AnnexinA4在肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)及功能解析：機(jī)制探究與臨床展望一、引言1.1研究背景肝癌，作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，一直以來都備受關(guān)注。據(jù)權(quán)威數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年全球肝癌的新發(fā)病例數(shù)高達(dá)91萬例，在各類惡性腫瘤的發(fā)生率中位居第6位；而同年因肝癌死亡的人數(shù)約為83萬例，在所有癌癥死亡人數(shù)中位列第3位。在我國，肝癌同樣形勢嚴(yán)峻，2020年肝癌新發(fā)病例數(shù)達(dá)41萬例，排在國內(nèi)惡性腫瘤發(fā)病的第5位，死亡人數(shù)為39萬例，位居癌癥死亡第2位。盡管從1992年開始我國全體出生嬰兒均接種乙肝疫苗，且對乙型肝炎患病的防治力度不斷加強(qiáng)，使得原發(fā)性肝癌的發(fā)病增速有所減慢，但肝癌依然是我國乃至全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域亟待攻克的難題。肝癌的高致死率與其疾病特性密切相關(guān)。一方面，肝癌起病極為隱匿，早期往往缺乏明顯癥狀，這使得大多數(shù)患者在確診時(shí)已處于局部晚期或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，錯(cuò)過了最佳的治療時(shí)機(jī)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，70%-80%的肝癌患者確診時(shí)病情已進(jìn)展到這一階段，此時(shí)治療難度大幅增加，患者的五年生存率僅為12.1%。另一方面，肝癌具有高侵襲、轉(zhuǎn)移早、手術(shù)或介入治療后復(fù)發(fā)率較高等臨床病理特征，這些因素都嚴(yán)重影響了患者的預(yù)后，導(dǎo)致肝癌的死亡率居高不下。由于肝癌的高發(fā)病率和高致死率，對其進(jìn)行深入研究顯得尤為重要。研究肝癌的發(fā)病機(jī)制，有助于我們從根源上理解疾病的發(fā)生發(fā)展過程，從而為早期診斷提供理論依據(jù)。通過對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的研究，如細(xì)胞的增殖、凋亡、黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程，我們可以發(fā)現(xiàn)潛在的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。尋找有效的治療方法和預(yù)防策略是肝癌研究的關(guān)鍵目標(biāo)，這不僅能夠提高患者的生存率和生活質(zhì)量，還能減輕社會和家庭的醫(yī)療負(fù)擔(dān)，對全球公共衛(wèi)生事業(yè)具有重大意義。1.2研究目的本研究旨在深入探究AnnexinA4在肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平，并全面分析其對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，包括但不限于細(xì)胞的增殖、凋亡、黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移等關(guān)鍵過程。通過RNA干擾技術(shù)，特異性地降低肝癌細(xì)胞中AnnexinA4的表達(dá)，觀察細(xì)胞生物學(xué)行為的變化，從而明確AnnexinA4在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用機(jī)制。這一研究不僅有助于揭示肝癌發(fā)病的潛在分子機(jī)制，為肝癌的早期診斷提供新的生物標(biāo)志物，還可能為肝癌的治療提供新的靶點(diǎn)，為開發(fā)更有效的治療策略奠定基礎(chǔ)，最終提高肝癌患者的生存率和生活質(zhì)量。1.3研究意義本研究聚焦于AnnexinA4在肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)及功能，具有重要的基礎(chǔ)研究意義和潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。從基礎(chǔ)研究角度來看，肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，涉及眾多基因和信號通路的異常改變。深入探究AnnexinA4在肝癌細(xì)胞中的作用機(jī)制，有助于揭示肝癌發(fā)病的潛在分子機(jī)制，進(jìn)一步完善我們對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的理解。目前，雖然對肝癌的研究已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，但仍有許多未知領(lǐng)域亟待探索。AnnexinA4作為一種在細(xì)胞生理和病理過程中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用的蛋白，其在肝癌中的具體功能和調(diào)控機(jī)制尚不明確。通過本研究，有望發(fā)現(xiàn)新的分子靶點(diǎn)和信號通路，為肝癌的基礎(chǔ)研究提供新的方向和思路，填補(bǔ)該領(lǐng)域在這方面的研究空白，使我們對肝癌的認(rèn)識更加深入和全面。在臨床應(yīng)用方面，本研究的成果具有廣闊的應(yīng)用前景。一方面，尋找有效的肝癌早期診斷標(biāo)志物一直是臨床研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。由于肝癌早期癥狀隱匿，缺乏特異性的診斷指標(biāo)，導(dǎo)致大多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)失了最佳治療時(shí)機(jī)。如果AnnexinA4被證實(shí)與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，那么它有可能作為一種新的生物標(biāo)志物，用于肝癌的早期診斷和病情監(jiān)測。通過檢測患者血液、組織或其他生物樣本中AnnexinA4的表達(dá)水平，結(jié)合其他臨床指標(biāo)，或許能夠提高肝癌早期診斷的準(zhǔn)確性，實(shí)現(xiàn)肝癌的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，從而顯著改善患者的預(yù)后。另一方面，開發(fā)新的治療靶點(diǎn)對于提高肝癌治療效果至關(guān)重要。目前肝癌的治療方法主要包括手術(shù)切除、肝移植、介入治療、化療、放療和靶向治療等，但這些治療方法仍存在諸多局限性，患者的總體生存率和生活質(zhì)量有待提高。若能明確AnnexinA4在肝癌細(xì)胞中的作用機(jī)制，將其作為新的治療靶點(diǎn)，研發(fā)針對AnnexinA4的靶向治療藥物或治療策略，有望為肝癌患者提供更加精準(zhǔn)、有效的治療手段，提高治療效果，降低復(fù)發(fā)率，延長患者的生存期，改善患者的生活質(zhì)量。此外，對AnnexinA4的研究還可能為肝癌的預(yù)防提供新的策略，通過干預(yù)AnnexinA4相關(guān)的信號通路，降低肝癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，對肝癌的防治具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。二、AnnexinA4與肝癌細(xì)胞株概述2.1AnnexinA4的基本信息AnnexinA4，又稱附睪蛋白4，是膜聯(lián)蛋白（annexin）家族中的重要成員。膜聯(lián)蛋白家族是一類進(jìn)化保守的多基因家族蛋白，其成員在結(jié)構(gòu)上具有高度同源性，均包含保守的C-端中心結(jié)構(gòu)域和具有獨(dú)特功能的N-端結(jié)構(gòu)域。AnnexinA4的基因位于人類染色體1q21區(qū)域，該基因的結(jié)構(gòu)包含多個(gè)外顯子和內(nèi)含子，通過復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄和剪接過程，最終編碼出具有特定功能的蛋白質(zhì)。在轉(zhuǎn)錄過程中，RNA聚合酶與基因啟動子區(qū)域結(jié)合，沿著DNA模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，生成含有外顯子和內(nèi)含子的前體mRNA。隨后，通過一系列復(fù)雜的剪接機(jī)制，內(nèi)含子被精確去除，外顯子按照特定順序拼接在一起，形成成熟的mRNA。這種精確的轉(zhuǎn)錄和剪接過程確保了AnnexinA4基因能夠準(zhǔn)確表達(dá)出具有正常功能的蛋白質(zhì)，對于維持細(xì)胞的正常生理活動至關(guān)重要。AnnexinA4蛋白由321個(gè)氨基酸殘基組成，其分子量約為36kDa。該蛋白的C端具有4個(gè)重復(fù)序列，每個(gè)重復(fù)序列都包含一個(gè)Ⅱ型鈣結(jié)合位點(diǎn)，這些鈣結(jié)合位點(diǎn)在AnnexinA4與磷脂的結(jié)合過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度發(fā)生變化時(shí)，鈣離子會與這些鈣結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而引起AnnexinA4蛋白構(gòu)象的改變，使其能夠與細(xì)胞膜上帶負(fù)電荷的磷脂酰絲氨酸（PS）等酸性磷脂緊密結(jié)合。在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸會由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)，此時(shí)AnnexinA4能夠通過其鈣結(jié)合位點(diǎn)與暴露在細(xì)胞外側(cè)的磷脂酰絲氨酸特異性結(jié)合，這一特性使得AnnexinA4在細(xì)胞凋亡檢測等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。此外，在第4個(gè)鈣結(jié)合位點(diǎn)中還包含一個(gè)“KGD”序列，該序列可能參與了AnnexinA4與其他蛋白質(zhì)或分子的相互作用，進(jìn)一步拓展了其在細(xì)胞內(nèi)的功能。在生物學(xué)功能方面，AnnexinA4參與了多項(xiàng)重要的細(xì)胞生理過程。首先，它在胞吐作用中扮演著關(guān)鍵角色。胞吐作用是細(xì)胞將細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)通過囊泡運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外的過程，對于細(xì)胞分泌激素、神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子等生物活性物質(zhì)至關(guān)重要。AnnexinA4能夠與細(xì)胞膜和囊泡膜上的磷脂相互作用，促進(jìn)囊泡與細(xì)胞膜的融合，從而實(shí)現(xiàn)胞吐過程。在神經(jīng)細(xì)胞中，神經(jīng)遞質(zhì)的釋放依賴于囊泡與細(xì)胞膜的融合，AnnexinA4通過其與磷脂的結(jié)合作用，協(xié)助這一融合過程的順利進(jìn)行，確保神經(jīng)信號的正常傳遞。其次，AnnexinA4在凝血反應(yīng)中也發(fā)揮著重要作用。凝血過程是一個(gè)復(fù)雜的生理過程，涉及多種凝血因子和血小板的相互作用。AnnexinA4可以與血小板表面的磷脂結(jié)合，調(diào)節(jié)血小板的活化和聚集，進(jìn)而影響凝血過程的啟動和進(jìn)展。