分子生物學(xué)技術(shù)

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)PCR能夠?qū)σ粋€DNA分子上任何一段兩端序列已知的區(qū)域進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。引物：依據(jù)已知的兩端序列合成的寡核苷酸單鏈。限定了將要被擴(kuò)增的區(qū)域。Taq酶：從嗜熱水生菌(Thrmusaquaticus)中獲得的DNA聚合酶Ⅰ，在熱變性時不會失活。PCR反應(yīng)步驟

PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成①模板DNA變性：94℃時雙鏈模板DNA解離成單鏈②模板DNA與引物退火：溫度降至55℃左右時引物與模板DNA單鏈上的互補(bǔ)序列結(jié)合③引物的延伸：在引物的引導(dǎo)下，Taq酶以dNTP為原料，以靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理合成一條與靶序列互補(bǔ)的復(fù)制鏈K.B.Mullis3‘5‘5‘3‘94℃變性退火3‘3‘5‘5‘將要被擴(kuò)增的區(qū)域Taq酶和dNTP5‘5‘3‘3‘引物3‘3‘5‘5‘5‘3‘合成新鏈第二輪變性第二輪退火、延伸原始模板第一輪反應(yīng)產(chǎn)物25-30輪反應(yīng)PCR-SSCP技術(shù)1989年問世的PCR-SSCP(Single-StrandConformationPolymorphism，SSCP

)作為檢測基因突變的方法，經(jīng)不斷地改進(jìn)和完善，更為簡便、快速、靈敏，不但用于檢測基因點突

變和短序列的缺失和插入，而且還被用于DNA定量分析原理單鏈DNA片段————復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象當(dāng)堿基改變時————構(gòu)象發(fā)生改變因此，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，可以非常敏銳地將構(gòu)象上有差異的分子分離開，該方法為單鏈構(gòu)象多態(tài)性，將SSCP用于檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的基因突變，從而建立了PCR-SSCP技術(shù)試驗程序與結(jié)果分析PCR產(chǎn)物單鏈電泳

變性徹底（2條帶）變性不徹底(3條帶）如果與正常的對照相比，兩條單鏈形成的條帶位置有了改變，則表明有堿基突變存在。因此，要仔細(xì)設(shè)置對照，仔細(xì)分析出現(xiàn)的異常條帶則不難確定突變的存在。熱變性優(yōu)點

高檢測率，小于300bp的DNA片段中的單堿基突變，90%可被SSCP發(fā)現(xiàn)

不足之處（1）只能作為一種突變檢測方

法，要最后確定突變的位置和類型，還需進(jìn)一步測序（2）由于SSCP是依據(jù)點突變引起單鏈DNA分子立體構(gòu)象的改變來實現(xiàn)電泳分離的，這樣就可能會出現(xiàn)當(dāng)某些位置的點突變對單鏈DNA分子立體構(gòu)象的改變不起作用或作用很小

時，再加上其他條件的影響，使聚丙烯酰胺凝膠電泳無法分辨造成漏檢PCR-SSCP技術(shù)應(yīng)用該方法大量地用于檢測和腫瘤發(fā)生有關(guān)的基因突變，例如檢測星形細(xì)胞瘤、腦瘤、小細(xì)胞肺癌、胃癌、腸癌等腫瘤中的

p53基因的突變、肺癌的ras基因突變等。

總之，SSCP分析法是一種快速、簡便、靈敏的突變檢測方法，適合臨床實驗室的要求.它可以檢測各種點突變，短核苷酸序列的缺失或插入.隨著SSCP分析不斷完善，它將成為基因診斷研究的一個有力工具.PCR-SSCP技術(shù)原位雜交原理與方法原位雜交組化（簡稱原位雜交，insituhybridizationhistochemistry；ISHH）屬于分子雜交的一種，是一種應(yīng)用標(biāo)記探針與組織細(xì)胞中的待測核酸雜交，再應(yīng)用標(biāo)記物相關(guān)的檢測系統(tǒng)，在核酸原有的位置將其顯示出來的一種檢測技術(shù)。

