選修3當(dāng)代生物科技專項專項1基因工程DNA重組技術(shù)的基本工具

基礎(chǔ)梳理1.基因工程的概念基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計，通過__________和__________，賦予生物以__________的遺傳特性，發(fā)明出符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品?；蚬こ淌窃赺_________上進(jìn)行設(shè)計和施工的，又叫做__________。DNA重組技術(shù)體外DNA重組轉(zhuǎn)基因技術(shù)新DNA分子水平2.基因工程的基本工具(1)“分子手術(shù)刀”——__________①來源：重要是從__________中分離純化出來的。②功效：能夠識別雙鏈DNA分子的某種__________的核苷酸序列，并且使每一條鏈中__________部位的兩個核苷酸之間的__________斷開，因此含有__________性。③成果：經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端普通有兩種形式：__________和__________。專一限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）原核生物特定特定磷酸二酯鍵黏性末端平末端(2)“分子縫合針”——__________①兩種DNA連接酶（E?coliDNA連接酶和T4-DNA連接酶）的比較：a.相似點：都縫合__________鍵。b.區(qū)別：E?coliDNA連接酶來源于__________，只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的__________之間的磷酸二酯鍵連接起來；而T4DNA連接酶能縫合__________，但連接平末端之間的磷酸二酯鍵效率較__________。②與DNA聚合酶作用的異同:DNA聚合酶只能將__________加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶是連接__________的末端，形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶大腸桿菌磷酸二酯黏性末端兩種末端低單個核苷酸兩個DNA片段(3)“分子運(yùn)輸車”——__________①運(yùn)載體含有的條件a.能在受體細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存。b.含有一至多個限制酶切點，供外源DNA片段插入。c.含有標(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。②最慣用的運(yùn)載體是__________,它是一種裸露的、構(gòu)造簡樸的、獨立于__________核區(qū)DNA之外，并含有__________的雙鏈__________DNA分子。③其它運(yùn)載體：__________、__________。動植物病毒載體質(zhì)粒細(xì)菌自我復(fù)制能力環(huán)狀噬菌體

一、基因工程的概念基因工程的別名基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)操作環(huán)境生物體外操作對象基因操作水平DNA分子水平基本過程剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)結(jié)果人類需要的基因產(chǎn)物歸納整合二、DNA連接酶與DNA聚合酶DNA連接酶與DNA聚合酶都能形成磷酸二酯鍵，但兩者的性質(zhì)各不相似。（1）DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而DNA連接酶是在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，不是在單個核苷酸與DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。（2）DNA聚合酶是以一條DNA鏈為模板，將單個核苷酸通過磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈；而DNA連接酶是將DNA雙鏈上的兩個缺口同時連接起來。因此DNA連接酶不需要模板。（3）另外還介紹幾個酶①解旋酶：該酶能在DNA復(fù)制或轉(zhuǎn)錄時破壞DNA堿基對間的氫鍵，從而將雙螺旋打開。②DNA水解酶：該酶能催化DNA水解。③RNA聚合酶：該酶能在轉(zhuǎn)錄時將單個的核糖核苷酸連接成RNA單鏈。④限制酶：該酶的作用是識別特定的核苷酸序列，并在特定位點上切割DNA分子。三、基因工程的操作工具1.“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶2.