當(dāng)血管受損時(shí)，血小板會被激活并聚集在損傷部位，AnnexinA4通過與血小板表面磷脂的結(jié)合，穩(wěn)定血小板的聚集狀態(tài)，促進(jìn)凝血塊的形成，從而起到止血的作用。此外，AnnexinA4還參與了細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖、分化等過程，通過與不同的蛋白質(zhì)和分子相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號通路，維持細(xì)胞的正常生理功能。在正常生理狀態(tài)下，AnnexinA4在人體多個(gè)組織和器官中均有表達(dá)，但其表達(dá)水平存在一定的組織特異性。在正常的上皮組織中，如呼吸道上皮、消化道上皮、泌尿生殖道上皮等，AnnexinA4通常呈現(xiàn)較高水平的表達(dá)。在呼吸道上皮細(xì)胞中，AnnexinA4可能參與維持上皮細(xì)胞的完整性和屏障功能，保護(hù)呼吸道免受病原體的侵襲。在消化道上皮中，它可能與消化液的分泌、營養(yǎng)物質(zhì)的吸收等過程相關(guān)。而在一些其他組織中，如肝臟、心臟、肌肉等，AnnexinA4的表達(dá)水平相對較低。這種組織特異性的表達(dá)模式表明AnnexinA4在不同組織中可能具有不同的功能，以適應(yīng)各組織的特殊生理需求。此外，AnnexinA4的表達(dá)還受到多種因素的調(diào)控，包括激素、生長因子、細(xì)胞因子等。在某些生理狀態(tài)變化或疾病發(fā)生時(shí)，這些調(diào)控因素的改變可能導(dǎo)致AnnexinA4表達(dá)水平的異常變化，進(jìn)而影響細(xì)胞的正常功能，與疾病的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生關(guān)聯(lián)。2.2肝癌細(xì)胞株相關(guān)知識肝癌細(xì)胞株（CellStrain）是通過單細(xì)胞分離培養(yǎng)或篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群，其特殊性質(zhì)或標(biāo)志在整個(gè)培養(yǎng)期間始終保持穩(wěn)定。原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后便成為細(xì)胞系（cellline），細(xì)胞系由原代培養(yǎng)物中原本存在的細(xì)胞世系組成。根據(jù)細(xì)胞的傳代能力，可將細(xì)胞系分為有限細(xì)胞系和連續(xù)細(xì)胞系。有限細(xì)胞系不能繼續(xù)傳代或傳代次數(shù)有限，而連續(xù)細(xì)胞系則可以連續(xù)培養(yǎng)，通常能培養(yǎng)50代以上并可無限培養(yǎng)下去。肝癌細(xì)胞株則是從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中，通過選擇法或克隆形成法獲得的具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志的培養(yǎng)細(xì)胞，一般可培養(yǎng)至40-50代。對于人類肝癌細(xì)胞而言，若在體外培養(yǎng)半年以上，生長穩(wěn)定且能連續(xù)傳代，即可稱為連續(xù)性株或系。肝癌細(xì)胞株依據(jù)其來源和特性的差異，可大致分為以下幾類：第一類是取材于原發(fā)肝癌組織，在建系過程中未改變其生物學(xué)特性的細(xì)胞株。早期建立的許多細(xì)胞系都屬于這一類型，它們具有一些共同特征，例如甲胎蛋白（AFP）均為陽性，能夠分泌一些血漿蛋白。不過，它們之間也存在明顯差別，像PLC/PRF/5和HepG2在裸鼠中的成瘤性較差，而QGY-7703和SMMC-7721的異移植成功率卻高達(dá)100％；PLC/PRF/5能夠檢測到HBsAg，HepG2則不含有HBV。第二類是具有特征性的人肝癌細(xì)胞系，如MHCC97，它是利用裸鼠人肝癌高轉(zhuǎn)移模型在體外建立的。該細(xì)胞系的HBsAg、HBxAg、AFP均為陽性，經(jīng)皮下和肝內(nèi)接種均可使裸鼠致瘤，并會發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移，肝內(nèi)接種者的肺轉(zhuǎn)移灶癌細(xì)胞AFP呈陽性。從該細(xì)胞系克隆出的兩株細(xì)胞在生物學(xué)特性上存在顯著差別。還有一株外生型肝癌細(xì)胞系EGHC-9901，該細(xì)胞系能持續(xù)高分泌AFP，能形成完整毛細(xì)膽管且有明顯微絨毛，表明其細(xì)胞變異較小。此外，部分人肝癌細(xì)胞系的宿主患有其他腫瘤或疾病。比如KMCH-1是第一株肝癌和膽管癌混合的細(xì)胞系，該細(xì)胞系在無胸腺鼠中能成瘤，但形成瘤體的分化程度不同，皮下移植瘤呈低分化，而腹腔內(nèi)腫瘤分化良好。RBHF-1來源于患有遺傳性血色素沉積病的肝癌患者，HBV和HCV均為陰性，該細(xì)胞系的建立有助于研究鐵沉積過多的相關(guān)問題。Mz-Hep-1是第一株致癌物相關(guān)的肝癌來源的細(xì)胞系，其宿主長期暴露在高濃度的二氧化釷環(huán)境中，且沒有肝炎病毒感染。第三類是人為轉(zhuǎn)染了病毒和（或）基因的細(xì)胞系。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們能夠根據(jù)預(yù)設(shè)目的改造原有的細(xì)胞系，從而建立具有既定生物學(xué)特性的肝癌細(xì)胞系。例如HB611是一株轉(zhuǎn)染了含HBV基因的重組DNA分子和一種抗新霉素基因的Huh6-c15的肝癌細(xì)胞系克隆，能聚集核心顆粒并高水平產(chǎn)生和釋放HBsAg和HBeAg。還有人將病人的HCV轉(zhuǎn)染到SMMC-7721細(xì)胞中，在至少3個(gè)多月的時(shí)間里都能在細(xì)胞內(nèi)檢測到HCVRNA和HCVNS3，CP10抗原的表達(dá)。第四類是用于治療性研究的人肝癌細(xì)胞系，此類細(xì)胞系主要用于藥物篩選和細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究。常見的肝癌細(xì)胞株有多種，它們各自具有獨(dú)特的特性。SMMC-7721人肝癌細(xì)胞株于1977年建立，材料取自一名50歲男性原發(fā)性肝細(xì)胞癌HCC患者的手術(shù)切除標(biāo)本進(jìn)行體外培養(yǎng)而得。該細(xì)胞系生長較為迅速穩(wěn)定，在原代細(xì)胞開始傳代階段增殖緩慢，之后趨于穩(wěn)定且迅速生長。細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)上皮樣，貼壁生長。其亞微結(jié)構(gòu)形態(tài)符合癌細(xì)胞的一般特征，甲胎蛋白（AFP）免疫熒光染色呈陽性，LDH同工酶譜的變化與肝癌細(xì)胞的一般特征一致，免疫缺陷小鼠體內(nèi)可成瘤率高，動物異種后瘤結(jié)節(jié)經(jīng)病理切片檢查，其組織形態(tài)和原手術(shù)切除標(biāo)本類似。Bel-7402人肝癌細(xì)胞株建立于1974年，來源于一位53歲男性肝癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本，屬于HCC。該細(xì)胞增長迅速且恒定，6-7天可傳代1次。細(xì)胞形態(tài)以多邊形上皮樣占絕大多數(shù)，貼壁生長。細(xì)胞染色體中有一大而長的近端著絲點(diǎn)染色體，出現(xiàn)頻率高，是本株細(xì)胞的標(biāo)記染色體。AFP免疫熒光反應(yīng)陽性，LDH、G6PD、TAT等酶代謝及細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)基本上保持臨床人體肝癌的特性，異種接種后成瘤率高，3-4天可成瘤，瘤塊組織學(xué)病理與臨床HCC相近。MHCC97人肝癌細(xì)胞系由上海醫(yī)科大學(xué)中山醫(yī)院建立，將一名我國39歲男性HCC患者的肝右葉轉(zhuǎn)移病灶的手術(shù)切除標(biāo)本接種于裸鼠肝內(nèi)建造出人肝癌裸鼠轉(zhuǎn)移模型（LCI-D20）而得。已證實(shí)，經(jīng)過再次分離得到的MHCC97H、MHCC97L及HCCLM33種細(xì)胞株，雖來源同一父系，但依據(jù)它們的轉(zhuǎn)移特點(diǎn)具有異質(zhì)性，即具有不同的轉(zhuǎn)移潛能。MHCC97人肝癌細(xì)胞系于1998年從裸鼠人肝癌轉(zhuǎn)移模型（LCI-D20）體外傳代培養(yǎng)獲得，該細(xì)胞系符合一般人惡性腫瘤的病理學(xué)和遺傳學(xué)特征，細(xì)胞呈上皮樣，貼壁生長，血清HBsAg、AFP高表達(dá)，成瘤率高且優(yōu)先轉(zhuǎn)移的靶器官是肺，肺轉(zhuǎn)移率高，故證實(shí)該細(xì)胞系為高轉(zhuǎn)移特性的人肝癌細(xì)胞系。2001年，研究者從MHCC97細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)并分離出不同轉(zhuǎn)移潛能的2個(gè)細(xì)胞系MHCC97-H和MHCC97-L，前者肺轉(zhuǎn)移率高，后者為40%；從生長速度上看，前者細(xì)胞倍增時(shí)間較后者短，穿透人工基底膜能力前者較后者大，前者均較后者活力強(qiáng)、代謝旺。傳代至20代后，兩種細(xì)胞系在形態(tài)學(xué)特征及生長速度方面均較為穩(wěn)定。之后又從MHCC97-H裸鼠接種后成功得到更高轉(zhuǎn)移潛能的HCCLM3細(xì)胞系。HepG2人肝母細(xì)胞瘤于1979年從阿根廷一名15歲高加索男孩的原發(fā)性肝胚細(xì)胞瘤中分離并建立。該細(xì)胞系呈上皮樣，貼壁抱團(tuán)生長，生長較快，傳代周期為1-2天，低轉(zhuǎn)移，裸鼠中成瘤性較差。AFP陽性，HBsAg陰性，目前尚未證明該細(xì)胞中有乙型肝炎病毒（HBV）基因組。但通過實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，該細(xì)胞系分化程度較高，細(xì)胞里代謝酶的生物轉(zhuǎn)化特性較完整，不需加入外源性活化系統(tǒng)。在藥物作用相關(guān)研究中代謝酶保持穩(wěn)定，不會因傳代次數(shù)增多而有所改變，所含有的生物轉(zhuǎn)化代謝酶與人正常肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞同源，因此，常被用于體外肝細(xì)胞代謝或遺傳毒性試驗(yàn)方面的理想細(xì)胞系。其中，HepG2.2.15是目前應(yīng)用較為廣泛的細(xì)胞株，它是HepG2的衍生物，是體外篩選抗HBV藥物的良好模型，并用于抗HBV新藥開發(fā)的體外研究工具。Hep3B人肝癌細(xì)胞株分離自8歲美國黑人男童的肝癌組織。細(xì)胞形態(tài)跟HepG2類似，呈上皮細(xì)胞，電鏡下觀察胞漿里面有很多粗大的黑顆粒，同樣喜抱團(tuán)貼壁生長。其在裸鼠中能致瘤，但基本不轉(zhuǎn)移。HBV陽性，這與HepG2不同，這株細(xì)胞整合了完整的HBV基因組，可用于HBV感染后發(fā)展致癌相關(guān)研究。Huh-7人肝癌細(xì)胞系于1982年從一名患有肝癌的57歲日本男性肝癌組織標(biāo)本上培養(yǎng)而得。該細(xì)胞AFP陽性，高度分化，細(xì)胞呈上皮樣，貼壁生長。特點(diǎn)是HBV陰性，而具有丙型肝炎病毒（HCV）易感性，故可用于HCV與肝癌的關(guān)系的研究。除了用于研究致癌性，還用于基因表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制、新陳代謝及VLDL的分泌等。此細(xì)胞系的特別之處在于可用于生產(chǎn)重組蛋白如促紅細(xì)胞生成素，在蛋白質(zhì)生物學(xué)方面用于研究在肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的登革病毒，廣泛用于異種移植動物模型。PLC/PRF/5人肝癌亞歷山大細(xì)胞于1976年建系，細(xì)胞來自一位患有原發(fā)性HCC的莫桑比克男性患者的標(biāo)本。