一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.學(xué)習(xí)在實(shí)現(xiàn)DNA體外重組過(guò)程中，正確選擇合適的載體和限制性內(nèi)切酶并能對(duì)限制性

核酸內(nèi)切能對(duì)載體和目的DNA進(jìn)行切割，產(chǎn)生利于連接的合適末端。

2.學(xué)習(xí)設(shè)計(jì)構(gòu)建重組DNA分子的基本方法，掌握載體和外源目的DNA酶切的操作。

3.學(xué)習(xí)利用T4DNA連接酶把酶切后的載體片段和外源目的D”A片段連接起來(lái)，構(gòu)建體外DNA

分子的技術(shù)，了解并掌握幾種常用的連接方式。

4.掌握利用Cacl2感受態(tài)細(xì)胞的方法。

5.學(xué)習(xí)掌握熱擊法轉(zhuǎn)化E.coli的原理和方法。

6.掌握a互補(bǔ)篩選法和PCR檢測(cè)法篩選重組子的方法。并鑒定體外導(dǎo)入目的DNA片段的大

小。

二、實(shí)驗(yàn)原理

外源DNA與載體分子的連接即為DNA重組技術(shù)，這樣重新組合的DNA分子叫做重組子。重

組的DNA分子式在DNA連接酶的作用卜，有幅2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)限制

性內(nèi)切酶酶切的載體分子和外源DNA分子連接起來(lái)。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化后

的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可以通過(guò)a互補(bǔ)篩選法篩選出重組子，并可通過(guò)酶切電泳進(jìn)行

重組子的鑒定。

1.重組子的構(gòu)建

晦切時(shí)首先要了解目的基因的酶切圖譜，選用的限制性內(nèi)切酶不能目的基因內(nèi)部有專一的

識(shí)別位點(diǎn)，否則當(dāng)用一種或兩種限制性內(nèi)切酶切割外源工體DNA時(shí)不能得到完整的目的基因。

其次要選擇具有相應(yīng)的單一酶切位點(diǎn)質(zhì)?；蛘呤删w載體分子。常用的酶切方法有雙酶切法和

單酶切法兩種。本實(shí)驗(yàn)采用單酶切法，即只用一種限制性內(nèi)切酶切割目的DNA片段，酶切后的

片段兩端將產(chǎn)生相同的黏性末端或平末端，再選用同樣的限制性內(nèi)切酶處理載體。在構(gòu)建重組

子時(shí)，除了形成正常的重組子外，還可能出現(xiàn)目的DMA片段以相反方向插入載體分子中，或目

的DNA串聯(lián)后再插入載體分子中，甚至出現(xiàn)載體分子自連，重新環(huán)化的現(xiàn)象。單酶切法簡(jiǎn)單易

行單是后期篩選工作比較復(fù)雜。各種限制性內(nèi)切酶都有去最佳反應(yīng)條件，最主要的因素是反應(yīng)

溫度和緩沖液的組成，在雙酶切體系中，限制性內(nèi)切酶在使用時(shí)應(yīng)遵循“先低鹽后高鹽，先低

溫后高溫”的原則進(jìn)行反應(yīng)。

（要達(dá)到高效率的連接，必須酶切完全，酶切的DNA數(shù)量要適當(dāng)。另外，酶切反應(yīng)的規(guī)模

也取決于需要酶切的DNA的量，以及相應(yīng)的所需酶的量?？梢赃m當(dāng)增加前的用量，但是最高不

能超過(guò)反應(yīng)總體積的10%,因?yàn)橄拗菩院怂醿?nèi)切酹一般是保存在50%甘油的緩沖液中，如果陶

切反應(yīng)體系中甘油的含量超過(guò)5樂就會(huì)抑制酶的活性。）

連接反應(yīng)總是緊跟酶切反應(yīng)，外源DNA片段與載體分子連接的方法即DNA分子體外重組技

術(shù)主要依賴限制性核算內(nèi)切酶和DNA連接酶催化完成的。DNA連接酶催化兩雙鏈DNA片段相鄰

的5'-磷酸和3'-0H間形成磷酸二酯鍵。在分子克隆中最有用的DNA連接的是來(lái)自T4噬菌體

的T4DNA連接酶，它可以連接黏性末端和平末端。連接反應(yīng)時(shí)，載體DMA和外源DNA的摩爾

數(shù)之比控制在1:（「3）之間，可以有效地解決DNA多拷貝插入的現(xiàn)象。反應(yīng)溫度介于酶作用

速率和末端結(jié)合速率之間，一般是16C,用常用的連接時(shí)間為12T6L

2.感受態(tài)細(xì)胞的制備及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

構(gòu)建好的重組DNA轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的現(xiàn)象就是轉(zhuǎn)化。能進(jìn)行轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞必

須是感受態(tài)細(xì)胞，即受體細(xì)胞最容易接受外源DNA片段實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的生理狀態(tài)，它決定于受體菌

的遺傳特性，同時(shí)與菌齡、外界環(huán)境等因素有關(guān)。人工轉(zhuǎn)化是通過(guò)人為誘導(dǎo)的方法使細(xì)胞具有

攝取DNA的能力，或人為地將DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，該過(guò)程與細(xì)菌自身的遺傳控制無(wú)關(guān)，常用熱擊

法，電穿孔法等。能否實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒DMA的轉(zhuǎn)化還與受體細(xì)胞的遺傳特性有關(guān)，所用的受體細(xì)胞?

