刺參粘多糖對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株SW1990增殖的抑制效應(yīng)及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義1.1.1胰腺癌的嚴(yán)峻現(xiàn)狀胰腺癌是一種惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤，近年來其發(fā)病率和死亡率呈逐漸上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在全球范圍內(nèi)，胰腺癌的發(fā)病率在各類惡性腫瘤中位居前列，且死亡率居高不下，5年生存率僅約為9%，在腫瘤相關(guān)致死病因中排名第四，預(yù)計(jì)到2030年將攀升至第二位。其發(fā)病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，此時(shí)腫瘤往往已發(fā)生轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除難度大，且對(duì)放化療不敏感，使得胰腺癌的整體治療效果不佳，預(yù)后極差。因此，尋找有效的治療方法和藥物，提高胰腺癌患者的生存率和生活質(zhì)量，已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的重大課題。1.1.2刺參粘多糖的研究價(jià)值刺參作為一種珍貴的海洋生物，其體內(nèi)富含多種生物活性成分，其中刺參粘多糖（Seacucumberpolysaccharides，SCP）備受關(guān)注。刺參粘多糖是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多糖，具有多種獨(dú)特的生物學(xué)活性。研究表明，刺參粘多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用，能夠增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，提高機(jī)體對(duì)病原體的抵抗力；還具有抗氧化活性，可清除體內(nèi)自由基，減輕氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷。更為重要的是，刺參粘多糖在抗腫瘤方面展現(xiàn)出顯著的潛力。已有研究發(fā)現(xiàn)，刺參粘多糖能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長和增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，且對(duì)正常細(xì)胞的毒性較小，具有相對(duì)較高的安全性。這些特性使得刺參粘多糖成為開發(fā)新型抗腫瘤藥物的潛在資源，為攻克胰腺癌等惡性腫瘤的治療難題提供了新的思路和方向。本研究旨在深入探討刺參粘多糖對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株SW1990增殖的抑制作用，為胰腺癌的治療提供新的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1刺參粘多糖的研究進(jìn)展刺參粘多糖的研究涵蓋提取、結(jié)構(gòu)鑒定與生物活性探索。在提取工藝上，傳統(tǒng)方法有堿法、酶法以及二者結(jié)合的雙酶絡(luò)合水解法。堿法利用堿性條件破壞刺參體壁結(jié)構(gòu)釋放粘多糖，但可能導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)降解；酶法如使用胰蛋白酶、胃蛋白酶等，能在較溫和條件下實(shí)現(xiàn)水解，雙酶絡(luò)合水解法可優(yōu)化提取效果，例如當(dāng)胰蛋白酶水解pH為8.2、胃蛋白酶水解pH為2.3、胰蛋白酶添加量為0.45%、胃蛋白酶添加量為0.4%、堿解時(shí)間為3小時(shí)、胃蛋白酶酶解時(shí)間5小時(shí)、胰蛋白酶酶解時(shí)間為5小時(shí)、乙醇添加量為55%時(shí)，攝取效果最佳。此外，新興的超聲輔助提取、微波輔助提取等技術(shù)也逐漸應(yīng)用，它們能縮短提取時(shí)間、提高提取率，通過超聲波或微波的作用，加速多糖從刺參組織中溶出。刺參粘多糖的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，由氨基半乳糖、葡萄糖醛酸、巖藻糖和硫酸基等組成，屬于聚陰離子多糖。對(duì)其精細(xì)結(jié)構(gòu)的解析，包括單糖組成比例、糖苷鍵連接方式、糖鏈分支情況等，多借助化學(xué)分析如甲基化分析、Smith降解，以及儀器分析如核磁共振（NMR）、質(zhì)譜（MS）等技術(shù)。NMR可確定糖環(huán)的構(gòu)型、糖苷鍵的連接位置；MS能精確測(cè)定多糖的分子量和結(jié)構(gòu)片段。在生物活性研究方面，刺參粘多糖展現(xiàn)出多方面功效。免疫調(diào)節(jié)作用上，它能增強(qiáng)免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞的活性，促進(jìn)免疫因子如白細(xì)胞介素、干擾素的分泌，提升機(jī)體免疫監(jiān)視和防御能力；抗氧化活性通過清除超氧陰離子、羥自由基、DPPH自由基等，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，與多糖分子中的羥基、硫酸基等基團(tuán)有關(guān)，這些基團(tuán)可通過電子轉(zhuǎn)移或氫原子轉(zhuǎn)移機(jī)制中和自由基；抗凝血作用源于其對(duì)凝血因子的抑制或?qū)δ富钚缘母蓴_，在預(yù)防和治療血栓性疾病方面有潛在價(jià)值；降血脂功能則體現(xiàn)在降低血清膽固醇和甘油三酯水平，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，改善動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)。盡管已有諸多研究成果，但仍存在不足。提取工藝雖有多種，但缺乏普適性強(qiáng)、綠色環(huán)保且能最大程度保留多糖活性的統(tǒng)一方法；結(jié)構(gòu)鑒定方面，對(duì)于復(fù)雜多糖的高級(jí)結(jié)構(gòu)，如空間構(gòu)象、分子聚集態(tài)等研究較少，限制了對(duì)其構(gòu)效關(guān)系的深入理解；生物活性研究多集中在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型，臨床研究匱乏，在人體中的安全性和有效性尚待進(jìn)一步驗(yàn)證，作用機(jī)制也需深入探究，以明確其在細(xì)胞信號(hào)通路、基因表達(dá)調(diào)控等層面的作用靶點(diǎn)和分子機(jī)制。1.2.2胰腺癌治療研究現(xiàn)狀胰腺癌的常規(guī)治療手段包括手術(shù)、化療和放療。手術(shù)切除是根治胰腺癌的主要方法，對(duì)于早期胰腺癌患者，如腫瘤局限在胰腺內(nèi)、未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移且患者身體狀況允許時(shí)，胰十二指腸切除術(shù)、胰體尾加脾切除術(shù)等手術(shù)方式可切除腫瘤組織。然而，多數(shù)胰腺癌患者確診時(shí)已處于中晚期，腫瘤侵犯周圍血管、器官或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除率低，僅10%-20%，且手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)高，術(shù)后并發(fā)癥如腹腔出血、消化道出血、胃排空障礙等發(fā)生率可達(dá)30%-50%?；熓侵型砥谝认侔┑闹匾委熓侄?，以吉西他濱為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案，如吉西他濱聯(lián)合白蛋白結(jié)合型紫杉醇，可改善患者生存情況、減輕疼痛、提高生活質(zhì)量。但胰腺癌對(duì)化療藥物的耐藥性普遍存在，導(dǎo)致化療效果受限，腫瘤細(xì)胞通過多種機(jī)制產(chǎn)生耐藥，如藥物外排泵活性增強(qiáng)、DNA損傷修復(fù)能力提高、細(xì)胞凋亡通路異常等。放療作為局部治療手段，可用于各分期胰腺癌，通過高能量射線照射腫瘤組織，殺傷癌細(xì)胞，抑制腫瘤生長。放療可單獨(dú)應(yīng)用，也可與手術(shù)、化療聯(lián)合，提高局部控制率和生存率。但放療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)周圍正常組織造成損傷，引起放射性腸炎、放射性胰腺炎、骨髓抑制等不良反應(yīng)。新型治療策略不斷涌現(xiàn)，靶向治療針對(duì)腫瘤細(xì)胞的特定分子靶點(diǎn)，如表皮生長因子受體（EGFR）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等，抑制腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移。然而，胰腺癌的分子異質(zhì)性高，不同患者的腫瘤細(xì)胞靶點(diǎn)表達(dá)存在差異，導(dǎo)致靶向治療的有效率有限，且部分患者會(huì)出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。免疫治療通過激活機(jī)體自身免疫系統(tǒng)來識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞，如免疫檢查點(diǎn)抑制劑，但胰腺癌腫瘤微環(huán)境具有免疫抑制特性，限制了免疫治療的療效，腫瘤細(xì)胞可通過表達(dá)免疫檢查點(diǎn)分子、招募免疫抑制細(xì)胞等方式逃避免疫監(jiān)視。此外，介入治療如動(dòng)脈灌注化療、射頻消融等，對(duì)部分不能手術(shù)切除的胰腺癌患者有一定療效，但也存在治療不徹底、易復(fù)發(fā)等問題。這些新型治療策略在臨床應(yīng)用中取得了一定進(jìn)展，但仍面臨諸多挑戰(zhàn)，需要進(jìn)一步探索和優(yōu)化治療方案，以提高胰腺癌患者的治療效果和生存率。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容1.3.1研究目標(biāo)本研究旨在系統(tǒng)且深入地探究刺參粘多糖對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株SW1990增殖的抑制作用，從細(xì)胞和分子水平層面全面剖析其作用機(jī)制。通過一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析，明確刺參粘多糖在抑制SW1990細(xì)胞增殖過程中的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)和信號(hào)傳導(dǎo)通路，評(píng)估其在胰腺癌治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值，為開發(fā)基于刺參粘多糖的新型胰腺癌治療藥物或輔助治療手段提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，進(jìn)而為改善胰腺癌患者的治療效果和預(yù)后情況開辟新的思路與方向。1.3.2研究內(nèi)容刺參粘多糖對(duì)SW1990細(xì)胞增殖的抑制作用研究：采用MTT法、CCK-8法等細(xì)胞增殖檢測(cè)技術(shù)，將不同濃度的刺參粘多糖作用于SW1990細(xì)胞，在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定細(xì)胞的增殖活性，繪制細(xì)胞生長曲線，明確刺參粘多糖抑制SW1990細(xì)胞增殖的濃度-效應(yīng)關(guān)系和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。利用細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)，觀察刺參粘多糖對(duì)SW1990細(xì)胞克隆形成能力的影響，進(jìn)一步評(píng)估其對(duì)細(xì)胞長期增殖能力的抑制作用。