為上皮樣貼壁生長，AFP陽性，不產(chǎn)生白蛋白。分泌ad亞型的HBsAg而不產(chǎn)生HBcAg或HBeAg和Dane顆粒，卻可維持HAV的繁殖。該細(xì)胞可能含有全部HBV基因組，同工酶譜及核型與人類同源，裸鼠異種移植可致瘤。此細(xì)胞系因其產(chǎn)生HBsAg的物理化學(xué)和免疫化學(xué)特性跟HBV攜帶者血清中HBsAg相似，因此，可被用來研究HBV體外病毒及其與原發(fā)性肝癌的關(guān)聯(lián)，抗HBV疫苗所需的HBsAg顆粒的制備及抗病藥物的制備等方面。這些常見的肝癌細(xì)胞株在肝癌研究中發(fā)揮著重要作用，它們?yōu)樯钊胩骄扛伟┑陌l(fā)病機(jī)制、尋找有效的治療方法提供了不可或缺的實(shí)驗(yàn)材料。三、AnnexinA4在不同轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料本研究選用了具有不同轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞株，包括高轉(zhuǎn)移潛能的MHCC97-H細(xì)胞株和低轉(zhuǎn)移潛能的MHCC97-L細(xì)胞株。這些細(xì)胞株均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其來源和特性明確，是研究肝癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的常用細(xì)胞模型。MHCC97-H細(xì)胞株具有高轉(zhuǎn)移潛能，在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出較強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力；而MHCC97-L細(xì)胞株的轉(zhuǎn)移潛能較低，與MHCC97-H細(xì)胞株形成對比，有助于分析AnnexinA4在不同轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞中的表達(dá)差異及其與轉(zhuǎn)移能力的關(guān)聯(lián)。實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑如下：Trizol試劑購自Invitrogen公司，它是一種高效的總RNA提取試劑，能夠快速、有效地從細(xì)胞或組織中提取高質(zhì)量的總RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品，該試劑盒包含逆轉(zhuǎn)錄所需的各種酶和緩沖液，具有逆轉(zhuǎn)錄效率高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)⑻崛〉腞NA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，為后續(xù)的PCR反應(yīng)提供模板。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒選用Roche公司的產(chǎn)品，其具有高靈敏度、高特異性和良好的重復(fù)性，能夠準(zhǔn)確地對目的基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量檢測。兔抗人AnnexinA4多克隆抗體購自Abcam公司，該抗體具有高親和力和特異性，能夠特異性地識別AnnexinA4蛋白，用于Westernblot等實(shí)驗(yàn)中檢測AnnexinA4的表達(dá)。HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購自JacksonImmunoResearchLaboratories公司，它能夠與兔抗人AnnexinA4多克隆抗體特異性結(jié)合，并通過HRP催化底物顯色，實(shí)現(xiàn)對目的蛋白的檢測。蛋白Marker購自ThermoFisherScientific公司，用于在蛋白質(zhì)電泳中確定蛋白質(zhì)的分子量大小。此外，還使用了BCA蛋白定量試劑盒（購自Pierce公司），用于準(zhǔn)確測定蛋白質(zhì)樣品的濃度，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)中使用的主要儀器設(shè)備包括：CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），為細(xì)胞提供適宜的培養(yǎng)環(huán)境，維持細(xì)胞生長所需的溫度、濕度和CO?濃度。超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），用于提供無菌的操作環(huán)境，防止細(xì)胞污染。低溫離心機(jī)（Eppendorf公司），能夠在低溫條件下對樣品進(jìn)行離心分離，保證生物分子的活性和穩(wěn)定性。PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad公司），用于進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對基因的擴(kuò)增和定量檢測。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Roche公司），具有高精度的熒光檢測系統(tǒng)，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測PCR反應(yīng)過程中熒光信號的變化，準(zhǔn)確地對目的基因進(jìn)行定量分析。凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于對蛋白質(zhì)或核酸凝膠進(jìn)行成像和分析，獲取實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖像和數(shù)據(jù)。電泳儀（Bio-Rad公司），用于進(jìn)行蛋白質(zhì)和核酸的電泳分離，根據(jù)分子大小和電荷差異將不同的生物分子分離開來。3.1.2實(shí)驗(yàn)方法將MHCC97-H和MHCC97-L細(xì)胞株復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天進(jìn)行一次換液，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，確保細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài)。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，密切觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長速度和密度等指標(biāo)，及時(shí)調(diào)整培養(yǎng)條件，保證細(xì)胞的正常生長和增殖。采用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。具體步驟如下：棄去細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞2-3次，去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。向培養(yǎng)瓶中加入1mlTrizol試劑，用移液器吹打均勻，使細(xì)胞充分裂解，室溫靜置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，加入0.2ml氯仿，蓋緊管蓋，劇烈振蕩15秒，使溶液充分混合，室溫靜置3分鐘。4℃、12000rpm離心15分鐘，此時(shí)樣品會分成三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中間層為白色的蛋白層；下層為紅色的有機(jī)相。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后，-20℃放置20分鐘，使RNA沉淀。4℃、12000rpm離心10分鐘，棄去上清液，此時(shí)可見管底有白色膠狀沉淀，即為RNA沉淀。加入1ml75%乙醇（用DEPC水配制），輕輕洗滌RNA沉淀，4℃、7500rpm離心5分鐘，棄去上清液。重復(fù)洗滌步驟一次，將離心管倒置在濾紙上，室溫晾干5-10分鐘，注意不要使RNA沉淀完全干燥，以免影響其溶解。向離心管中加入適量的DEPC水，輕輕吹打使RNA溶解，-70℃保存?zhèn)溆?。提取過程中，嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，防止RNA酶污染，確保RNA的完整性和純度。使用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在冰上配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，總體積為20μl，包括5×PrimeScriptBuffer4μl、PrimeScriptRTEnzymeMixI1μl、Oligo(dT)Primer1μl、Random6mers1μl、TotalRNA1μg，用DEPC水補(bǔ)足至20μl。將反應(yīng)體系輕輕混勻后，短暫離心，使液體集中于管底。將離心管放入PCR擴(kuò)增儀中，按照以下程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：37℃15分鐘，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；85℃5秒鐘，使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，將cDNA產(chǎn)物保存于-20℃?zhèn)溆?。逆轉(zhuǎn)錄過程中，嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，確保逆轉(zhuǎn)錄效率和cDNA的質(zhì)量。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用Roche實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。在冰上配制PCR反應(yīng)體系，總體積為20μl，包括2×LightCycler480SYBRGreenIMaster10μl、上下游引物各0.5μl（10μM）、cDNA模板1μl，用ddH?O補(bǔ)足至20μl。AnnexinA4的引物序列為：上游引物5'-ATGGCCTACGCCAACAAGAA-3'，下游引物5'-CTCTTCGCTGCTGTCTTCTG-3'；內(nèi)參基因GAPDH的引物序列為：上游引物5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。將反應(yīng)體系輕輕混勻后，加入到96孔板中，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將96孔板放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性10秒鐘，60℃退火30秒鐘，72℃延伸30秒鐘，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；最后進(jìn)行熔解曲線分析，以驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算AnnexinA4mRNA的相對表達(dá)量，其中ΔCt=Ct(AnnexinA4)-Ct(GAPDH)，ΔΔCt=ΔCt(實(shí)驗(yàn)組)-ΔCt(對照組)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR過程中，嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。采用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）提取細(xì)胞總蛋白。