般是限制修飾系統(tǒng)的缺陷變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。

目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法有CaC12法，制備好的感受態(tài)細(xì)胞可以加入終濃度為15席

的無(wú)菌甘油，-70C可保存半年至一年。經(jīng)過(guò)CaC12處理的細(xì)胞細(xì)胞膜通透性增加，允許外源

DNA分子進(jìn)入。在低溫下，將攜帶有外源DNA片段的載體與感受態(tài)細(xì)胞混合，經(jīng)過(guò)熱擊或電穿

孔技術(shù)，使載體分子進(jìn)入細(xì)胞。進(jìn)入受體細(xì)胞的外源DNA分子通過(guò)復(fù)制、表達(dá)，使受體細(xì)胞出

現(xiàn)新的遺傳性狀。將這些轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，即可篩選出重組子。本實(shí)驗(yàn)以

E.coliDH5a菌株為受體細(xì)胞，用CaC12處理，使其處于感受態(tài)，然后將重組后的PUC19質(zhì)

粒在42c下熱擊90s,實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。

3.重組子的篩選鑒定

重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后，并非所有的受體細(xì)胞都能被導(dǎo)入重組DNA分子，一般僅有少數(shù)

重組DNA分子能進(jìn)入受體細(xì)胞，同時(shí)也只有極少數(shù)的受體細(xì)胞在吸納重組DNA分子之后能良好

增殖。并且它們是與其他大量未被轉(zhuǎn)化的受體菌細(xì)胞混雜在一起。再者，在這些被轉(zhuǎn)化的受體

細(xì)胞中，除部分含有我們所期待的重組DNA分子外，另外一些還可能是由于載體自身或一個(gè)載

體與多個(gè)外源DNA片段形成非期待重組DNA分了?導(dǎo)入所致。因此必須使用各種篩選及鑒定手段

區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子，并從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞群體中分理出帶有目的基因的重組子。本實(shí)驗(yàn)中采用

的方法是平板篩選法電泳篩選法及PCR檢測(cè)方法。

抗藥性篩選主要用于重組質(zhì)粒DNA分子的轉(zhuǎn)化子的篩選，而不含重組質(zhì)粒DNA分子的受體

菌則不能存活，?；パa(bǔ)篩選法是根據(jù)菌落顏色篩選含有充足質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。質(zhì)粒PUC19攜帶有

氨羊青霉素抗性基因(Ampr)，在含有氨茉青霉素平板上篩選轉(zhuǎn)化子。沒有導(dǎo)入質(zhì)粒PUC19的

受體細(xì)胞，在含有氨節(jié)青霉素的平板上不生長(zhǎng)。質(zhì)粒PUC19進(jìn)入E.coliDH5a后，通過(guò)a-

互補(bǔ)作用，形成完整的B-半乳糖甘酶。在麥康凱培養(yǎng)基平板上，轉(zhuǎn)化了利用B-半乳糖昔酶分

解培養(yǎng)基中的乳糖產(chǎn)生有機(jī)酸，pH降低，培養(yǎng)集中的指示劑變紅，轉(zhuǎn)化子的菌落變紅。不含質(zhì)

粒的E.coliDH5a,沒有半乳糖昔酶活性，不能利用培養(yǎng)集中的乳糖產(chǎn)生有機(jī)酸，而是利

用培養(yǎng)集中的有機(jī)碳源，不使培養(yǎng)基pH降低，在不含有氨葦青霉素的麥康凱培養(yǎng)基上形成白

色菌落。重組后的載體DNA因?yàn)槿盏幕虻牟迦胛稽c(diǎn)在FIC19乳糖利用基因內(nèi)部，不能形成a

-互補(bǔ)作用，所以也不能利用培養(yǎng)集中的乳糖產(chǎn)生有機(jī)酸，在含有氨羊青霉素的麥康凱培養(yǎng)基

上形成白色菌落。

挑選在氨茶青霉素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的白色菌落，通過(guò)擴(kuò)增培養(yǎng)。因?yàn)樵S多菌落存在假陽(yáng)性情