當(dāng)然雜交分子的形成并不要求兩條單鏈的堿基順序完全互補(bǔ)，所以不同來源的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補(bǔ)順序（即某種程度的同源性）就可以形成雜交雙鏈。探針的種類1、同位素標(biāo)記探針：同位素標(biāo)記物有3H、35S、125I和32P。2、非同位素標(biāo)記探針：生物素、地高辛和熒光素三種。

按核酸性質(zhì)

DNA探針、cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸探針。

原位雜交分為菌落原位雜交和組織原位雜交。菌落原位雜交（Colonyinsituhybridization）

菌落原位雜交是將細(xì)菌從培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋出DNA。將DNA烘干固定于膜上與32P標(biāo)記的探針雜交，放射自顯影檢測菌落雜交信號，并與平板上的菌落對位。組織原位雜交（Tissueinsituhybridization）

組織原位雜交簡稱原位雜交，指組織或細(xì)胞的原位雜交，它與菌落的原位雜交不同。菌落原位雜交需裂解細(xì)菌釋出DNA，然后進(jìn)行雜交。而原位雜交是經(jīng)適當(dāng)處理后，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交。熒光原位雜交技術(shù)（FISH)檢測細(xì)胞染色體畸變熒光原位雜交技術(shù)使在原位雜交的基礎(chǔ)上建立起來的染色體和基因分析技術(shù)，它通過熒光標(biāo)記的各類DNA,RNA探針與細(xì)胞或組織在載玻片上進(jìn)行雜交，不改變其結(jié)構(gòu)和分布格局，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)特定序列的測定。避免了使用放射性同位素帶來的問題，該方法定位的DNA序列已經(jīng)從1kb發(fā)展到整條染色體的范圍試驗步驟探針制備：主要通過質(zhì)粒重組，PCR擴(kuò)增，和人工合成探針的標(biāo)記：1.直接標(biāo)記法：將熒光分子直接標(biāo)記于探針

優(yōu)點：快捷方便，背景干擾少缺點：雜交信號弱，信號不能放大2.間接標(biāo)記法:采用中間分子標(biāo)記探針，雜交后再用中間分子的親和物或抗體進(jìn)行檢測，常用的中間分子是生物素和地高辛原位雜交：染色體DNA變性單鏈熒光標(biāo)記探針變性單鏈熒光檢測：對生物素標(biāo)記的探針一般用熒光標(biāo)記的卵白素檢測對其它的中間分子用相應(yīng)的抗體來檢測，常用的熒光標(biāo)記分子有AMAC(藍(lán)光），羅丹明（紅光）等復(fù)性雜交應(yīng)用：1檢測中期，間期細(xì)胞染色體畸變2.哺乳動物精子非整倍體檢測等Southern印跡雜交基本原理

具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下，可按堿基互補(bǔ)的原則形成雙鏈，此雜交過程是高度特異的。Southern包括兩個主要過程：

1.是將待測定核酸分子通過一定的方法轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定的固相支持物（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，即印跡（blotting）

2.是固定于膜上的核酸同位素標(biāo)記的探針在一定的溫度和離子強(qiáng)度下退火，即分子雜交過程。該技術(shù)是1975年英國愛丁堡大學(xué)的E.M.Southern首創(chuàng)的，Southern印跡雜交故因此而得名。利用Southern印跡法可鑒定基因的缺失、突變、重排用于癌癥以及其他的基因疾病的鑒定HIV及其他病毒感染疾病的診斷實驗方法制備待測DNADNA限制酶消化