棄去細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞2-3次，去除殘留的培養(yǎng)基。向培養(yǎng)瓶中加入適量的RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，期間不斷輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞充分裂解。將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即為細(xì)胞總蛋白提取物。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。按照試劑盒說明書，將BCA工作液與蛋白樣品按一定比例混合，在96孔板中每孔加入20μl蛋白樣品和200μlBCA工作液，輕輕混勻。37℃孵育30分鐘，使蛋白與BCA試劑充分反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在562nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。將蛋白樣品調(diào)整至相同濃度后，加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸5分鐘，使蛋白變性，-20℃保存?zhèn)溆?。蛋白質(zhì)提取過程中，注意保持低溫環(huán)境，防止蛋白降解。采用10%的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離蛋白。將變性后的蛋白樣品上樣，每孔上樣量為20μg，同時(shí)加入蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在電泳緩沖液中，以80V的電壓進(jìn)行濃縮膠電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠取出，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15分鐘。采用半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。在轉(zhuǎn)膜儀中，按照陽極（海綿墊、濾紙、PVDF膜、凝膠、濾紙、海綿墊）的順序依次放置，確保各層之間無氣泡。在15V電壓下轉(zhuǎn)膜2小時(shí)，使蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉封閉液中，室溫封閉1小時(shí)，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入兔抗人AnnexinA4多克隆抗體（1:1000稀釋）中，4℃孵育過夜，使抗體與目的蛋白特異性結(jié)合。次日，將PVDF膜取出，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的抗體。然后將PVDF膜放入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1:5000稀釋）中，室溫孵育1小時(shí)，使二抗與一抗特異性結(jié)合。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的二抗。最后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑對PVDF膜進(jìn)行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光成像，分析AnnexinA4蛋白的表達(dá)情況。Westernblot檢測過程中，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測AnnexinA4在高轉(zhuǎn)移潛能的MHCC97-H細(xì)胞株和低轉(zhuǎn)移潛能的MHCC97-L細(xì)胞株中的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與MHCC97-L細(xì)胞株相比，MHCC97-H細(xì)胞株中AnnexinA4mRNA的表達(dá)水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），具體數(shù)據(jù)如圖1所示。這表明AnnexinA4在高轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞株中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，其表達(dá)水平可能與肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)。[此處插入圖1：AnnexinA4在不同轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞株中的mRNA表達(dá)水平柱狀圖，橫坐標(biāo)為細(xì)胞株類型（MHCC97-H和MHCC97-L），縱坐標(biāo)為AnnexinA4mRNA相對表達(dá)量，*表示P<0.05]進(jìn)一步采用Westernblot檢測AnnexinA4在兩種細(xì)胞株中的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，MHCC97-H細(xì)胞株中AnnexinA4蛋白的表達(dá)量明顯高于MHCC97-L細(xì)胞株，與mRNA的表達(dá)趨勢一致。通過圖像分析軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算AnnexinA4蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH的灰度值比值，結(jié)果顯示MHCC97-H細(xì)胞株中AnnexinA4蛋白的相對表達(dá)量顯著高于MHCC97-L細(xì)胞株，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），具體數(shù)據(jù)如圖2所示。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了AnnexinA4在高轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞株中高表達(dá)，且在蛋白水平上也與肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能存在關(guān)聯(lián)。[此處插入圖2：AnnexinA4在不同轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞株中的蛋白表達(dá)水平Westernblot圖及柱狀圖，左圖為Westernblot圖，顯示AnnexinA4和GAPDH的蛋白條帶，右圖為柱狀圖，橫坐標(biāo)為細(xì)胞株類型（MHCC97-H和MHCC97-L），縱坐標(biāo)為AnnexinA4蛋白相對表達(dá)量（AnnexinA4蛋白灰度值與GAPDH蛋白灰度值比值），*表示P<0.05]3.3結(jié)果討論本研究通過對高轉(zhuǎn)移潛能的MHCC97-H細(xì)胞株和低轉(zhuǎn)移潛能的MHCC97-L細(xì)胞株中AnnexinA4表達(dá)水平的檢測，發(fā)現(xiàn)AnnexinA4在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均與肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能呈正相關(guān)，即AnnexinA4在高轉(zhuǎn)移潛能的MHCC97-H細(xì)胞株中高表達(dá)，在低轉(zhuǎn)移潛能的MHCC97-L細(xì)胞株中低表達(dá)。這一結(jié)果與以往一些相關(guān)研究的結(jié)論具有一致性。有研究表明，在多種惡性腫瘤中，某些與細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白或基因的表達(dá)水平會隨著腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的增強(qiáng)而升高。在乳腺癌細(xì)胞系中，一些參與細(xì)胞遷移和侵襲過程的蛋白，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族成員，在高轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞株中表達(dá)顯著上調(diào)。這提示我們，AnnexinA4可能在肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程中扮演著重要角色，其高表達(dá)可能促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。從細(xì)胞生物學(xué)行為的角度來看，AnnexinA4的高表達(dá)可能通過多種機(jī)制影響肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能。一方面，AnnexinA4可能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附能力。細(xì)胞黏附是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)，腫瘤細(xì)胞需要先脫離原發(fā)灶，然后黏附到血管或淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上，進(jìn)而進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)并在遠(yuǎn)處器官定植。已有研究表明，膜聯(lián)蛋白家族的一些成員能夠通過與細(xì)胞表面的黏附分子相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附特性。AnnexinA4可能通過與肝癌細(xì)胞表面的某些黏附分子結(jié)合，改變細(xì)胞間的黏附力，使肝癌細(xì)胞更容易脫離原發(fā)灶，從而促進(jìn)其轉(zhuǎn)移。另一方面，AnnexinA4可能影響細(xì)胞的遷移和侵襲能力。細(xì)胞遷移和侵襲是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，涉及細(xì)胞骨架的重排、細(xì)胞外基質(zhì)的降解等多個(gè)過程。AnnexinA4可能通過參與細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)的分子，如調(diào)節(jié)MMPs的表達(dá)或活性，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。本研究結(jié)果具有重要的意義。在理論層面，進(jìn)一步豐富了我們對肝癌轉(zhuǎn)移分子機(jī)制的認(rèn)識。以往對肝癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究主要集中在一些經(jīng)典的信號通路和分子上，而本研究發(fā)現(xiàn)AnnexinA4與肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的關(guān)聯(lián)，為深入探究肝癌轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了新的方向和靶點(diǎn)。這有助于我們從分子層面更全面地理解肝癌的發(fā)生發(fā)展過程，為后續(xù)的基礎(chǔ)研究奠定了基礎(chǔ)。在臨床應(yīng)用方面，本研究結(jié)果為肝癌的診斷和治療提供了潛在的靶點(diǎn)。如果能夠開發(fā)出針對AnnexinA4的檢測方法，通過檢測肝癌患者腫瘤組織或血液中AnnexinA4的表達(dá)水平，或許可以作為評估肝癌患者轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后的指標(biāo)。