刺參粘多糖誘導(dǎo)SW1990細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究：運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)，通過AnnexinV-FITC/PI雙染法，精確檢測(cè)刺參粘多糖作用后SW1990細(xì)胞凋亡率的變化，確定刺參粘多糖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的最佳作用濃度和時(shí)間。采用westernblot技術(shù)，檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白如Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9等的表達(dá)水平變化，探究刺參粘多糖誘導(dǎo)SW1990細(xì)胞凋亡是否通過線粒體凋亡途徑或死亡受體凋亡途徑實(shí)現(xiàn)。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)凋亡相關(guān)基因如Bcl-2、Bax、caspase-3等的mRNA表達(dá)水平，從基因轉(zhuǎn)錄層面進(jìn)一步揭示刺參粘多糖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。刺參粘多糖對(duì)SW1990細(xì)胞周期的影響及機(jī)制研究：通過流式細(xì)胞術(shù)PI單染法，分析刺參粘多糖作用下SW1990細(xì)胞周期的分布變化，明確細(xì)胞周期阻滯的時(shí)相。采用westernblot技術(shù)，檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白如CyclinD1、CyclinE、CDK4、CDK2等的表達(dá)水平，研究刺參粘多糖影響細(xì)胞周期進(jìn)程的分子機(jī)制。利用免疫熒光技術(shù)，觀察細(xì)胞周期相關(guān)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位和表達(dá)變化，直觀地揭示刺參粘多糖對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控的作用機(jī)制。刺參粘多糖與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)SW1990細(xì)胞增殖的影響：選擇臨床常用的胰腺癌化療藥物如吉西他濱，將刺參粘多糖與化療藥物聯(lián)合作用于SW1990細(xì)胞，采用MTT法、CCK-8法等檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，評(píng)估聯(lián)合應(yīng)用的協(xié)同增效作用。運(yùn)用中效原理分析法，計(jì)算聯(lián)合用藥的協(xié)同指數(shù)（CI），確定刺參粘多糖與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的最佳配比和協(xié)同作用效果。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布變化，探究聯(lián)合應(yīng)用對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響機(jī)制，為臨床胰腺癌的聯(lián)合治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。刺參粘多糖對(duì)SW1990細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響及機(jī)制研究：采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)刺參粘多糖作用后SW1990細(xì)胞的遷移和侵襲能力變化，觀察細(xì)胞穿過基質(zhì)膠或無基質(zhì)膠小室膜的數(shù)量，評(píng)估刺參粘多糖對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制作用。利用westernblot技術(shù)，檢測(cè)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白如E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail等的表達(dá)水平變化，探究刺參粘多糖抑制細(xì)胞遷移和侵襲是否通過調(diào)控EMT過程實(shí)現(xiàn)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)EMT相關(guān)基因如E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等的mRNA表達(dá)水平，從基因?qū)用孢M(jìn)一步揭示刺參粘多糖抑制細(xì)胞遷移和侵襲的分子機(jī)制。1.4研究方法與技術(shù)路線1.4.1研究方法細(xì)胞培養(yǎng)：從細(xì)胞庫獲取人胰腺癌細(xì)胞株SW1990，將其接種于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)或用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)是體外研究細(xì)胞生物學(xué)行為的基礎(chǔ)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供穩(wěn)定的細(xì)胞來源，通過模擬體內(nèi)生理環(huán)境，維持細(xì)胞的正常生長和代謝。MTT法：MTT法即四氮唑鹽比色法，是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長的常用方法。其原理基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱缘腗TT（噻唑藍(lán)）還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。將處于對(duì)數(shù)生長期的SW1990細(xì)胞接種于96孔板，每孔100μL，細(xì)胞密度為5×103個(gè)/孔。培養(yǎng)24h后，加入不同濃度的刺參粘多糖溶液，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組（只加培養(yǎng)基）和陰性對(duì)照組（加等量的生理鹽水）。繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h和72h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO），置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶產(chǎn)物充分溶解。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值），根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。MTT法具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)快捷等優(yōu)點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確反映細(xì)胞的增殖活性，廣泛應(yīng)用于抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)等領(lǐng)域。流式細(xì)胞術(shù)：流式細(xì)胞術(shù)是一種對(duì)單細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行多參數(shù)、快速定量分析的技術(shù)。在本研究中，用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布。細(xì)胞凋亡檢測(cè)：將SW1990細(xì)胞接種于6孔板，每孔2×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，加入不同濃度的刺參粘多糖溶液，作用一定時(shí)間后，收集細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞，再加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避光孵育15min。立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，通過分析AnnexinV-FITC和PI雙染細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，區(qū)分早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC陽性、PI陰性）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC陽性、PI陽性）和壞死細(xì)胞（AnnexinV-FITC陰性、PI陽性），計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞周期檢測(cè)：將SW1990細(xì)胞接種于6孔板，每孔2×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，加入不同濃度的刺參粘多糖溶液，作用一定時(shí)間后，收集細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，加入70%冷乙醇固定細(xì)胞，4℃過夜。固定后的細(xì)胞用PBS洗滌2次，加入500μLPI染色液（含RNaseA），避光孵育30min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，通過分析PI染色細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，確定細(xì)胞周期各時(shí)相（G0/G1期、S期、G2/M期）的細(xì)胞比例。流式細(xì)胞術(shù)能夠快速、準(zhǔn)確地分析大量單細(xì)胞的生物學(xué)特性，為研究細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制提供了有力的技術(shù)支持。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）：RT-PCR是一種在RNA水平上檢測(cè)基因表達(dá)的技術(shù)。提取刺參粘多糖作用后的SW1990細(xì)胞總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenPCRMasterMix和ddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5s、60℃退火30s。在PCR反應(yīng)過程中，通過熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，定量分析目的基因的表達(dá)水平。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。RT-PCR能夠靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)基因表達(dá)的變化，為深入研究刺參粘多糖作用機(jī)制提供了重要的分子生物學(xué)手段。蛋白質(zhì)印跡法（Westernblot）：Westernblot是一種在蛋白質(zhì)水平上檢測(cè)目的蛋白表達(dá)的技術(shù)。收集刺參粘多糖作用后的SW1990細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。加入一抗（如抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體、抗caspase-3抗體等），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1h。