“分子縫合針”——DNA連接酶3.“分子運(yùn)輸車”——基因進(jìn)入受體細(xì)胞的運(yùn)載體(1)使用運(yùn)載體的目的在基因工程中使用運(yùn)載體有兩個目的：一是用它作為運(yùn)載工具，將目的基因轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中去；二是運(yùn)用它在宿主細(xì)胞內(nèi)對目的基因進(jìn)行大量的復(fù)制。(2)運(yùn)載體的種類現(xiàn)在所運(yùn)用的運(yùn)載體重要有兩類：一類是細(xì)菌的質(zhì)粒，它是一種相對分子質(zhì)量較小、獨立于細(xì)菌核區(qū)DNA之外的雙鏈環(huán)狀DNA。另一類運(yùn)載體是噬菌體或某些滅活的病毒等?，F(xiàn)在人們還在尋找新的運(yùn)載體，如葉綠體或線粒體等也可能成為運(yùn)載體。

(3)作為運(yùn)載體必須含有的條件：①能復(fù)制能在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定地保存并大量復(fù)制，以便提供大量的目的基因②具有多個限制酶切點具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接。每種酶的切點最好只有一個，如大腸桿菌pBR322就有多種限制酶的單一識別位點，可適用于多種限制酶切割的DNA插入③具有某些標(biāo)記基因具有某些標(biāo)記基因，以便進(jìn)行篩選。如大腸桿菌的pBR322質(zhì)粒攜帶四環(huán)素抗性基因，就可以作為篩選的標(biāo)記基因④對宿主細(xì)胞無害載體必須是安全的，對宿主細(xì)胞無害⑤載體DNA大小應(yīng)合適載體DNA分子大小應(yīng)合適，以便提取和在體外進(jìn)行操作，太小就不能操作3.“分子運(yùn)輸車”——基因進(jìn)入受體細(xì)胞的運(yùn)載體普通來說，天然運(yùn)載體往往不能滿足上述規(guī)定，因此必須根據(jù)不同的目的和需要，對運(yùn)載體進(jìn)行人工改造。現(xiàn)在使用的質(zhì)粒運(yùn)載體幾乎都是通過改造的。1．(2010·全國Ⅱ，5)下列敘述符合基因工程概念的是A．B淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞融合，雜交瘤細(xì)胞中含有B淋巴細(xì)胞中的抗體基因B．將人的干擾素基因重組到質(zhì)粒后導(dǎo)入大腸桿菌，獲得能產(chǎn)生人干擾素的菌株C．用紫外線照射青霉菌，使其DNA發(fā)生變化，通過篩選獲得青霉素高產(chǎn)菌株D．自然界中天然存在的噬菌體自行感染細(xì)菌后其DNA整合到細(xì)菌DNA上答案：B2．(2010·浙江理綜，2)在用基因工程技術(shù)構(gòu)建抗除草劑的轉(zhuǎn)基因煙草過程中，下列操作錯誤的是()A．用限制性核酸內(nèi)切酶切割煙草花葉病毒的核酸B．用DNA連接酶連接經(jīng)切割的抗除草劑基因和載體C．將重組DNA分子導(dǎo)入煙草原生質(zhì)體D．用含除草劑的培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞答案：A基因工程的基本操作程序

基礎(chǔ)梳理基因工程的基本操作程序涉及：目的基因的獲取、基因體現(xiàn)運(yùn)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞及目的基因的體現(xiàn)與檢測等四個環(huán)節(jié)。1.目的基因的獲取(1)目的基因：__________。(2)原核基因采用__________獲得，真核基因通過__________獲得。人工合成目的基因的慣用辦法有__________和__________。編碼蛋白質(zhì)的構(gòu)造基因直接分離人工合成反轉(zhuǎn)錄法化學(xué)合成法(3)PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因①原理：__________。②過程第一步：加熱至90～95℃__________；第二步：冷卻到55～60℃，引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈；第三步：加熱至70～75℃，熱穩(wěn)定DNA聚合酶從引物起始互補(bǔ)鏈的合成。2.基因體現(xiàn)運(yùn)載體的構(gòu)建(1)目的：使目的基因在受體細(xì)胞中__________，并且能夠__________，使目的基因能夠__________。(2)構(gòu)成：__________＋__________＋__________＋__________DNA解鏈DNA雙鏈復(fù)制標(biāo)記基因穩(wěn)定存在遺傳至下一代體現(xiàn)和發(fā)揮作用目的基因啟動子終止子1.目的基因的獲取慣用辦法：①從基因文庫獲取目的基因基因組文庫（一種生物的全部基因）部分基因文庫：如cDNA文庫（部分基因）②運(yùn)用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因原理：生物體外DNA雙鏈復(fù)制的原理③通過DNA合成儀直接人工合成基因較小，核苷酸序列已知，能夠人工合成。