對于高表達(dá)AnnexinA4的肝癌患者，可采取更積極的治療策略，以降低腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。此外，以AnnexinA4為靶點(diǎn)開發(fā)新的治療藥物或治療方法，有望為肝癌患者提供更有效的治療手段。然而，本研究也存在一定的局限性。首先，本研究僅選取了兩種具有不同轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞株進(jìn)行研究，樣本數(shù)量相對較少，可能存在一定的局限性。未來的研究可以進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，納入更多不同類型和轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞株，以更全面地驗(yàn)證AnnexinA4與肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的關(guān)系。其次，本研究雖然發(fā)現(xiàn)了AnnexinA4表達(dá)與肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的相關(guān)性，但對于其具體的作用機(jī)制尚未進(jìn)行深入探討。雖然推測了AnnexinA4可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、遷移和侵襲等過程影響肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，但還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。后續(xù)研究可以采用基因編輯技術(shù)，如CRISPR-Cas9系統(tǒng)，對AnnexinA4基因進(jìn)行敲除或過表達(dá)，深入研究其對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及具體的分子機(jī)制。此外，本研究僅在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了研究，缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。細(xì)胞在體外培養(yǎng)環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境存在一定差異，因此未來需要開展動物實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建肝癌轉(zhuǎn)移動物模型，在體內(nèi)環(huán)境中驗(yàn)證AnnexinA4對肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響，以進(jìn)一步證實(shí)本研究結(jié)果的可靠性和臨床應(yīng)用價(jià)值。四、AnnexinA4基因RNAi后對肝癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響4.1實(shí)驗(yàn)材料與方法4.1.1實(shí)驗(yàn)材料本實(shí)驗(yàn)選用高轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞株MHCC97-H，該細(xì)胞株購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其高轉(zhuǎn)移特性使其成為研究AnnexinA4對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響的理想模型。AnnexinA4RNAi相關(guān)試劑方面，針對AnnexinA4基因設(shè)計(jì)的小干擾RNA（siRNA）序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。陰性對照siRNA（NC-siRNA）同樣由該公司提供，用于排除非特異性干擾，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司，它是一種高效的陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，能夠?qū)iRNA高效地導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)基因沉默。該試劑具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性低等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。其他主要試劑包括：RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司），為細(xì)胞提供生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境；胎牛血清（FBS，Gibco公司），富含多種生長因子和營養(yǎng)成分，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖；胰蛋白酶（Gibco公司），用于消化細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（BDBiosciences公司），利用AnnexinV與磷脂酰絲氨酸的特異性結(jié)合以及PI對核酸的染色特性，通過流式細(xì)胞術(shù)準(zhǔn)確檢測細(xì)胞凋亡情況；PI染色液（Solarbio公司），用于細(xì)胞周期檢測，通過對細(xì)胞DNA進(jìn)行染色，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布；CCK-8試劑（Dojindo公司），基于WST-8原理，通過檢測細(xì)胞線粒體中的脫氫酶活性來反映細(xì)胞增殖情況，具有操作簡單、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)；Matrigel基質(zhì)膠（Corning公司），模擬細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境，用于細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)，分析細(xì)胞的黏附能力。實(shí)驗(yàn)中使用的主要儀器設(shè)備有：CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），維持細(xì)胞生長所需的溫度、濕度和CO?濃度，為細(xì)胞提供穩(wěn)定的生長環(huán)境；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），提供無菌操作空間，防止細(xì)胞污染；低溫離心機(jī)（Eppendorf公司），在低溫條件下對樣品進(jìn)行離心分離，保證生物分子的活性和穩(wěn)定性；流式細(xì)胞儀（BDBiosciences公司），通過檢測細(xì)胞的熒光信號，對細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等生物學(xué)行為進(jìn)行精確分析；酶標(biāo)儀（Bio-Tek公司），用于檢測CCK-8實(shí)驗(yàn)中的吸光度值，從而分析細(xì)胞增殖情況；倒置顯微鏡（Olympus公司），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長狀態(tài)等，實(shí)時(shí)監(jiān)測細(xì)胞培養(yǎng)過程。4.1.2實(shí)驗(yàn)方法將MHCC97-H細(xì)胞株復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，將細(xì)胞以合適的密度接種于6孔板中，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度達(dá)到50%-60%。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作。在無菌EP管中，分別將AnnexinA4-siRNA和NC-siRNA與適量的Lipofectamine3000試劑混合，室溫孵育5分鐘，形成RNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。然后將復(fù)合物加入到含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中，輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6小時(shí)后，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在轉(zhuǎn)染過程中，嚴(yán)格控制操作條件，避免污染，確保轉(zhuǎn)染效率和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，提取細(xì)胞總RNA和總蛋白。RNA提取采用Trizol試劑法，具體步驟如前文所述。提取的RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測AnnexinA4mRNA的表達(dá)水平，引物序列及反應(yīng)條件同前文。蛋白質(zhì)提取采用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），提取方法如前文所述。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品調(diào)整至相同濃度后，進(jìn)行Westernblot檢測。以兔抗人AnnexinA4多克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，通過化學(xué)發(fā)光法檢測AnnexinA4蛋白的表達(dá)水平，具體操作步驟同前文。通過對比轉(zhuǎn)染AnnexinA4-siRNA和NC-siRNA的細(xì)胞中AnnexinA4的mRNA和蛋白表達(dá)水平，評估RNA干擾效果。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，加入500μlBindingBuffer重懸細(xì)胞。然后加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，輕輕混勻，避光室溫孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，立即用流式細(xì)胞儀檢測，分析細(xì)胞凋亡情況。根據(jù)AnnexinV-FITC和PI的染色結(jié)果，將細(xì)胞分為活細(xì)胞（AnnexinV-FITC陰性、PI陰性）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC陽性、PI陰性）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC陽性、PI陽性）和壞死細(xì)胞（AnnexinV-FITC陰性、PI陽性）四個(gè)群體，統(tǒng)計(jì)不同群體細(xì)胞的比例，評估AnnexinA4基因沉默對肝癌細(xì)胞凋亡的影響。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，加入70%預(yù)冷乙醇，4℃固定過夜。固定后的細(xì)胞用PBS洗滌2次，加入500μlPI染色液（含RNaseA），37℃避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，用流式細(xì)胞儀檢測，分析細(xì)胞周期分布。根據(jù)PI染色結(jié)果，分析細(xì)胞在G1期、S期和G2/M期的比例，評估AnnexinA4基因沉默對肝癌細(xì)胞周期的影響。轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞以每孔5000個(gè)的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)0小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)和96小時(shí)時(shí)，向每孔加入10μlCCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2-4小時(shí)。然后用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度值（OD值）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞增殖曲線。通過比較轉(zhuǎn)染AnnexinA4-siRNA和NC-siRNA的細(xì)胞增殖曲線，評估AnnexinA4基因沉默對肝癌細(xì)胞增殖的影響。在96孔板中每孔加入50μlMatrigel基質(zhì)膠，37℃孵育30分鐘，使其凝固。將轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的細(xì)胞用胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升1×10?個(gè)。每孔加入100μl細(xì)胞懸液，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。37℃孵育1小時(shí)后，用PBS輕輕洗滌3次，去除未黏附的細(xì)胞。然后每孔加入100μlCCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2-4小時(shí)。用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定OD值。通過比較轉(zhuǎn)染AnnexinA4-siRNA和NC-siRNA的細(xì)胞OD值，評估AnnexinA4基因沉默對肝癌細(xì)胞黏附能力的影響。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot檢測AnnexinA4的表達(dá)水平，以評估RNA干擾效果。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染NC-siRNA的對照組相比，轉(zhuǎn)染AnnexinA4-siRNA的實(shí)驗(yàn)組中AnnexinA4mRNA的表達(dá)水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。具體數(shù)據(jù)如圖3所示，對照組中AnnexinA4mRNA相對表達(dá)量設(shè)定為1，實(shí)驗(yàn)組中AnnexinA4mRNA相對表達(dá)量僅為對照組的[X]%。這表明AnnexinA4-siRNA能夠有效抑制AnnexinA4基因的轉(zhuǎn)錄，降低其mRNA水平。[此處插入圖3：AnnexinA4基因RNAi后mRNA表達(dá)水平柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別（對照組、實(shí)驗(yàn)組），縱坐標(biāo)為AnnexinA4mRNA相對表達(dá)量，*表示P<0.05]Westernblot檢測結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了RNA干擾的有效性。如圖4所示，實(shí)驗(yàn)組中AnnexinA4蛋白條帶的灰度值明顯低于對照組，經(jīng)圖像分析軟件計(jì)算，實(shí)驗(yàn)組中AnnexinA4蛋白的相對表達(dá)量（AnnexinA4蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白GAPDH灰度值比值）顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說明AnnexinA4-siRNA不僅在mRNA水平上抑制了AnnexinA4的表達(dá)，在蛋白水平上也成功降低了AnnexinA4的表達(dá)量，實(shí)現(xiàn)了對AnnexinA4基因的有效沉默。[此處插入圖4：AnnexinA4基因RNAi后蛋白表達(dá)水平Westernblot圖及柱狀圖，左圖為Westernblot圖，顯示AnnexinA4和GAPDH的蛋白條帶，右圖為柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別（對照組、實(shí)驗(yàn)組），縱坐標(biāo)為AnnexinA4蛋白相對表達(dá)量（AnnexinA4蛋白灰度值與GAPDH蛋白灰度值比值），*表示P<0.05]采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組中早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC陽性、PI陰性）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC陽性、PI陽性）的比例顯著增加。具體數(shù)據(jù)如表1所示，對照組中早期凋亡細(xì)胞比例為[X]%，晚期凋亡細(xì)胞比例為[X]%，而實(shí)驗(yàn)組中早期凋亡細(xì)胞比例升高至[X]%，晚期凋亡細(xì)胞比例升高至[X]%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明AnnexinA4基因沉默后，能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，促進(jìn)細(xì)胞死亡。[此處插入表1：AnnexinA4基因RNAi后肝癌細(xì)胞凋亡情況（%），表格包含組別、早期凋亡細(xì)胞比例、晚期凋亡細(xì)胞比例、壞死細(xì)胞比例、活細(xì)胞比例，對照組和實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)分別列出，*表示P<0.05與對照組相比]利用PI染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布。結(jié)果表明，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組中處于G1期的細(xì)胞比例顯著增加，而處于S期和G2/M期的細(xì)胞比例顯著減少。具體數(shù)據(jù)如圖5所示，對照組中G1期細(xì)胞比例為[X]%，S期細(xì)胞比例為[X]%，G2/M期細(xì)胞比例為[X]%；實(shí)驗(yàn)組中G1期細(xì)胞比例升高至[X]%，S期細(xì)胞比例降低至[X]%，G2/M期細(xì)胞比例降低至[X]%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說明AnnexinA4基因沉默后，肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程受到阻滯，細(xì)胞更多地停滯在G1期，抑制了細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)化，從而影響細(xì)胞的增殖。[此處插入圖5：AnnexinA4基因RNAi后肝癌細(xì)胞周期分布柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別（對照組、實(shí)驗(yàn)組），縱坐標(biāo)為各時(shí)期細(xì)胞比例（%），*表示P<0.05與對照組相比]通過CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖曲線，結(jié)果如圖6所示。在培養(yǎng)24小時(shí)后，實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞的OD值無明顯差異。但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，從48小時(shí)開始，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的OD值顯著低于對照組，且差異逐漸增大。在培養(yǎng)96小時(shí)時(shí)，對照組細(xì)胞的OD值為[X]，而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的OD值僅為[X]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明AnnexinA4基因沉默后，肝癌細(xì)胞的增殖能力受到明顯抑制，細(xì)胞生長速度減慢。[此處插入圖6：AnnexinA4基因RNAi后肝癌細(xì)胞增殖曲線，橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時(shí)間（小時(shí)），縱坐標(biāo)為OD值，實(shí)驗(yàn)組和對照組曲線分別用不同顏色或線條表示，*表示P<0.05與對照組相比]在細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)中，通過CCK-8法檢測細(xì)胞黏附到Matrigel基質(zhì)膠上的數(shù)量。結(jié)果顯示，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的OD值顯著降低。具體數(shù)據(jù)如表2所示，對照組細(xì)胞的OD值為[X]，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的OD值為[X]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明AnnexinA4基因沉默后，肝癌細(xì)胞的黏附能力明顯減弱，細(xì)胞難以黏附到細(xì)胞外基質(zhì)上，可能影響其在體內(nèi)的定植和轉(zhuǎn)移。[此處插入表2：AnnexinA4基因RNAi后肝癌細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果（OD值），表格包含組別、OD值，對照組和實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)分別列出，*表示P<0.05與對照組相比]4.3結(jié)果討論本研究通過RNA干擾技術(shù)沉默AnnexinA4基因，深入探究了其對肝癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響。結(jié)果顯示，AnnexinA4基因沉默后，肝癌細(xì)胞的凋亡顯著增加，細(xì)胞周期被阻滯在G1期，增殖能力明顯受到抑制，黏附能力也顯著減弱。這些結(jié)果表明AnnexinA4在肝癌細(xì)胞的生存、增殖、周期調(diào)控和黏附過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。從細(xì)胞凋亡角度來看，AnnexinA4基因沉默誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，可能與細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)信號通路的激活有關(guān)。在細(xì)胞凋亡過程中，存在著多條信號傳導(dǎo)通路，如線粒體凋亡通路和死亡受體凋亡通路。AnnexinA4可能通過調(diào)節(jié)這些通路中的關(guān)鍵分子，影響細(xì)胞凋亡的發(fā)生。有研究表明，膜聯(lián)蛋白家族成員可以與線粒體膜上的磷脂相互作用，調(diào)節(jié)線粒體的功能和穩(wěn)定性。AnnexinA4可能通過與線粒體膜上的磷脂結(jié)合，影響線粒體膜電位的變化，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子的釋放，激活下游的Caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，AnnexinA4還可能通過影響死亡受體通路中的相關(guān)分子，如Fas、TNF-α等受體及其配體的表達(dá)或活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。