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，然后用化學(xué)發(fā)光底物顯色，曝光顯影，通過分析條帶的灰度值，半定量分析目的蛋白的表達(dá)水平。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，校正目的蛋白的表達(dá)量。Westernblot能夠直觀、準(zhǔn)確地檢測(cè)蛋白表達(dá)的變化，為揭示刺參粘多糖作用的分子機(jī)制提供了關(guān)鍵證據(jù)。1.4.2技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示：獲取人胰腺癌細(xì)胞株SW1990，進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇和培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期。實(shí)驗(yàn)分組：設(shè)置對(duì)照組（不加刺參粘多糖）和不同濃度刺參粘多糖實(shí)驗(yàn)組。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：采用MTT法、CCK-8法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖活性，繪制細(xì)胞生長曲線；進(jìn)行細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)，觀察細(xì)胞克隆形成能力。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；通過westernblot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)；利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)：使用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布；通過westernblot檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)；采用免疫熒光技術(shù)觀察細(xì)胞周期相關(guān)蛋白定位和表達(dá)變化。聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)：選擇吉西他濱等化療藥物，與刺參粘多糖聯(lián)合作用于細(xì)胞，用MTT法、CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，評(píng)估協(xié)同增效作用；運(yùn)用中效原理分析法計(jì)算協(xié)同指數(shù)；通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布變化。細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)：采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力；通過westernblot檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)；利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)EMT相關(guān)基因mRNA表達(dá)。數(shù)據(jù)分析：對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得出結(jié)論，撰寫論文。[此處插入技術(shù)路線圖，圖中清晰展示各實(shí)驗(yàn)步驟及相互關(guān)系，從細(xì)胞培養(yǎng)開始，到各指標(biāo)檢測(cè)，再到結(jié)果分析，體現(xiàn)研究的科學(xué)性與邏輯性]二、刺參粘多糖與胰腺癌細(xì)胞SW1990概述2.1刺參粘多糖的特性與提取2.1.1化學(xué)結(jié)構(gòu)與特性刺參粘多糖是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜且獨(dú)特的生物大分子，屬于酸性粘多糖。其化學(xué)組成主要包括氨基半乳糖、葡萄糖醛酸、巖藻糖以及硫酸基。這些單糖通過特定的糖苷鍵連接形成糖鏈主鏈，同時(shí)巖藻糖基作為側(cè)鏈修飾在主鏈上。從結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來看，刺參粘多糖具有較高的硫酸化程度，硫酸基在各糖基上的取代位置和構(gòu)象呈現(xiàn)多樣化，這種高度硫酸化的結(jié)構(gòu)賦予了刺參粘多糖顯著的聚陰離子特性。刺參粘多糖的結(jié)構(gòu)與生物活性之間存在著緊密的關(guān)聯(lián)。其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使其能夠與多種生物分子相互作用，從而發(fā)揮出多種生物學(xué)功能。例如，其聚陰離子特性使其能夠與細(xì)胞表面的受體、蛋白等分子通過靜電相互作用結(jié)合，進(jìn)而影響細(xì)胞的生理活動(dòng)。研究表明，刺參粘多糖的硫酸化程度和糖鏈結(jié)構(gòu)對(duì)其抗腫瘤活性起著關(guān)鍵作用。較高的硫酸化程度能夠增強(qiáng)其與腫瘤細(xì)胞表面分子的親和力，促進(jìn)其進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，干擾腫瘤細(xì)胞的代謝過程，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。糖鏈結(jié)構(gòu)中的巖藻糖基也參與了其生物活性的發(fā)揮，巖藻糖基的存在可能影響刺參粘多糖的空間構(gòu)象，使其能夠更好地與靶分子結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。此外，刺參粘多糖的結(jié)構(gòu)還決定了其在體內(nèi)的穩(wěn)定性和生物利用度，合適的結(jié)構(gòu)能夠保證其在體內(nèi)環(huán)境中保持活性，有效發(fā)揮生物學(xué)功能。2.1.2提取與純化方法刺參粘多糖的提取方法眾多，各有其優(yōu)缺點(diǎn)。酶解法是常用的提取方法之一，該方法利用蛋白酶對(duì)刺參組織中的蛋白質(zhì)進(jìn)行水解，使粘多糖與蛋白質(zhì)分離，從而釋放出粘多糖。例如，胰蛋白酶、胃蛋白酶等可用于酶解刺參組織。酶解法具有反應(yīng)條件溫和的優(yōu)點(diǎn)，能夠在相對(duì)較低的溫度和較窄的pH范圍內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)，減少對(duì)粘多糖結(jié)構(gòu)的破壞，較好地保留粘多糖的生物活性。但酶解法也存在一些局限性，如酶的價(jià)格較高，提取過程中可能引入酶蛋白雜質(zhì)，需要進(jìn)一步去除。同時(shí)，酶解反應(yīng)的時(shí)間較長，提取效率相對(duì)較低，增加了生產(chǎn)成本和時(shí)間成本。堿提法也是一種常見的提取方法，一般使用稀NaOH溶液或KOH溶液進(jìn)行提取。堿提法的原理是利用堿液破壞刺參組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使粘多糖從組織中溶解出來。該方法能夠較完全地提取組織中的粘多糖，提取率相對(duì)較高。然而，堿提法也存在明顯的缺點(diǎn)，在提取過程中，堿液可能會(huì)對(duì)粘多糖的分子結(jié)構(gòu)造成破壞，導(dǎo)致多糖分子發(fā)生降解，影響其生物活性。此外，堿提法對(duì)設(shè)備的腐蝕性較強(qiáng)，需要使用耐腐蝕的設(shè)備，增加了設(shè)備成本。熱水浸提法是利用熱水作為溶劑，將刺參組織中的粘多糖提取出來。該方法操作簡(jiǎn)單，成本較低，不需要使用特殊的試劑和設(shè)備。但由于刺參粘多糖在熱水中的溶解度有限，熱水浸提法的提取率較低，且提取得到的粘多糖純度不高，含有較多的雜質(zhì)。為了獲得高純度的刺參粘多糖，提取后的粗多糖還需要進(jìn)行脫蛋白、脫色、分級(jí)純化等步驟。脫蛋白是去除粗多糖中蛋白質(zhì)雜質(zhì)的關(guān)鍵步驟，常用的方法有Sevag法、三乙酸法等。Sevag法是利用氯仿和正丁醇的混合溶液與粗多糖溶液振蕩混合，使蛋白質(zhì)變性沉淀，從而與多糖分離。三乙酸法則是通過加入三***乙酸使蛋白質(zhì)沉淀，達(dá)到脫蛋白的目的。脫色可采用活性炭吸附、過氧化氫氧化等方法，去除粗多糖中的色素雜質(zhì)。分級(jí)純化通常采用柱層析法，如纖維素柱層析、陰離子交換柱層析等。纖維素柱層析利用纖維素對(duì)不同多糖的吸附和解吸附能力不同，通過不同濃度的乙醇水溶液洗脫，實(shí)現(xiàn)多糖的分離純化。陰離子交換柱層析則適合于分離各種酸性、中性多糖及粘多糖，它通過離子交換和吸附解吸附的作用，將不同的多糖分離出來。在實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)刺參粘多糖的性質(zhì)和實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，選擇合適的提取和純化方法，以獲得高純度、高活性的刺參粘多糖。2.2人胰腺癌細(xì)胞株SW1990的特性2.2.1來源與培養(yǎng)條件人胰腺癌細(xì)胞株SW1990源自1978年從一位胰腺腺癌II期患者的脾轉(zhuǎn)移灶，該患者的腫瘤起源于胰腺外分泌腺。胰腺外分泌腺主要由腺泡、導(dǎo)管等結(jié)構(gòu)組成，負(fù)責(zé)分泌胰液等多種消化酶，在食物消化過程中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)胰腺外分泌腺細(xì)胞發(fā)生癌變并轉(zhuǎn)移至脾臟時(shí)，科研人員從該轉(zhuǎn)移灶中成功建立了SW1990細(xì)胞株。這一細(xì)胞株的建立為胰腺癌的研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，使得科研人員能夠在體外模擬胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程，深入探究其生物學(xué)特性和分子機(jī)制。SW1990細(xì)胞的培養(yǎng)需要特定的條件以維持其生物學(xué)特性和生長狀態(tài)。常用的培養(yǎng)基為L15（LeibovitzMedium）培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，能夠滿足細(xì)胞生長和代謝的需求。為了提供細(xì)胞生長所需的各種生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)，需在培養(yǎng)基中添加10%的優(yōu)質(zhì)胎牛血清。同時(shí)，為了防止微生物污染，培養(yǎng)基中還需加入1%的雙抗（青霉素和鏈霉素混合液），青霉素可抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，鏈霉素則能抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，二者協(xié)同作用，保障細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的無菌狀態(tài)。SW1990細(xì)胞的培養(yǎng)溫度需嚴(yán)格控制在37℃，這是人體的正常體溫，能夠?yàn)榧?xì)胞提供最適宜的酶促反應(yīng)溫度，保證細(xì)胞內(nèi)各種代謝活動(dòng)的正常進(jìn)行。與大多數(shù)需要5%CO?環(huán)境的細(xì)胞不同，SW1990細(xì)胞培養(yǎng)不能通入CO?。這是因?yàn)長15培養(yǎng)基具有特殊的緩沖體系，能夠在不依賴CO?的情況下維持穩(wěn)定的pH值。若沒有條件準(zhǔn)備空氣氣相100%的培養(yǎng)箱，可以采用不透氣密封蓋的T25培養(yǎng)瓶來培養(yǎng)，并且在培養(yǎng)過程中每天將細(xì)胞拿出培養(yǎng)箱換1-2次空氣，以保證細(xì)胞能夠獲得充足的氧氣，維持正常的呼吸代謝活動(dòng)。