考點歸納啟動子終止子目的基因標(biāo)記基因表達(dá)載體模式圖2.基因體現(xiàn)載體的構(gòu)建目的：是使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且能夠遺傳給下一代(核心）①啟動子：是一段有特殊構(gòu)造的__________，位于基因的__________，是__________識別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出__________，最后獲得所需的__________。②終止子：也是一段有特殊構(gòu)造的__________，位于基因的__________。③標(biāo)記基因的作用：是為了鑒定受體細(xì)胞中與否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來。慣用的標(biāo)記基因是__________。DNA片段首端RNA聚合酶mRNA蛋白質(zhì)DNA片段尾端抗生素基因3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞(1)轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和體現(xiàn)的過程。(2)慣用的轉(zhuǎn)化辦法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞：采用最多的辦法是__________，另首先尚有__________和__________等。將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞：最慣用的辦法是__________。此辦法的受體細(xì)胞多是__________。將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞：原核生物作為受體細(xì)胞的因素是__________________________，最慣用的原核細(xì)胞是____________________________。其轉(zhuǎn)化辦法是：先用__________解決細(xì)胞，使其成為__________，再將重組體現(xiàn)運(yùn)載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合，在一定的溫度下增進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸取DNA分子，完畢轉(zhuǎn)化過程。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射技術(shù)受精卵繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對較少大腸桿菌Ca2+感受態(tài)細(xì)胞(3)重組細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞后，篩選含有基因體現(xiàn)運(yùn)載體的受體細(xì)胞的根據(jù)是__________與否體現(xiàn)。標(biāo)記基因3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞中的辦法的比較生物種類植物細(xì)胞動物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,基因槍法，花粉管通道法顯微注射法Ca2＋解決法體細(xì)胞受精卵原核細(xì)胞目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞的染色體DNA→體現(xiàn)目的基因體現(xiàn)載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得含有新性狀的動物Ca2＋解決細(xì)胞→感受態(tài)細(xì)胞→重組體現(xiàn)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合→感受態(tài)細(xì)胞吸取DNA分子4.目的基因的檢測與鑒定(1)首先要檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上與否插入了目的基因，辦法是采用_____________________________。