瓊脂糖凝膠電泳分離待測DNA樣品電泳凝膠預(yù)處理轉(zhuǎn)膜探針標(biāo)記預(yù)雜交Southern雜交洗膜和探針檢測瓊脂糖凝膠電泳的基本原理瓊脂糖凝膠是由瓊脂糖形成的網(wǎng)狀物質(zhì)，具有分子篩作用。在相應(yīng)的電泳緩沖液中，DNA在電場的作用下由負(fù)極向正極泳動，分子越大，泳動速度越慢；反之，分子小則泳動速度快，而大小相同的分子則泳動速度相同。因此在恒定的電場下，經(jīng)過一段時間電泳后，DNA按分子大小在凝膠中形成許多條帶電泳凝膠預(yù)處理DNA樣品在制備和電泳過程中始終保持雙鏈結(jié)構(gòu)分子量超過10kb的較大的DNA片段需要更長的轉(zhuǎn)移時間。所以為了使DNA片段在合理的時間內(nèi)從凝膠中移動出來，必須將最長的DNA片段控制在大約2kb以下因此，通常是將電泳凝膠浸泡在0.25mol/L的HCl溶液短暫的脫嘌呤處理之后，移至于堿性溶液中浸泡，使DNA變形并斷裂形成較短的單鏈DNA片段，這樣，DNA片段經(jīng)過堿變性作用，亦會使之保持單鏈狀態(tài)而易于同探針分子發(fā)生雜交作用轉(zhuǎn)膜將凝膠中的單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移到固相支持物上

DNA是沿與凝膠平面垂直的方向移出并轉(zhuǎn)移到膜上，因此，凝膠中的DNA片段雖然在堿變性過程已經(jīng)變性成單鏈并已斷裂，轉(zhuǎn)移后各個DNA片段在膜上的相對位置與在凝膠中的相對位置仍然一樣，故而稱為印跡

固相支持物硝酸纖維素膜（NC膜）、尼龍（Nylon）膜、化學(xué)活化膜和濾紙等轉(zhuǎn)膜方法細(xì)管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)移法、真空轉(zhuǎn)移法

電轉(zhuǎn)移：通過電泳作用將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上真空轉(zhuǎn)移法：濾膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個真空室上，利用真空作用帶動核酸片段轉(zhuǎn)移到尼龍膜或硝酸纖維素膜上。探針標(biāo)記Southern印跡雜交的探針可以是純化的DNA片段或寡核苷酸片段探針可以用放射性物質(zhì)標(biāo)記或用地高辛標(biāo)記，放射性標(biāo)記靈敏度高，效果好；地高辛標(biāo)記沒有半衰期，安全性好。

預(yù)雜交（prehybridizafion）能結(jié)合DNA片段的膜同樣能夠結(jié)合探針DNA，在進(jìn)行雜交前，必須將膜上所有能與DNA結(jié)合的位點全部封閉。

預(yù)雜交液實際上就是不含探針的雜交液，其中主要含有鮭魚精子DNA（該DNA與哺乳動物的同源性極低，不會與DNA探針雜交）、牛血清等，這些大分子可以封閉膜上所有非特異性吸附位點。雜交標(biāo)記的探針DNA和待測順序之間具有非常高的同源性時，才能在一定的雜交條件下結(jié)合

Westernblotting把電泳分離的組分（蛋白）從凝膠轉(zhuǎn)移到一種固相支持體（尼龍膜、PVDF膜），并以針對特定氨基酸序列的特異性試劑作為探針Western使用的探針是抗體，它與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反應(yīng)實驗方法蛋白樣品制備蛋白含量的測定：G-250考馬斯亮藍(lán)溶液

SDS－PAGE電泳轉(zhuǎn)膜：電轉(zhuǎn)移預(yù)雜交：牛奶、BSA免疫反應(yīng)化學(xué)發(fā)光檢測SDS（PolyAcrylamideGelElectrophoresis

）電泳介質(zhì)：聚丙烯酰胺（PAGE）帶電的粒子（蛋白質(zhì)）在電場的作用下移動的速度決定于各蛋的帶電量和帶電分子的大小。凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS（十二烷基磺酸鈉），SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，強(qiáng)還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的SDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的，因此在進(jìn)行電泳時，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小。蛋白變性液：5％SDS,10%巰基乙醇，30％甘油，Tris緩沖分子量的計算當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bRf

，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量溴酚蘭前沿Rf97

Rf63

R