細(xì)胞周期的正常調(diào)控對于維持細(xì)胞的正常生長和增殖至關(guān)重要。本研究中AnnexinA4基因沉默導(dǎo)致肝癌細(xì)胞周期阻滯在G1期，這可能是由于AnnexinA4參與了細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)。在細(xì)胞周期的G1期，細(xì)胞需要接收一系列的信號刺激，才能順利進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制。AnnexinA4可能通過與細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）及其抑制劑（CKI）等關(guān)鍵分子相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)程。例如，AnnexinA4可能影響CyclinD-CDK4/6復(fù)合物的活性，該復(fù)合物在G1期向S期的轉(zhuǎn)化過程中起著關(guān)鍵作用。當(dāng)AnnexinA4表達(dá)被抑制時(shí)，可能導(dǎo)致CyclinD-CDK4/6復(fù)合物的活性降低，使得視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）不能被磷酸化，從而無法釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，進(jìn)而抑制了細(xì)胞從G1期向S期的過渡，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G1期。肝癌細(xì)胞的增殖能力受到抑制，與細(xì)胞凋亡的增加和細(xì)胞周期的阻滯密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡的增加導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量減少，而細(xì)胞周期的阻滯則抑制了細(xì)胞的分裂和增殖。此外，AnnexinA4基因沉默可能還影響了細(xì)胞內(nèi)與增殖相關(guān)的信號通路，如PI3K-Akt-mTOR信號通路等。該信號通路在細(xì)胞的生長、增殖和代謝等過程中發(fā)揮著重要作用。AnnexinA4可能通過與該信號通路中的關(guān)鍵分子相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖能力。當(dāng)AnnexinA4表達(dá)降低時(shí)，可能導(dǎo)致PI3K-Akt-mTOR信號通路的活性受到抑制，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖。細(xì)胞黏附能力的減弱可能對肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程產(chǎn)生重要影響。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移需要細(xì)胞能夠黏附到細(xì)胞外基質(zhì)和血管內(nèi)皮細(xì)胞上，然后穿過基底膜進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，并在遠(yuǎn)處器官定植。AnnexinA4基因沉默后，肝癌細(xì)胞黏附能力的下降，可能使得腫瘤細(xì)胞難以在體內(nèi)的新環(huán)境中定植和生長，從而抑制了腫瘤的轉(zhuǎn)移。AnnexinA4可能通過與細(xì)胞表面的黏附分子，如整合素家族成員等相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附能力。當(dāng)AnnexinA4表達(dá)被抑制時(shí)，可能影響整合素與細(xì)胞外基質(zhì)中配體的結(jié)合，從而降低細(xì)胞的黏附能力。本研究結(jié)果對于肝癌的治療具有潛在的重要意義。AnnexinA4作為一個(gè)與肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為密切相關(guān)的分子，有望成為肝癌治療的新靶點(diǎn)。通過開發(fā)針對AnnexinA4的靶向治療藥物，如小分子抑制劑、抗體藥物等，可能能夠特異性地抑制AnnexinA4的功能，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其凋亡、阻滯細(xì)胞周期并降低其黏附能力，達(dá)到治療肝癌的目的。將AnnexinA4與其他已有的治療方法，如手術(shù)、化療、放療、靶向治療等聯(lián)合應(yīng)用，可能會產(chǎn)生協(xié)同增效的作用，提高肝癌的治療效果。在化療過程中，聯(lián)合使用AnnexinA4靶向藥物，可能增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性，提高化療的療效，同時(shí)減少化療藥物的用量和副作用。然而，本研究也存在一些不足之處。本研究僅在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行，細(xì)胞在體外培養(yǎng)環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境存在較大差異，體內(nèi)環(huán)境中存在復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)、血管生成等因素，可能會影響AnnexinA4的功能和作用機(jī)制。因此，未來需要進(jìn)一步開展動物實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建肝癌動物模型，在體內(nèi)環(huán)境中驗(yàn)證AnnexinA4對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，以更好地評估其作為治療靶點(diǎn)的可行性和有效性。本研究雖然揭示了AnnexinA4對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，但對于其具體的分子機(jī)制尚未完全闡明。未來需要進(jìn)一步深入研究AnnexinA4與細(xì)胞內(nèi)其他分子的相互作用，以及相關(guān)信號通路的調(diào)控機(jī)制，為開發(fā)基于AnnexinA4的靶向治療策略提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。五、AnnexinA4基因RNAi后對細(xì)胞黏附相關(guān)分子表達(dá)的變化5.1實(shí)驗(yàn)材料與方法5.1.1實(shí)驗(yàn)材料本實(shí)驗(yàn)選用高轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞株MHCC97-H，其高轉(zhuǎn)移特性使其在研究細(xì)胞黏附相關(guān)分子表達(dá)變化中具有重要價(jià)值。主要試劑方面，AnnexinA4RNAi相關(guān)試劑同前，包括針對AnnexinA4基因設(shè)計(jì)的小干擾RNA（siRNA）由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，陰性對照siRNA（NC-siRNA）也由該公司提供，以及Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司。RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司）、胎牛血清（FBS，Gibco公司）、胰蛋白酶（Gibco公司）用于細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代。Trizol試劑（Invitrogen公司）用于提取細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（Roche公司）用于檢測基因的表達(dá)水平。兔抗人E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9多克隆抗體均購自Abcam公司，這些抗體能夠特異性地識別相應(yīng)的細(xì)胞黏附相關(guān)分子，用于后續(xù)的Westernblot檢測。HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購自JacksonImmunoResearchLaboratories公司，用于與一抗結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對目的蛋白的檢測。蛋白Marker購自ThermoFisherScientific公司，用于在蛋白質(zhì)電泳中確定蛋白質(zhì)的分子量大小。BCA蛋白定量試劑盒（Pierce公司）用于準(zhǔn)確測定蛋白質(zhì)樣品的濃度。實(shí)驗(yàn)中使用的主要儀器設(shè)備有：CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），維持細(xì)胞生長所需的溫度、濕度和CO?濃度，為細(xì)胞提供穩(wěn)定的生長環(huán)境；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），提供無菌操作空間，防止細(xì)胞污染；低溫離心機(jī)（Eppendorf公司），在低溫條件下對樣品進(jìn)行離心分離，保證生物分子的活性和穩(wěn)定性；PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad公司），用于進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Roche公司），能夠準(zhǔn)確地對目的基因進(jìn)行定量分析；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于對蛋白質(zhì)或核酸凝膠進(jìn)行成像和分析；電泳儀（Bio-Rad公司），用于進(jìn)行蛋白質(zhì)和核酸的電泳分離。5.1.2實(shí)驗(yàn)方法將MHCC97-H細(xì)胞株復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，將細(xì)胞以合適的密度接種于6孔板中，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度達(dá)到50%-60%。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作。在無菌EP管中，分別將AnnexinA4-siRNA和NC-siRNA與適量的Lipofectamine3000試劑混合，室溫孵育5分鐘，形成RNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。然后將復(fù)合物加入到含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中，輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6小時(shí)后，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，采用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。棄去細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞2-3次，去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。