(2)另首先還要檢測目的基因與否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，辦法是采用_____________________________________。(3)最后檢測目的基因與否翻譯成蛋白質(zhì)，辦法是從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用對應(yīng)的抗體進(jìn)行_________。(4)有時還需進(jìn)行______________的鑒定。如轉(zhuǎn)基因抗蟲植物與否出現(xiàn)抗蟲性狀。個體生物學(xué)水平DNA分子雜交技術(shù)用標(biāo)記的目的基因作探針與mRNA雜交抗原－抗體雜交4.目的基因的檢測內(nèi)容和辦法的比較類型步驟檢測內(nèi)容方法結(jié)果顯示分子水平檢測第一步

第二步第三步個體水平鑒定目的基因與否插入受體細(xì)胞染色體的DNA上DNA分子雜交技術(shù)(DNA和DNA之間)與否成功顯示出雜交帶目的基因與否轉(zhuǎn)錄出mRNA核酸分子雜交技術(shù)(DNA和mRNA之間)同上目的基因與否翻譯出蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)分子雜交(抗原—抗體之間)同上涉及抗蟲或抗病的接種實驗；基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品進(jìn)行活性比較，以擬定功效與否相似等總結(jié)：兩者的構(gòu)成成分及構(gòu)造基本相似目的基因通過轉(zhuǎn)錄和翻譯體現(xiàn)遺傳信息生物共用一套遺傳密碼基因重組一、基因工程有關(guān)原理歸納整合一、外顯子與內(nèi)含子普通來說，真核細(xì)胞的基因都是由外顯子和內(nèi)含子構(gòu)成。原核細(xì)胞的基因真核細(xì)胞的基因不同點編碼區(qū)連續(xù)，無內(nèi)含子，結(jié)構(gòu)簡單編碼區(qū)有間隔，不連續(xù)，有內(nèi)含子；結(jié)構(gòu)復(fù)雜相同點都有編碼區(qū)和非編碼區(qū)；編碼區(qū)都有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列；編碼區(qū)上游都有與RNA聚合酶結(jié)合的位點二、原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因構(gòu)造的比較基因工程的應(yīng)用及生物技術(shù)安全性

基礎(chǔ)梳理1.植物基因工程：抗蟲、抗病、抗逆轉(zhuǎn)基因植物，運(yùn)用轉(zhuǎn)基因改良植物的__________。2.動物基因工程：提高動物生長速度、改善畜產(chǎn)品品質(zhì)、用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)__________。3.基因治療：_______________導(dǎo)入病人體內(nèi)，使該基因體現(xiàn)產(chǎn)物發(fā)揮作用。把正常的外源基因品質(zhì)藥品二、植物基因工程與動物基因工程的成果外源基因類型及舉例成果舉例抗蟲轉(zhuǎn)基因植物抗蟲基因：Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制劑基因、淀粉酶抑制劑基因抗蟲水稻、抗蟲棉、抗蟲玉米抗病轉(zhuǎn)基因植物抗病毒基因：病毒外殼蛋白基因、病毒的復(fù)制酶基因抗真菌基因：幾丁質(zhì)酶基因抗病毒煙草、抗病毒小麥、抗病毒番茄、抗病毒甜椒抗逆轉(zhuǎn)基因植物抗逆基因：滲透壓調(diào)節(jié)基因、抗凍蛋白基因、抗除草劑基因抗鹽堿和抗干旱的煙草、抗寒番茄、抗除草劑的大豆和玉米外源基因類型及舉例成果舉例改良品質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植物優(yōu)良性狀基因：提高必需氨基酸含量的蛋白質(zhì)編碼基因、控制番茄成熟的基因、與花青素代謝有關(guān)的基因高賴氨酸玉米、耐儲存番茄、新花色矮牽牛提高生長速度的轉(zhuǎn)基因動物外源生長激素基因轉(zhuǎn)基因綿羊、轉(zhuǎn)基因鯉魚改善畜產(chǎn)品品質(zhì)的轉(zhuǎn)基因動物腸乳糖酶基因乳汁中含乳糖較少的轉(zhuǎn)基因外源基因類型及舉例成果舉例生產(chǎn)藥物的轉(zhuǎn)基因動物藥用蛋白基因+乳腺蛋白基因的啟動子等調(diào)控組件轉(zhuǎn)基因動物具有乳腺生物反應(yīng)器作器官轉(zhuǎn)移植供體的轉(zhuǎn)基因動物將外源的抗原決定基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子導(dǎo)入到器官供體基因組或除去供體的抗原決定基因無免疫排斥反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因豬1．安全性問題 (1)食物安全方面：可能合成出毒蛋白，出現(xiàn)新的過敏原，變化食物的營養(yǎng)成分。 (2)生物安全方面：有可能造成“基因污染”，危害生物的多樣性。 (3)環(huán)境安全方面：有可能打破物種界限，變化生態(tài)系統(tǒng)的能量流動和物質(zhì)循環(huán)；造成二次污染或產(chǎn)生出危害動、植物和人類的生物或產(chǎn)物。轉(zhuǎn)基因生物的安全性問題