況，在氨節(jié)青霉素培養(yǎng)基上的白色菌落可能是導(dǎo)入的重組載體DNA菌落，也可能是載體自連后

發(fā)生突變的菌落，所以還要鑒定轉(zhuǎn)化子中重組質(zhì)粒DNA分子的大小，可將重組的載體DNA提取

出來(lái)，進(jìn)行后續(xù)的酶切、電泳檢驗(yàn)。

三、實(shí)驗(yàn)儀器和材料試劑

菌株：E.coli1)1i5a

培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基(加入AP)

儀器：高速離心機(jī)，恒溫震蕩培養(yǎng)箱，恒溫水浴鍋，微波爐，電泳儀，制膠槽，電泳槽，

梳子，錐形瓶，量筒，移液槍，冰盒，槍尖，Eppendorf管，微量移液器，計(jì)時(shí)器

試劑:TAE電泳緩沖液(10X),瓊脂糖，澳化乙錠(EB),XDNA/HindHIMarker,DL2000plus

DNAPUC19質(zhì)粒,酶切10Xbuffer,Hind川，重蒸水

四、實(shí)驗(yàn)步驟

1.載體與外源片段的酶切

pUC19(自提)ADNA(comm)pUC19(comm)

ddH2o13.5-12.566.037.5

10x/ubuffer2.010.05.0

DNA3.0-4.015.05.0

Hindlll1.59.02.5

Total20.010050.0

混合均勻，上下?lián)u晃400Q轉(zhuǎn)Imin

均分為兩管，R7°「水浴2hrs

lh后，取一管，戰(zhàn)瓊脂糖凝膠電泳，100v電壓40min

2.載體與外源片段的鏈接

CompVol(UI)

1ddH2O3.2

210xT4連接酶Buffer1.0

3pUcl9/lll1.5-2.0

4X/III3.5-3.0

5T4DNA連接酶0.8

Total10.0

混合均勻，上下?lián)u晃4000轉(zhuǎn)Imin

16℃保存

3.感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化

E.coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備

甘油管一LB平板（活化）-*單菌落-LB平板（37'Co/n）-20mlLB（37℃o/n）一氏轉(zhuǎn)接至新

鮮LB液--37℃2-2.5hrs—冰浴5mlx2,4000rpm/6000rpm5min-*Votex+800mlCaCL

吹吸懸浮細(xì)胞f4000rpm5irin吸棄上清100P10.IMCa012,輕懸,冰浴20min-感受態(tài)細(xì)胞

4.質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及重組質(zhì)粒的篩選

分組'步驟c.cDNA冰浴熱激冰浴復(fù)蘇培養(yǎng)涂布平板

基

ligation麥+AP50P1x1

l-test1005.05min42c5minLB100M1x2

-lOmin90s900150U1x2

ul/tube200Ulx2

ll-tranf50pUcl937℃lh麥+AP50P1x1

Control0.5

lll-c.c50麥+AP50P1x1

Control麥50P1x1

預(yù)留一個(gè)麥+AP平板

靜置lOmin,于37℃倒置培養(yǎng)16-20hrs

5.重組質(zhì)粒的提取及電泳檢測(cè)鑒定

I中的平板一白色單菌落（無(wú)菌牙簽）一接入預(yù)留麥+AP平板一4-6個(gè)菌落/組-37c倒置

o/n

五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

PUC19和XDNA經(jīng)HindIII單酶切作用結(jié)果的電泳檢測(cè)

入

入

入

Pp未

UU

DDDCC加

NN1R

NA91

A/9N

/HH245A6789

mI-H3酶

a-一

o)J一t

m-

w?

一

電泳結(jié)果表明：

XDNA分子量2萬(wàn)3bp

PUC19商業(yè)和測(cè)試酶切完仝，分子量在2300+,經(jīng)查的2686bp

廣9組提質(zhì)粒結(jié)果均出現(xiàn)兩條亮帶，上面的是酶切切開的質(zhì)粒，下面的為超螺旋結(jié)構(gòu)，最下方模

糊條帶為RNA少量殘留，表明RNA酶效果顯著，但仍沒完全除掉RNA,（通過(guò)對(duì)照組未加RNA酶

很明顯能看出）

兩條亮帶上方混雜帶可能是DNA染色體的殘留

在質(zhì)粒轉(zhuǎn)化與重組質(zhì)粒篩選的過(guò)程中，第一次加于麥康凱培養(yǎng)基的AP（氨節(jié)青霉素）效果失活,

導(dǎo)致II號(hào)平板即生K白曲又生K紅菌，篩選失敗。后老師又重新做了批加入新AP的實(shí)驗(yàn)證

明ap抗生素失活。

E.Z.N.A."PlasmidMiniprepKit試劑盒提