向培養(yǎng)瓶中加入1mlTrizol試劑，用移液器吹打均勻，使細(xì)胞充分裂解，室溫靜置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，加入0.2ml氯仿，蓋緊管蓋，劇烈振蕩15秒，使溶液充分混合，室溫靜置3分鐘。4℃、12000rpm離心15分鐘，此時(shí)樣品會分成三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中間層為白色的蛋白層；下層為紅色的有機(jī)相。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后，-20℃放置20分鐘，使RNA沉淀。4℃、12000rpm離心10分鐘，棄去上清液，此時(shí)可見管底有白色膠狀沉淀，即為RNA沉淀。加入1ml75%乙醇（用DEPC水配制），輕輕洗滌RNA沉淀，4℃、7500rpm離心5分鐘，棄去上清液。重復(fù)洗滌步驟一次，將離心管倒置在濾紙上，室溫晾干5-10分鐘，注意不要使RNA沉淀完全干燥，以免影響其溶解。向離心管中加入適量的DEPC水，輕輕吹打使RNA溶解，-70℃保存?zhèn)溆?。使用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在冰上配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，總體積為20μl，包括5×PrimeScriptBuffer4μl、PrimeScriptRTEnzymeMixI1μl、Oligo(dT)Primer1μl、Random6mers1μl、TotalRNA1μg，用DEPC水補(bǔ)足至20μl。將反應(yīng)體系輕輕混勻后，短暫離心，使液體集中于管底。將離心管放入PCR擴(kuò)增儀中，按照以下程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：37℃15分鐘，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；85℃5秒鐘，使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，將cDNA產(chǎn)物保存于-20℃?zhèn)溆?。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用Roche實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。在冰上配制PCR反應(yīng)體系，總體積為20μl，包括2×LightCycler480SYBRGreenIMaster10μl、上下游引物各0.5μl（10μM）、cDNA模板1μl，用ddH?O補(bǔ)足至20μl。E-cadherin的引物序列為：上游引物5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'，下游引物5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'；N-cadherin的引物序列為：上游引物5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'，下游引物5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'；Vimentin的引物序列為：上游引物5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'，下游引物5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'；MMP-2的引物序列為：上游引物5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'，下游引物5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'；MMP-9的引物序列為：上游引物5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'，下游引物5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'。將反應(yīng)體系輕輕混勻后，加入到96孔板中，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將96孔板放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性10秒鐘，60℃退火30秒鐘，72℃延伸30秒鐘，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；最后進(jìn)行熔解曲線分析，以驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算各基因mRNA的相對表達(dá)量，其中ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(GAPDH)，ΔΔCt=ΔCt(實(shí)驗(yàn)組)-ΔCt(對照組)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，采用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）提取細(xì)胞總蛋白。棄去細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞2-3次，去除殘留的培養(yǎng)基。向培養(yǎng)瓶中加入適量的RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，期間不斷輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞充分裂解。將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即為細(xì)胞總蛋白提取物。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。按照試劑盒說明書，將BCA工作液與蛋白樣品按一定比例混合，在96孔板中每孔加入20μl蛋白樣品和200μlBCA工作液，輕輕混勻。37℃孵育30分鐘，使蛋白與BCA試劑充分反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在562nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。將蛋白樣品調(diào)整至相同濃度后，加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸5分鐘，使蛋白變性，-20℃保存?zhèn)溆?。采?0%的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離蛋白。將變性后的蛋白樣品上樣，每孔上樣量為20μg，同時(shí)加入蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在電泳緩沖液中，以80V的電壓進(jìn)行濃縮膠電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠取出，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15分鐘。采用半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。在轉(zhuǎn)膜儀中，按照陽極（海綿墊、濾紙、PVDF膜、凝膠、濾紙、海綿墊）的順序依次放置，確保各層之間無氣泡。在15V電壓下轉(zhuǎn)膜2小時(shí)，使蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉封閉液中，室溫封閉1小時(shí)，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入兔抗人E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9多克隆抗體（1:1000稀釋）中，4℃孵育過夜，使抗體與目的蛋白特異性結(jié)合。次日，將PVDF膜取出，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的抗體。然后將PVDF膜放入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1:5000稀釋）中，室溫孵育1小時(shí)，使二抗與一抗特異性結(jié)合。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的二抗。最后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑對PVDF膜進(jìn)行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光成像，分析細(xì)胞黏附相關(guān)分子蛋白的表達(dá)情況。5.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測細(xì)胞黏附相關(guān)分子E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染NC-siRNA的對照組相比，轉(zhuǎn)染AnnexinA4-siRNA的實(shí)驗(yàn)組中E-cadherinmRNA的表達(dá)水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。具體數(shù)據(jù)如圖7所示，對照組中E-cadherinmRNA相對表達(dá)量設(shè)定為1，實(shí)驗(yàn)組中E-cadherinmRNA相對表達(dá)量升高至對照組的[X]倍。這表明AnnexinA4基因沉默后，能夠促進(jìn)E-cadherin基因的轉(zhuǎn)錄，使其mRNA水平上升。[此處插入圖7：RNA干擾后E-cadherinmRNA表達(dá)水平柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別（對照組、實(shí)驗(yàn)組），縱坐標(biāo)為E-cadherinmRNA相對表達(dá)量，*表示P<0.05]實(shí)驗(yàn)組中N-cadherin和VimentinmRNA的表達(dá)水平則顯著降低。其中，N-cadherinmRNA相對表達(dá)量降低至對照組的[X]%，VimentinmRNA相對表達(dá)量降低至對照組的[X]%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。具體數(shù)據(jù)如圖8所示，這說明AnnexinA4基因沉默抑制了N-cadherin和Vimentin基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致其mRNA表達(dá)量下降。[此處插入圖8：RNA干擾后N-cadherin和VimentinmRNA表達(dá)水平柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別（對照組、實(shí)驗(yàn)組），縱坐標(biāo)為mRNA相對表達(dá)量，*表示P<0.05]對于MMP-2和MMP-9，實(shí)驗(yàn)組中它們的mRNA表達(dá)水平也顯著低于對照組。MMP-2mRNA相對表達(dá)量降低至對照組的[X]%，MMP-9mRNA相對表達(dá)量降低至對照組的[X]%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。具體數(shù)據(jù)如圖9所示，表明AnnexinA4基因沉默對MMP-2和MMP-9基因的轉(zhuǎn)錄具有抑制作用。[此處插入圖9：RNA干擾后MMP-2和MMP-9mRNA表達(dá)水平柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別（對照組、實(shí)驗(yàn)組），縱坐標(biāo)為mRNA相對表達(dá)量，*表示P<0.05]進(jìn)一步通過Westernblot檢測細(xì)胞黏附相關(guān)分子的蛋白表達(dá)水