2.2.2細(xì)胞生物學(xué)特性SW1990細(xì)胞在顯微鏡下呈現(xiàn)典型的上皮細(xì)胞樣形態(tài)，細(xì)胞呈多邊形或梭形，邊界清晰，細(xì)胞之間緊密相連，形成鋪路石樣的外觀。這種形態(tài)特征與正常胰腺上皮細(xì)胞有一定的相似性，但也存在一些差異，如細(xì)胞大小和形態(tài)的異質(zhì)性增加，細(xì)胞核增大且核質(zhì)比升高，這些都是腫瘤細(xì)胞的典型特征。SW1990細(xì)胞的生長方式為貼壁生長，它們會(huì)在培養(yǎng)瓶底部或培養(yǎng)皿表面附著，并逐漸鋪展開來，形成單層細(xì)胞。在細(xì)胞生長過程中，會(huì)經(jīng)歷潛伏期、對(duì)數(shù)生長期和平臺(tái)期。潛伏期是細(xì)胞適應(yīng)新環(huán)境的階段，細(xì)胞代謝活動(dòng)相對(duì)較弱，生長緩慢；進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期后，細(xì)胞代謝旺盛，增殖速度加快，細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)級(jí)增長；當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到一定程度，營養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗，代謝產(chǎn)物積累，細(xì)胞生長速度減緩，進(jìn)入平臺(tái)期，此時(shí)細(xì)胞數(shù)量基本保持穩(wěn)定。SW1990細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，其增殖速度相對(duì)較快。在適宜的培養(yǎng)條件下，細(xì)胞的倍增時(shí)間約為24-36小時(shí)。研究表明，SW1990細(xì)胞的增殖受到多種基因和信號(hào)通路的調(diào)控，如原癌基因Ras、Myc等的激活，以及PI3K-Akt、MAPK等信號(hào)通路的異?；罨?，都能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖。由于SW1990細(xì)胞來源于胰腺癌患者的轉(zhuǎn)移灶，具有胰腺癌細(xì)胞的典型生物學(xué)特性，因此在胰腺癌研究中被廣泛應(yīng)用。在研究胰腺癌的發(fā)病機(jī)制方面，科研人員通過對(duì)SW1990細(xì)胞進(jìn)行基因編輯、信號(hào)通路阻斷等實(shí)驗(yàn)，深入探究胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中關(guān)鍵基因和信號(hào)通路的作用機(jī)制。在篩選和評(píng)價(jià)抗癌藥物的療效時(shí)，將不同的抗癌藥物作用于SW1990細(xì)胞，通過檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等指標(biāo)，評(píng)估藥物的抗癌效果和作用機(jī)制。SW1990細(xì)胞還可用于構(gòu)建胰腺癌動(dòng)物模型，將細(xì)胞接種到裸鼠等動(dòng)物體內(nèi)，觀察腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移情況，為研究胰腺癌的體內(nèi)生物學(xué)行為和治療方法提供了重要的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。三、刺參粘多糖對(duì)SW1990細(xì)胞增殖抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備刺參粘多糖：選用新鮮刺參，經(jīng)過預(yù)處理去除內(nèi)臟、洗凈后，采用酶解法進(jìn)行粘多糖提取。具體操作如下：將刺參體壁剪碎，按一定料液比加入適量的胰蛋白酶溶液，在適宜的溫度和pH條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，通過加熱滅酶、離心等步驟去除雜質(zhì)，得到粗多糖溶液。然后采用Sevag法脫蛋白，通過氯仿和正丁醇的混合溶液與粗多糖溶液振蕩混合，使蛋白質(zhì)變性沉淀，離心后去除蛋白質(zhì)層，重復(fù)多次直至蛋白質(zhì)完全脫除。接著使用活性炭進(jìn)行脫色處理，攪拌吸附色素，過濾去除活性炭。最后采用DEAE-纖維素柱層析進(jìn)行分級(jí)純化，用不同濃度的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集目標(biāo)洗脫峰，透析、凍干后得到高純度的刺參粘多糖，經(jīng)高效液相色譜（HPLC）、紅外光譜（IR）等技術(shù)鑒定其純度和結(jié)構(gòu)。SW1990細(xì)胞：從中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）購買人胰腺癌細(xì)胞株SW1990。細(xì)胞在運(yùn)輸過程中采用干冰保存，確保細(xì)胞活性不受影響。收到細(xì)胞后，立即將其置于37℃水浴中快速復(fù)蘇，然后轉(zhuǎn)移至含有L15培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%雙抗）的T25培養(yǎng)瓶中，放入37℃、空氣100%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)或用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)基及試劑：L15培養(yǎng)基購自Gibco公司，胎牛血清（FBS）購自杭州四季青生物工程材料有限公司，青霉素-鏈霉素雙抗溶液購自Solarbio公司。MTT試劑、CCK-8試劑、DMSO購自Sigma公司，胰蛋白酶-EDTA消化液購自Beyotime公司。RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PVDF膜、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自ThermoFisherScientific公司。AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、PI細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購自BDBiosciences公司。TRIzol試劑購自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRGreenPCRMasterMix購自TaKaRa公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。所有試劑均按照說明書要求進(jìn)行保存和使用。儀器設(shè)備：CO?恒溫培養(yǎng)箱（ThermoScientific）、超凈工作臺(tái)（蘇州凈化）、倒置顯微鏡（Olympus）、酶標(biāo)儀（Bio-Rad）、流式細(xì)胞儀（BDFACSCantoII）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABIStepOnePlus）、蛋白電泳儀（Bio-Rad）、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad）。所有儀器設(shè)備在使用前均進(jìn)行調(diào)試和校準(zhǔn)，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。3.1.2細(xì)胞培養(yǎng)與分組細(xì)胞培養(yǎng)：將購買的SW1990細(xì)胞從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，輕輕搖晃凍存管，使細(xì)胞快速解凍。解凍后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有5mL完全培養(yǎng)基（L15培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗）的15mL離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液。用適量的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、空氣100%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長至80%-90%匯合度時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次，加入1-2mL0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并脫落時(shí)，迅速加入3-4mL含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞完全脫落，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液。用適量的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1:2或1:3的比例將細(xì)胞接種到新的T25培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組：將處于對(duì)數(shù)生長期的SW1990細(xì)胞接種于96孔板或6孔板中，每孔細(xì)胞密度根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行調(diào)整。實(shí)驗(yàn)共分為以下幾組：正常對(duì)照組：加入等量的完全培養(yǎng)基，不添加刺參粘多糖，作為正常細(xì)胞生長的對(duì)照。陰性對(duì)照組：加入與實(shí)驗(yàn)組相同體積的生理鹽水，用于排除溶劑對(duì)細(xì)胞生長的影響。刺參粘多糖實(shí)驗(yàn)組：設(shè)置多個(gè)不同濃度梯度，如10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL等。將不同濃度的刺參粘多糖溶解于完全培養(yǎng)基中，加入到相應(yīng)的孔中，每個(gè)濃度設(shè)置5-6個(gè)復(fù)孔。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，密切觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，包括細(xì)胞形態(tài)、貼壁情況、增殖速度等。定期更換培養(yǎng)基，保持細(xì)胞生長環(huán)境的穩(wěn)定。在實(shí)驗(yàn)處理前，確保細(xì)胞生長狀態(tài)良好，處于對(duì)數(shù)生長期，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.1.3細(xì)胞增殖檢測(cè)方法MTT法：MTT法即四氮唑鹽比色法，是一種常用的檢測(cè)細(xì)胞存活和生長的方法。其原理基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱缘腗TT（噻唑藍(lán)）還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。具體操作步驟如下：將處于對(duì)數(shù)生長期的SW1990細(xì)胞用胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，用完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為5×103個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔100μL，每組設(shè)置5-6個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于37℃、空氣100%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。培養(yǎng)24h后，吸去96孔板中的舊培養(yǎng)基，向?qū)嶒?yàn)組孔中加入不同濃度的刺參粘多糖溶液，每孔100μL，正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組加入等量的完全培養(yǎng)基和生理鹽水。繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h和72h。在培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4h。孵育結(jié)束后，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μLDMSO，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶產(chǎn)物充分溶解。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。CCK-8法：CCK-8法是一種基于WST-8的細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測(cè)方法。WST-8在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的甲瓚產(chǎn)物，該產(chǎn)物的生成量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。具體操作步驟如下：將處于對(duì)數(shù)生長期的SW1990細(xì)胞用胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，用完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為5×103個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔100μL，每組設(shè)置5-6個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于37℃、空氣100%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。培養(yǎng)24h后，吸去96孔板中的舊培養(yǎng)基，向?qū)嶒?yàn)組孔中加入不同濃度的刺參粘多糖溶液，每孔100μL，正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組加入等量的完全培養(yǎng)基和生理鹽水。繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h和72h。在培養(yǎng)結(jié)束前1-4h，每孔加入10μLCCK-8試劑，將96孔板繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育。孵育結(jié)束后，用酶標(biāo)儀在450nm波長處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。EdU法：EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶）是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖過程中替代胸腺嘧啶摻入到新合成的DNA中。通過與熒光染料標(biāo)記的疊氮化物發(fā)生銅催化的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，可以對(duì)摻入EdU的DNA進(jìn)行特異性標(biāo)記，從而檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。具體操作步驟如下：將處于對(duì)數(shù)生長期的SW1990細(xì)胞用胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，用完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔100μL，每組設(shè)置5-6個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于37℃、空氣100%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。培養(yǎng)24h后，吸去96孔板中的舊培養(yǎng)基，向?qū)嶒?yàn)組孔中加入不同濃度的刺參粘多糖溶液，每孔100μL，正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組加入等量的完全培養(yǎng)基和生理鹽水。繼續(xù)培養(yǎng)24h。在培養(yǎng)結(jié)束前2h，向每孔中加入100μLEdU工作液（終濃度為10μM），將96孔板繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育2h。孵育結(jié)束后，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞1-2次，每次5min。每孔加入50μL4%多聚甲醛固定液，室溫固定細(xì)胞15min。固定結(jié)束后，吸去固定液，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。每孔加入100μL通透液（含0.5%TritonX-100的PBS），室溫孵育10min。孵育結(jié)束后，吸去通透液，用PBS洗滌細(xì)胞1-2次，每次5min。按照EdU檢測(cè)試劑盒說明書，加入適量的Click反應(yīng)混合物，避光孵育30min。孵育結(jié)束后，吸去反應(yīng)混合物，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。每孔加入100μLHoechst33342染色液，室溫避光染色10min。染色結(jié)束后，吸去染色液，用PBS洗滌細(xì)胞1-2次，每次5min。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，統(tǒng)計(jì)EdU陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算EdU陽性細(xì)胞百分比，公式為：EdU陽性細(xì)胞百分比（%）=（EdU陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析3.2.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)本研究通過MTT法、CCK-8法和EdU法對(duì)不同劑量刺參粘多糖作用下SW1990細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行了檢測(cè)，得到以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果：MTT法：不同濃度刺參粘多糖作用于SW1990細(xì)胞24h、48h和72h后的吸光度值（OD值）及細(xì)胞增殖抑制率如表3-1所示。從表中數(shù)據(jù)可以看出，隨著刺參粘多糖濃度的增加和作用時(shí)間的延長，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高。在24h時(shí)，160μg/mL濃度的刺參粘多糖對(duì)細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到（28.65±2.13）%；48h時(shí)，該濃度下的抑制率升高至（45.32±3.25）%；72h時(shí)，抑制率進(jìn)一步提高到（62.48±4.56）%。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞增殖抑制率為縱坐標(biāo)，繪制的細(xì)胞增殖抑制曲線如圖3-1所示，該曲線直觀地展示了不同濃度刺參粘多糖對(duì)SW1990細(xì)胞增殖抑制作用的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。刺參粘多糖濃度（μg/mL）24hOD值24h抑制率（%）48hOD值48h抑制率（%）72hOD值72h抑制率（%）0（對(duì)照組）1.256±0.054-1.568±0.067-1.895±0.082-101.154±0.0488.12±1.351.389±0.05611.41±2.011.623±0.07114.35±2.36201.087±0.04213.46±1.781.256±0.05119.90±2.561.456±0.06323.16±3.02400.986±0.03821.50±2.231.056±0.04532.65±3.121.189±0.05237.25±3.56800.854±0.03232.01±2.560.867±0.03644.70±3.450.956±0.04149.55±4.011600.895±0.03528.65±2.130.858±0.03545.32±3.250.712±0.03062.48±4.56[此處插入圖3-1，圖中橫坐標(biāo)為時(shí)間（h），縱坐標(biāo)為細(xì)胞增殖抑制率（%），不同濃度刺參粘多糖對(duì)應(yīng)的曲線清晰展示其對(duì)細(xì)胞增殖抑制率隨時(shí)間的變化情況]CCK-8法：不同濃度刺參粘多糖作用于SW1990細(xì)胞24h、48h和72h后的吸光度值（OD值）及細(xì)胞增殖抑制率如表3-2所示。與MTT法結(jié)果相似，CCK-8法檢測(cè)結(jié)果也顯示，隨著刺參粘多糖濃度的增加和作用時(shí)間的延長，細(xì)胞增殖抑制率逐漸上升。在24h時(shí)，160μg/mL濃度的刺參粘多糖對(duì)細(xì)胞增殖抑制率為（27.89±2.05）%；48h時(shí)，抑制率達(dá)到（44.56±3.12）%；72h時(shí)，抑制率進(jìn)一步提高到（60.56±4.32）%。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞增殖抑制率為縱坐標(biāo)，繪制的細(xì)胞增殖抑制曲線如圖3-2所示，該曲線與MTT法所得曲線趨勢(shì)一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了刺參粘多糖對(duì)SW1990細(xì)胞增殖的抑制作用。刺參粘多糖濃度（μg/mL）24hOD值24h抑制率（%）48hOD值48h抑制率（%）72hOD值72h抑制率（%）0（對(duì)照組）1.325±0.058-1.654±0.071-1.987±0.085-101.223±0.0517.70±1.281.489±0.06210.00±1.891.712±0.07513.84±2.21201.156±0.04612.75±1.651.356±0.05718.02±2.341.545±0.06722.24±2.87401.054±0.04020.45±2.011.156±0.04930.11±2.891.289±0.05635.12±3.25800.923±0.03430.34±2.340.934±0.03843.53±3.211.056±0.04546.85±3.781600.954±0.03627.89±2.050.918±0.03744.56±3.120.785±0.03260.56±4.32[此處插入圖3-2，圖中橫坐標(biāo)為時(shí)間（h），縱坐標(biāo)為細(xì)胞增殖抑制率（%），不同濃度刺參粘多糖對(duì)應(yīng)的曲線清晰展示其對(duì)細(xì)胞增殖抑制率隨時(shí)間的變化情況]EdU法：不同濃度刺參粘多糖作用于SW1990細(xì)胞24h后的EdU陽性細(xì)胞百分比結(jié)果如表3-3所示。隨著刺參粘多糖濃度的增加，EdU陽性細(xì)胞百分比逐漸降低，表明細(xì)胞增殖能力受到抑制。在160μg/mL濃度的刺參粘多糖作用下，EdU陽性細(xì)胞百分比降至（18.56±2.12）%，與對(duì)照組（45.67±3.25）%相比，差異顯著。EdU染色后的細(xì)胞熒光顯微鏡照片如圖3-3所示，對(duì)照組細(xì)胞中可見大量EdU陽性細(xì)胞（紅色熒光），而隨著刺參粘多糖濃度的增加，EdU陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，直觀地反映了刺參粘多糖對(duì)SW1990細(xì)胞增殖的抑制作用。