庫(kù)要求 46.3滅活疫苗種子批系統(tǒng)的外源因子污染評(píng)估 47利用二代測(cè)序?qū)缁钜呙绶N子批系統(tǒng)的全基因組遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)與評(píng)估 47.1滅活疫苗種子批系統(tǒng)全基因組二代測(cè)序的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo) 47.2滅活疫苗種子批系統(tǒng)遺傳穩(wěn)定性評(píng)估 4參考文獻(xiàn) 6本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由中國(guó)疫苗行業(yè)協(xié)會(huì)提出。本文件由中國(guó)疫苗行業(yè)協(xié)會(huì)歸口。本文件起草單位：浙江省疾病預(yù)防控制中心、北京科興中維生物技術(shù)有限公司、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所、艾美榮譽(yù)(寧波)生物制藥有限公司、廣東省疾病預(yù)防控制中心、中國(guó)科學(xué)院生物物理所、西湖大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院杭州醫(yī)學(xué)研究所、北京科興生物制品有限公司、科興(大連)疫苗技術(shù)有限公司、興盟生物醫(yī)藥(蘇州)有限公司。本文件主要起草人：張嚴(yán)峻、茅海燕、孫逸、陳寅、王楨、高強(qiáng)、呂哲、彭小忠、吳季南、周飚烽、蘇凌旋、顏浩、李建華、王星星、樓秀玉、李舉、朱朗、李柏生、王祥喜、孫仁、謝斯滔、袁潤(rùn)余、李靜、宋俐霏、公雪杰。本標(biāo)準(zhǔn)為首次制定。1本文件適用于使用二代測(cè)序法對(duì)滅活疫苗候選株的外源因子污染、基因組傳代穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)和本文件適用于從病人樣本中分離的滅活疫苗候選株篩選，不僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本W(wǎng)S/T812-2022病原微生物菌(毒)種國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)株評(píng)價(jià)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)估要求，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)的菌(毒)株。{來(lái)源：WS/T812-20225.3,有修改}在一次測(cè)序?qū)嶒?yàn)中對(duì)特定基因組區(qū)域或整個(gè)基因組的測(cè)序覆蓋度。通常以X倍為單位來(lái)表示，如2對(duì)特定樣本的整個(gè)微生物群落進(jìn)行的研究，此研究直接提取樣本中所有微生物的核酸而不進(jìn)行分離和培養(yǎng)，并分析遺傳組成，物種分類，系統(tǒng)發(fā)育和基因功能。堿基識(shí)別質(zhì)量qualityofbasecalling衡量堿基正確識(shí)別的概率。通常以數(shù)字值Q30直接表示。[來(lái)源：GB/T30989-20143.29,有修改]在測(cè)序過(guò)程中，經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制和過(guò)濾處理后，被認(rèn)為是高質(zhì)量、可靠的序列片段的長(zhǎng)度。4利用宏基因組測(cè)序?qū)缁钜呙绾蜻x株的外源因子污染進(jìn)行檢測(cè)與評(píng)估4.1宏基因組測(cè)序流程滅活疫苗候選株的核酸提取按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。病毒性疫苗候選株應(yīng)以細(xì)胞基質(zhì)等作為陰性對(duì)照，細(xì)菌性疫苗候選株應(yīng)以培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。對(duì)提取核酸中的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和二鏈合成，與提取核酸中的DNA合并，構(gòu)建適用于宏基因組測(cè)序平臺(tái)的文庫(kù)。4.1.3宏基因組測(cè)序?qū)?gòu)建好的文庫(kù)置于二代測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。4.1.4數(shù)據(jù)分析去除測(cè)序數(shù)據(jù)中低質(zhì)量序列后，將測(cè)序數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，識(shí)別疫苗候選株的物種組成，評(píng)估外源因子的污染狀況。4.1.5豐度分析通過(guò)宏基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)和注釋，得到疫苗候選株中所有物種組成的豐度值，對(duì)非目標(biāo)病原微生物的外源因子豐度值進(jìn)行評(píng)估。4.2滅活疫苗候選株宏基因組測(cè)序的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)4.2.1接頭污染比例接頭污染比例應(yīng)不超過(guò)1%。4.2.2序列有效長(zhǎng)度序列有效長(zhǎng)度應(yīng)不少于50bp。4.2.3數(shù)據(jù)的有效比對(duì)率數(shù)據(jù)的有效比率應(yīng)不小于70%。4.3宏基因組比對(duì)的數(shù)據(jù)庫(kù)要求宏基因組測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)的數(shù)據(jù)庫(kù)應(yīng)包括但不限于宿主、細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲(chóng)、支原體、衣原體、立克次體等。實(shí)驗(yàn)室需使用標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)對(duì)使用數(shù)據(jù)庫(kù)的精準(zhǔn)性進(jìn)行評(píng)估，并持續(xù)更新數(shù)據(jù)庫(kù)。數(shù)據(jù)庫(kù)可來(lái)源于公共數(shù)據(jù)庫(kù)、商業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)或?qū)嶒?yàn)室內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)等。3除目標(biāo)病原微生物外，滅活疫苗候選株中支原體等外源因子的豐度值超過(guò)陰性對(duì)照中相應(yīng)豐度值一個(gè)數(shù)量級(jí)的疫苗候選株可認(rèn)為存在外源因子污染，該疫苗候選株應(yīng)排除，在同一個(gè)數(shù)量級(jí)的可保留。去除測(cè)序數(shù)據(jù)中低質(zhì)量序列后，將測(cè)序數(shù)據(jù)與滅活疫苗候選株的目標(biāo)病原微生物參考基因組進(jìn)行病毒性疫苗候選株測(cè)序深度應(yīng)不少于1000X,細(xì)菌性疫苗候選株測(cè)序深篩選獲得的疫苗候選株病原微生物的全基因組分子遺傳特征，應(yīng)與目標(biāo)病原微生物標(biāo)準(zhǔn)參考基因4除目標(biāo)病原微生物外，滅活疫苗種子批系統(tǒng)中支原體等外源因子的豐度值超過(guò)陰性對(duì)照中相應(yīng)豐其他涉及滅活疫苗種子批系統(tǒng)外源因子鑒定與無(wú)菌檢測(cè)的項(xiàng)目，均應(yīng)符合《中華人民共和國(guó)藥典》病毒性滅活疫苗種子批系統(tǒng)各代次測(cè)序深度應(yīng)不少于5000X;細(xì)菌性滅活疫苗種子批系統(tǒng)各代次測(cè)57.2.2全基因組序列一致性種子批系統(tǒng)全基因組序列一致性不低于99%,表明滅活疫苗種子批系統(tǒng)具有遺傳穩(wěn)定性。7.2.3變異頻率種子批系統(tǒng)各代次全基因組中與生物學(xué)功能相關(guān)的基因位點(diǎn)變異頻率保持一致(p值大于0.05),6[1]GB/T29859-2[2]GB/T30989-2014高通量基因測(cè)序技術(shù)規(guī)[3]GB/T34798-2017[4]GB/T35890-201[5]WS/T812-2022病原微生物菌(毒)種國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)株評(píng)價(jià)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn).[7]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：三部[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2020.中國(guó)醫(yī)療保健國(guó)際交流促進(jìn)會(huì)臨床微生物與感染分會(huì).宏基因組高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于感染性疾病病原檢測(cè)中國(guó)專家共識(shí)[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，