2．轉(zhuǎn)基因生物存在安全性的因素 (1)現(xiàn)在對基因的構(gòu)造、調(diào)控機(jī)制及基因間的互相作用理解有限； (2)目的基因往往是異種生物的基因； (3)外源基因插入宿主基因組的部位往往是隨機(jī)的。3．理性看待轉(zhuǎn)基因生物 (1)轉(zhuǎn)基因生物的優(yōu)缺點分析優(yōu)點缺點1.解決糧食短缺問題2．減少農(nóng)藥使用，減少環(huán)境污染3．增加食物營養(yǎng)，提高附加值4．增加食物種類，提升食物品質(zhì)5．提高生產(chǎn)效率，帶動相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展1.可能產(chǎn)生新病毒或新過敏原2．可能產(chǎn)生抗除草劑的雜草3．可能使疾病的傳播跨越物種障礙4．可能會損害生物多樣性5．可能干擾生態(tài)系統(tǒng)的多樣性(2)看待轉(zhuǎn)基因生物的對的態(tài)度是趨利避害，不能因噎廢食。嚴(yán)禁生物武器基礎(chǔ)梳理1.種類：致病菌、病毒、生化毒劑，以及通過__________的致病菌。2.散布方式：吸入、誤食、接觸帶菌物品、被帶菌昆蟲叮咬等。3.特點：__________、多數(shù)具_(dá)_________、傳染途徑__________、污染面__________、__________、__________、__________等。4.__________生物武器公約及中國政府的態(tài)度。(103)嚴(yán)禁基因重組致病力強(qiáng)傳染性多廣有潛伏期不易被發(fā)現(xiàn)危害時間長歸納整合一、基因診療與基因治療1.基因診療(1)原理：DNA分子雜交。(2)過程：制備用放射性同位素（如32P）、熒光分子等標(biāo)記的DNA（患者DNA）分子作探針；將待測DNA制成單鏈；讓兩者進(jìn)行雜交，若兩者能進(jìn)行互補(bǔ)配對，則闡明患有此病，否則不患此病。2.基因治療---治療遺傳病的最有效手段。(1)原理：把正常的外源基因?qū)胗谢蛉秉c的細(xì)胞中，達(dá)成治療疾病的目的。病人細(xì)胞中現(xiàn)有缺點基因，也有正常基因。(2)辦法：體外基因治療和體內(nèi)基因治療。(3)體外基因治療：先從病人體內(nèi)獲得某種有關(guān)細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，然后在體外完畢基因轉(zhuǎn)移，再篩選成功轉(zhuǎn)移的細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)，最后重新輸入患者體內(nèi)，這種辦法叫做體外基因治療。例如：復(fù)合型免疫缺點癥。(4)體內(nèi)基因治療：直接向人體組織細(xì)胞中轉(zhuǎn)移基因的治療辦法叫做體內(nèi)基因治療。舉例：基因治療的過程（以鐮刀型細(xì)胞貧血癥的治療為例）舉例：基因治療的過程（以鐮刀型細(xì)胞貧血癥的治療為例）步驟過程獲取正常的血紅蛋白基因用限制性核酸內(nèi)切酶從人的DNA分子中切取血紅蛋白基因形成重組運(yùn)載體用同一種限制性核酸內(nèi)切酶在運(yùn)載體DNA上切開一個切口，用DNA連接酶將正常血紅蛋白基因連接在運(yùn)載體DNA上，形成重組運(yùn)載體重組運(yùn)載體的轉(zhuǎn)化與篩選將攜帶正常血紅蛋白基因的重組運(yùn)載體導(dǎo)入患者的造血干細(xì)胞中，并將重組運(yùn)載體插入到染色體。用選擇培養(yǎng)基篩選出含重組質(zhì)粒的造血干細(xì)胞將含正常血紅蛋白基因的造血干細(xì)胞回輸給患者骨髓將攜帶正常血紅蛋白基因的造血干細(xì)胞輸入患者骨髓中，此造血干細(xì)胞產(chǎn)生含正常血紅蛋白的紅細(xì)胞，以根治鐮刀型細(xì)胞貧血癥成果：健康的基因體現(xiàn)掩蓋了缺點基因的體現(xiàn)。闡明：對于遺傳病的治療，最根本的辦法是進(jìn)行基因替代或修復(fù)?；蛑委煹淖罴褧r期理論上是受精卵時期，這樣能夠使個體的每個細(xì)胞都含有正?；颍诂F(xiàn)實生活中是不可能的，由于不可能人人都在受精卵時期進(jìn)行基因檢查。另首先是對患者進(jìn)行有關(guān)細(xì)胞的基因替代，如對于遺傳性糖尿病患者，只對胰島B細(xì)胞進(jìn)行基因替代，該個體就能正常分泌胰島素，糖尿病得以治療。但這種局部細(xì)胞的基因替代，并沒有變化其它部位細(xì)胞的基因，如精原細(xì)胞等，因此，患者的后裔很可能還會患