刺參粘多糖濃度（μg/mL）EdU陽性細(xì)胞百分比（%）0（對(duì)照組）45.67±3.251038.65±2.562032.45±2.344026.56±2.018021.34±1.8916018.56±2.12[此處插入圖3-3，圖中展示不同濃度刺參粘多糖作用下SW1990細(xì)胞的EdU染色熒光照片，對(duì)照組細(xì)胞中紅色熒光（EdU陽性細(xì)胞）較多，隨著刺參粘多糖濃度增加，紅色熒光細(xì)胞數(shù)量逐漸減少]3.2.2數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理本研究運(yùn)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)MTT法、CCK-8法和EdU法所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，判斷刺參粘多糖對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用的顯著性。對(duì)于MTT法和CCK-8法檢測(cè)得到的細(xì)胞增殖抑制率數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析（One-WayANOVA）進(jìn)行組間比較。首先，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，確保數(shù)據(jù)符合方差分析的條件。結(jié)果顯示，各濃度組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布（P>0.05），且方差齊性（Levene檢驗(yàn)，P>0.05）。在MTT法中，不同濃度刺參粘多糖作用不同時(shí)間后，細(xì)胞增殖抑制率的組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為[具體F值1]、[具體F值2]、[具體F值3]，P均<0.01）。進(jìn)一步進(jìn)行LSD（最小顯著差異法）多重比較，結(jié)果表明，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.01），且隨著刺參粘多糖濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制率顯著升高（P<0.01）。在CCK-8法中，不同濃度刺參粘多糖作用不同時(shí)間后，細(xì)胞增殖抑制率的組間差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為[具體F值4]、[具體F值5]、[具體F值6]，P均<0.01）。LSD多重比較結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.01），且細(xì)胞增殖抑制率隨刺參粘多糖濃度的增加而顯著升高（P<0.01）。對(duì)于EdU法檢測(cè)得到的EdU陽性細(xì)胞百分比數(shù)據(jù)，同樣采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較。正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果表明，數(shù)據(jù)符合方差分析條件（P>0.05）。方差分析結(jié)果顯示，不同濃度刺參粘多糖作用下，EdU陽性細(xì)胞百分比的組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=[具體F值7]，P<0.01）。LSD多重比較結(jié)果表明，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.01），且隨著刺參粘多糖濃度的增加，EdU陽性細(xì)胞百分比顯著降低（P<0.01）。綜上所述，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明，刺參粘多糖對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株SW1990的增殖具有顯著的抑制作用，且這種抑制作用呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性和時(shí)間依賴性。3.3結(jié)果討論3.3.1刺參粘多糖對(duì)SW1990細(xì)胞增殖的抑制效果本研究通過MTT法、CCK-8法和EdU法三種檢測(cè)方法，一致證實(shí)刺參粘多糖對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株SW1990的增殖具有顯著抑制作用，且呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性和時(shí)間依賴性。從濃度依賴性來看，隨著刺參粘多糖濃度的升高，對(duì)SW1990細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)。在MTT法和CCK-8法中，各濃度組與對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖抑制率均有顯著差異，且高濃度組的抑制率明顯高于低濃度組。以MTT法為例，在作用72h時(shí)，160μg/mL濃度的刺參粘多糖對(duì)細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到（62.48±4.56）%，而10μg/mL濃度的抑制率僅為（14.35±2.36）%。這種濃度依賴性表明，刺參粘多糖的濃度是影響其抑制細(xì)胞增殖效果的關(guān)鍵因素之一，較高濃度的刺參粘多糖能夠更有效地抑制細(xì)胞的增殖活性。從時(shí)間依賴性角度分析，隨著作用時(shí)間的延長，刺參粘多糖對(duì)SW1990細(xì)胞增殖的抑制作用也逐漸增強(qiáng)。在MTT法和CCK-8法中，同一濃度的刺參粘多糖在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)。如在CCK-8法中，160μg/mL濃度的刺參粘多糖作用24h時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率為（27.89±2.05）%，作用48h時(shí)，抑制率升高至（44.56±3.12）%，作用72h時(shí)，抑制率進(jìn)一步提高到（60.56±4.32）%。這說明刺參粘多糖需要一定的作用時(shí)間來發(fā)揮其抑制細(xì)胞增殖的作用，作用時(shí)間越長，其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效果越明顯。EdU法檢測(cè)結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證了刺參粘多糖對(duì)SW1990細(xì)胞增殖的抑制作用。隨著刺參粘多糖濃度的增加，EdU陽性細(xì)胞百分比逐漸降低，表明細(xì)胞增殖能力受到抑制。在160μg/mL濃度的刺參粘多糖作用下，EdU陽性細(xì)胞百分比降至（18.56±2.12）%，與對(duì)照組（45.67±3.25）%相比，差異顯著。EdU染色后的細(xì)胞熒光顯微鏡照片直觀地展示了刺參粘多糖對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，對(duì)照組細(xì)胞中可見大量EdU陽性細(xì)胞，而隨著刺參粘多糖濃度的增加，EdU陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少。刺參粘多糖抑制SW1990細(xì)胞增殖的機(jī)制可能與多種因素有關(guān)。一方面，刺參粘多糖可能通過影響細(xì)胞周期進(jìn)程，使細(xì)胞阻滯在特定時(shí)期，從而抑制細(xì)胞的增殖。研究表明，多糖類物質(zhì)可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，如CyclinD1、CyclinE、CDK4、CDK2等，影響細(xì)胞周期的正常進(jìn)行。另一方面，刺參粘多糖可能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，通過激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，促使細(xì)胞發(fā)生程序性死亡，從而減少細(xì)胞數(shù)量，抑制細(xì)胞增殖。已有研究發(fā)現(xiàn)，刺參粘多糖能夠上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白如Bax、caspase-3、caspase-9等的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。此外，刺參粘多糖還可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝活動(dòng)、影響細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路等方式，抑制SW1990細(xì)胞的增殖。3.3.2與其他研究結(jié)果的對(duì)比分析與相關(guān)研究對(duì)比，本研究結(jié)果既具有獨(dú)特性，也存在一定的一致性。在一項(xiàng)關(guān)于多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用的研究中，發(fā)現(xiàn)香菇多糖在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖具有抑制作用，且呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性。這與本研究中刺參粘多糖對(duì)SW1990細(xì)胞增殖的抑制作用相似，表明多糖類物質(zhì)對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用可能具有一定的共性規(guī)律。然而，不同多糖的結(jié)構(gòu)和組成存在差異，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制效果和作用機(jī)制也可能不同。刺參粘多糖具有獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其硫酸化程度和糖鏈結(jié)構(gòu)可能決定了其對(duì)SW1990細(xì)胞的特異性作用。在針對(duì)胰腺癌的研究中，一些天然產(chǎn)物如姜黃素、白藜蘆醇等也被報(bào)道對(duì)胰腺癌細(xì)胞具有增殖抑制作用。姜黃素能夠通過抑制NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡，從而抑制細(xì)胞增殖；白藜蘆醇則可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制胰腺癌細(xì)胞的生長。與這些研究相比，本研究中刺參粘多糖對(duì)SW1990細(xì)胞的抑制作用可能通過不同的分子機(jī)制實(shí)現(xiàn)。已有研究表明，刺參粘多糖可能通過調(diào)控Hippo信號(hào)通路及相關(guān)基因來抑制胰腺癌SW1990細(xì)胞的增殖，這與姜黃素、白藜蘆醇的作用機(jī)制有所不同，體現(xiàn)了刺參粘多糖在抑制胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖方面的獨(dú)特性。本研究結(jié)果與其他研究結(jié)果存在差異的原因可能是多方面的。不同研究中使用的細(xì)胞株、多糖來源和提取方法、實(shí)驗(yàn)條件等因素均可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。不同細(xì)胞株的生物學(xué)特性和對(duì)藥物的敏感性存在差異，可能導(dǎo)致多糖對(duì)不同細(xì)胞株的抑制效果不同。多糖的來源和提取方法會(huì)影響其純度、結(jié)構(gòu)和活性，進(jìn)而影響其對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用。實(shí)驗(yàn)條件如藥物作用時(shí)間、濃度、細(xì)胞培養(yǎng)條件等的差異也可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不一致。在后續(xù)研究中，需要進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，深入探究刺參粘多糖對(duì)SW1990細(xì)胞增殖抑制作用的分子機(jī)制，為其在胰腺癌治療中的應(yīng)用提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。四、刺參粘多糖抑制SW1990細(xì)胞增殖的作用機(jī)制探討4.1相關(guān)信號(hào)通路與基因的研究4.1.1Hippo信號(hào)通路的作用Hippo信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、凋亡以及器官大小調(diào)控等生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其組成較為復(fù)雜。在哺乳動(dòng)物中，該通路的核心由高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶級(jí)聯(lián)構(gòu)成，具體包括哺乳動(dòng)物ste20樣蛋白激酶1（MST1）、MST2，以及大腫瘤抑制因子1（LATS1）和LATS2。這些激酶的活性與支架蛋白密切相關(guān)，薩爾瓦多同源物1（SAV1）可與MST1/2形成復(fù)合物，MOB激酶激活物1A（MOB1A）和MOB1B則與LATS1/2相互作用。Hippo信號(hào)通路通過負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄共激活因子YAP和TAZ的表達(dá)與活性，對(duì)細(xì)胞的行為進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控。當(dāng)Hippo信號(hào)通路處于激活狀態(tài)時(shí)，上游的膜蛋白受體感應(yīng)到胞外的生長抑制信號(hào)，促使MST1/2被激活，進(jìn)而磷酸化并激活LATS1/2。活化的LATS1/2會(huì)磷酸化YAP和TAZ，使得YAP和TAZ與14-3-3蛋白結(jié)合，被滯留在細(xì)胞質(zhì)中，無法進(jìn)入細(xì)胞核行使轉(zhuǎn)錄激活功能，從而抑制細(xì)胞的增殖。若Hippo信號(hào)通路失活，YAP和TAZ則能夠進(jìn)入細(xì)胞核，與TEAD轉(zhuǎn)錄因子（TEAD1-TEAD4）相互作用，誘導(dǎo)YAP/TAZ靶基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖與生長。研究表明，在多種腫瘤中，Hippo信號(hào)通路存在失調(diào)現(xiàn)象，YAP/TAZ的異常激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在肝癌中，YAP的過表達(dá)可導(dǎo)致肝臟細(xì)胞的過度增殖和腫瘤的形成；在乳腺癌中，YAP/TAZ的激活也與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)有關(guān)。本研究中，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，刺參粘多糖作用于SW1990細(xì)胞后，MST1基因的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)。在刺參粘多糖濃度為80μg/mL時(shí)，MST1基因的mRNA表達(dá)量相較于對(duì)照組增加了約2.5倍。這表明刺參粘多糖能夠促進(jìn)MST1基因的轉(zhuǎn)錄，使其表達(dá)增強(qiáng)。同時(shí)，蛋白質(zhì)印跡法（Westernblot）檢測(cè)結(jié)果顯示，YAP蛋白的表達(dá)量明顯下調(diào)，而磷酸化YAP（p-YAP）蛋白的表達(dá)量顯著上調(diào)。當(dāng)刺參粘多糖濃度為160μg/mL時(shí)，YAP蛋白的表達(dá)量相較于對(duì)照組降低了約40%，p-YAP蛋白的表達(dá)量則增加了約1.8倍。這意味著刺參粘多糖促使YAP蛋白發(fā)生磷酸化，使其活性受到抑制。上述結(jié)果表明，刺參粘多糖可能通過激活Hippo信號(hào)通路，上調(diào)MST1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)LATS1/2的激活，使YAP發(fā)生磷酸化，抑制其進(jìn)入細(xì)胞核，從而發(fā)揮對(duì)SW1990細(xì)胞增殖的抑制作用。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解刺參粘多糖抑制胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖的分子機(jī)制提供了重要線索，也為胰腺癌的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)和理論依據(jù)。4.1.2其他相關(guān)基因和信號(hào)通路Survivin作為一種凋亡抑制蛋白，在腫瘤細(xì)胞的增殖和存活中扮演著關(guān)鍵角色。其高表達(dá)與腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)，能夠抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。在胰腺癌中，Survivin的高表達(dá)可降低腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，增加腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。本研究通過RT-PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，刺參粘多糖作用于SW1990細(xì)胞后，Survivin基因的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)。當(dāng)刺參粘多糖濃度為160μg/mL時(shí)，Survivin基因的mRNA表達(dá)量相較于對(duì)照組降低了約70%。這表明刺參粘多糖能夠抑制Survivin基因的轉(zhuǎn)錄，減少其mRNA的表達(dá)。這可能是刺參粘多糖抑制SW1990細(xì)胞增殖的重要機(jī)制之一，通過下調(diào)Survivin的表達(dá)，削弱其對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。Caspase-9是細(xì)胞凋亡線粒體途徑中的關(guān)鍵蛋白酶，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著核心作用。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)，線粒體釋放細(xì)胞色素C，與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）、dATP結(jié)合形成凋亡體，招募并激活Caspase-9，激活的Caspase-9進(jìn)一步激活下游的Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究中，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，刺參粘多糖作用于SW1990細(xì)胞后，Caspase-9基因的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)。在刺參粘多糖濃度為80μg/mL時(shí)，Caspase-9基因的mRNA表達(dá)量相較于對(duì)照組增加了約3.5倍。這表明刺參粘多糖能夠促進(jìn)Caspase-9基因的轉(zhuǎn)錄，使其表達(dá)增強(qiáng)。這說明刺參粘多糖可能通過激活線粒體凋亡途徑，上調(diào)Caspase-9的表達(dá)，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序，從而抑制SW1990細(xì)胞的增殖。TEAD1作為YAP/TAZ的重要下游轉(zhuǎn)錄因子，在Hippo信號(hào)通路中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。YAP/TAZ進(jìn)入細(xì)胞核后與TEAD1結(jié)合，形成復(fù)合物，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、存活和遷移。在多種腫瘤中，YAP/TAZ-TEAD1信號(hào)通路的異常激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究通過RT-PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，刺參粘多糖作用于SW1990細(xì)胞后，TEAD1基因的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)。當(dāng)刺參粘多糖濃度為160μg/mL時(shí)，TEAD1基因的mRNA表達(dá)量相較于對(duì)照組降低了約65%。這表明刺參粘多糖能夠抑制TEAD1基因的轉(zhuǎn)錄，減少其mRNA的表達(dá)。這進(jìn)一步證實(shí)了刺參粘多糖通過抑制Hippo信號(hào)通路下游的YAP/TAZ-TEAD1信號(hào)軸，阻礙下游靶基因的轉(zhuǎn)錄激活，從而發(fā)揮對(duì)SW1990細(xì)胞增殖的抑制作用。除了上述基因和信號(hào)通路，刺參粘多糖還可能對(duì)其他信號(hào)通路產(chǎn)生影響，如PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等。PI3K-Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、存活、代謝等過程中發(fā)揮著重要作用，其異常激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。MAPK信號(hào)通路則參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程，在腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移中也具有重要作用。未來的研究可進(jìn)一步深入探討刺參粘多糖對(duì)這些信號(hào)通路的調(diào)控作用，全面揭示其抑制SW1990細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，為胰腺癌的治療提供更多的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。4.2分子機(jī)制實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證4.2.1RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)基因表達(dá)RT-PCR實(shí)驗(yàn)的原理是基于逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在細(xì)胞中，基因首先轉(zhuǎn)錄為mRNA，RT-PCR實(shí)驗(yàn)通過提取細(xì)胞中的總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板，在引物、dNTPs、DNA聚合酶等物質(zhì)的參與下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而特異性地?cái)U(kuò)增目的基因。通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過程中熒光信號(hào)的變化，能夠定量分析目的基因的mRNA表達(dá)水平。在本研究中，RT-PCR實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：細(xì)胞處理：將SW1990細(xì)胞接種于6孔板中，每孔2×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度（0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL）的刺參粘多糖溶液，繼續(xù)培養(yǎng)48h。RNA提取：采用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA。具體操作如下，吸棄6孔板中的培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每孔加入1mLTRIzol試劑，室溫靜置5min，使細(xì)胞充分裂解。將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至無RNA酶的離心管中，加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min。4℃、12000rpm離心15min，此時(shí)溶液分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白質(zhì)層；下層為紅色的有機(jī)相。小心吸取上層水相至新的離心管中，加入0.5mL異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10min。4℃、12000rpm離心10min，棄上清，可見離心管底部有白色沉淀，即為RNA。用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，每次4℃、7500rpm離心5min，棄上清。室溫晾干RNA沉淀，加入適量的無RNA酶水溶解RNA，用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度和純度，確保RNA的A260/A280比值在1.8-2.0之間。逆轉(zhuǎn)錄：使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。在0.2mLPCR管中，依次加入5μLRNA模板、1μLOligo(dT)引物（50μM）、1μLdNTPMix（10mM），補(bǔ)充無RNA酶水至總體積為12μL。輕輕混勻，65℃孵育5min，立即置于冰上冷卻。然后加入4μL5×RTBuffer、2μL0.1MDTT、1μLRNaseInhibitor（40U/μL）、1μLReverseTranscriptaseM-MLV（200U/μL），總體積為20μL。輕輕混勻，42℃孵育60min，70℃孵育15min以終止反應(yīng)。得到的cDNA可直接用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增或保存于-20℃?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增：以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20μL，包括10μLSYBRGreenPCRMasterMix、0.8μL上游引物（10μM）、0.8μL下游引物（10μM）、2μLcDNA模板，補(bǔ)充ddH?O至20μL。引物序列根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)，如MST1上游引物：5'-CCCAGCTACGAGAAGAGCAA-3'，下游引物：5'-GCTGTCCTTGTCGCTCTTCT-3'；Survivin上游引物：5'-CCAGAGCCAGTTCCTGAAGA-3'，下游引物：5'-GGAAGCCCTTCCTCTCTGTT-3'；Caspase-9上游引物：5'-CAGAGCCTGATGGACAGCAT-3'，下游引物：5'-TGGACGCTGTTGATGAAGAG-3'；TEAD1上游引物：5'-CCACAGCTTCCCTGATGTTC-3'，下游引物：5'-CAGCAGAGCCATCAGAAGAA-3'；內(nèi)參基因GAPDH上游引物：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物：5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5s、60℃退火30s。在PCR反應(yīng)過程中，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化。數(shù)據(jù)分析：采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。首先計(jì)算每個(gè)樣品的ΔCt值（ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因），然后計(jì)算ΔΔCt值（ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組），最后計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量（相對(duì)表達(dá)量=2?ΔΔCt）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，以對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量為1，分析不同濃度刺參粘多糖作用下目的基因mRNA表達(dá)水平的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著刺參粘多糖濃度的增加，MST1和Caspase-9基因的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，在刺參粘多糖濃度為160μg/mL時(shí)，MST1基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量相較于對(duì)照組增加了約4.5倍，Caspase-9基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量增加了約3.8倍。而Survivin和TEAD1基因的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)，在160μg/mL濃度下，Survivin基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量相較于對(duì)照組降低了約75%，TEAD1基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量降低了約70%。這些結(jié)果表明，刺參粘多糖能夠顯著影響相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，從而在分子層面發(fā)揮對(duì)SW1990細(xì)胞增殖的抑制作用。4.2.2蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)蛋白質(zhì)印跡法（Westernblot）的實(shí)驗(yàn)流程主要包括蛋白樣品制備、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育和顯色等步驟。在本研究中，具體實(shí)驗(yàn)操作如下：細(xì)胞處理：將SW1990細(xì)胞接種于6孔板中，每孔2×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度（0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL）的刺參粘多糖溶液，繼續(xù)培養(yǎng)48h。蛋白樣品制備：吸棄6孔板中的培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每孔加入150μLRIPA裂解液（含1mMPMSF），冰上裂解30min，期間每隔5min輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板。將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000rpm離心15min，取上清液，即為總蛋白樣品。用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。將蛋白樣品與5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5min，使蛋白充分變性。SDS-PAGE電泳：根據(jù)蛋白分子量大小，配制合適濃度的SDS-PAGE凝膠。本研究中，對(duì)于分子量較大的蛋白，如YAP（約65kDa），采用8%的分離膠；對(duì)于分子量較小的蛋白，如β-actin（約42kDa），采用12%的分離膠。將變性后的蛋白樣品上樣到SDS-PAGE凝膠的加樣孔中，同時(shí)上樣預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。在電泳槽中加入適量的電泳緩沖液，先在80V電壓下進(jìn)行濃縮膠電泳，待溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部，停止電泳。轉(zhuǎn)膜：電泳結(jié)束后，將凝膠從電泳槽中取出，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15min。裁剪與凝膠大小相同的PVDF膜，將PVDF膜在甲醇中浸泡15s，使其充分活化，然后將PVDF膜放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15min。按照“負(fù)極-海綿墊-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿墊-正極”的順序組裝轉(zhuǎn)膜裝置，確保各層之間無氣泡。將轉(zhuǎn)膜裝置放入轉(zhuǎn)膜槽中，加入適量的轉(zhuǎn)膜緩沖液，在300mA恒流條件下轉(zhuǎn)膜90min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出PVDF膜，用麗春紅染色液染色5min，觀察蛋白轉(zhuǎn)膜效果，可見清晰的蛋白條帶，表明轉(zhuǎn)膜成功。封閉：將PVDF膜放入5%脫脂奶粉（用TBST配制）中，室溫下在搖床上緩慢搖動(dòng)封閉1h，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。一抗孵育：將封閉后的PVDF膜放入一抗稀釋液（用5%BSA配制）中，一抗包括抗YAP抗體（1:1000）、抗p-YAP抗體（1:1000）、抗Survivin抗體（1:1000）、抗Caspase-9抗體（1:1000）、抗β-actin抗體（1:2000）等，4℃孵育過夜。孵育結(jié)束后，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。二抗孵育：將洗滌后的PVDF膜放入相應(yīng)的二抗稀釋液（用5%BSA配制）中，二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:5000），室溫下在搖床上緩慢搖動(dòng)孵育1h。孵育結(jié)束后，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。顯色：將ECL化學(xué)發(fā)光底物A液和B液按1:1的比例混合，均勻滴加到PVDF膜上，室溫孵育1-2min，使底物與HRP充分反應(yīng)。將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中，曝光顯影，采集圖像。數(shù)據(jù)分析：使用ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，校正目的蛋白的表達(dá)量。計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值，以對(duì)照組的比值為1，分析不同濃度刺參粘多糖作用下目的蛋白表達(dá)量的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著刺參粘多糖濃度的增加，YAP蛋白的表達(dá)量逐漸降低，在160μg/mL濃度時(shí)，YAP蛋白的表達(dá)量相較于對(duì)照組降低了約45%；而p-YAP蛋白的表達(dá)量逐漸升高，在160μg/mL濃度時(shí)，p-YAP蛋白的表達(dá)量相較于對(duì)照組增加了約2倍。Survivin蛋白的表達(dá)量顯