質(zhì)量中心-中創(chuàng)檢測部一、 微生物實驗要求二、 車間空凈涂抹基礎知識實驗室基本要求微生物質(zhì)量控制0102一、微生物實驗要求

微生物實驗要求五要素

人機料法環(huán)缺一不可！

微生物實驗要求五要素—人 基本要求堅持原則、實事求是、用數(shù)據(jù)說話、追根溯源、問題敏感能力達標無檢測障礙（色弱、色盲）；崗前培訓；獨立操作的能力；處理異常情況的能力——授權上崗無菌操作操作前將操作空間中的細菌和病毒等微生物殺滅；操作過程中保證操作空間與外界隔離，避免微生物的侵入。目標菌非目標菌殺死污染

微生物實驗要求五要素—人 實驗前加熱溶解培養(yǎng)基時佩戴防護面罩及防燙手套電爐旁40cm內(nèi)禁止放置酒精及酒精棉等易燃物質(zhì)紫外滅菌時禁止進入紫外區(qū)域，紫外滅菌后至少等待30min方可進入滅菌區(qū)域開展實驗工作實驗中（1）酒精燈體積應在1/4-2/3范圍內(nèi)火焰旁操作時鎖緊袖口，注意操作，防止意外點燃關閉酒精燈時，應重復蓋兩次，確保燈完全滅掉實驗后菌落計數(shù)時禁止脫掉手套及口罩。如果有霉菌被培養(yǎng)出，禁止在生物安全柜以外打開培養(yǎng)皿，待培養(yǎng)物高壓滅菌后再清洗培養(yǎng)基內(nèi)有菌落生長時，經(jīng)過高壓滅菌處理后再清洗，防止污染安全指南萬一灑出的酒精在燈外燃燒，不要慌張，可用濕抹布撲滅。

微生物實驗要求五要素—機 培養(yǎng)箱滿足檢測指標的溫度范圍，定期期間核查滅菌鍋定期檢定，滅菌效果的驗證（滅菌指示膠帶）電子秤/電子天平定期檢定，定期維護保養(yǎng)潔凈工作臺（生物安全柜）潔凈度百級，沉降菌符合要求（≦1CFU/皿）檢定校準三色標識對實驗結果有影響的儀器

機—滅菌鍋 滅菌前：1、鍋內(nèi)水加到水位線，確保水位（超過電加熱器30—40mm）2、對不同類型，不同滅菌要求的物品，勿放在一起滅菌3、集氣瓶內(nèi)的水位不宜過高，需浸沒排氣管壓力開始上升之前確保滅菌時： 排氣管的正常排氣！1、滅菌時，待滅菌物品置于不銹鋼滅菌籃中2、壓力蒸汽滅菌器運行期間不得強行開啟容器蓋和放氣閥滅菌后：1、壓力蒸汽滅菌器運行結束時，壓力表指示歸零，溫度至少在80℃以下，開啟容器蓋2、滅菌結束后，操作者佩戴防護面罩及防燙手套，從滅菌鍋內(nèi)取出滅菌物品

機—水浴鍋 放水閥關閉放水閥門，將水浴鍋內(nèi)注入純水至適當深度，淹沒加熱板（1/2-2/3），水浴鍋應安放在水平的臺面上不要將水濺到電器盒里，以免引起漏電，損壞電器部件水箱內(nèi)要保持清潔，定期刷洗，水要經(jīng)常更換。如長時間不用，應將水排盡，以免生銹4.使用完畢后關閉加熱器，切忌干燒?。P閉開關，拔掉插頭）

機—移液器 吸液：向下按到第一停點，再將吸頭垂直浸入液面2-3mm，緩慢平穩(wěn)松開按鈕，吸上液體放液：將吸液嘴貼到容器內(nèi)壁并保持20℃-40℃傾斜，平穩(wěn)地把按鈕壓到第一停點，繼續(xù)按壓到第二停點，排出殘余液體長時間不使用，需把移液槍的量程調(diào)至最大值的刻度，是彈簧處于松弛狀態(tài)以保護彈簧。當移液槍吸嘴內(nèi)有液體時，嚴禁將移液槍水平或倒置放置，以防液體流入活塞室腐蝕移液槍活塞。修正完畢的移液槍，需重新進行校準

微生物要求五要素—料 樣品成品原料外檢O

E

M采樣原則采樣過程

微生物要求五要素—料 樣品處理實驗室接到送檢樣品后應認真核對登記,

確保樣品的相關信息完整并符合檢驗要求實驗室應按要求盡快檢驗。若不能及時檢驗,

應采取必要的措施（

生鮮樣品冷藏保存）

,

防止樣品中原有微生物因客觀條件的干擾而發(fā)生變化各類食品樣品處理應按相關食品安全標準檢驗方法的規(guī)定執(zhí)行

微生物要求五要素—法 ——依據(jù)產(chǎn)品標準的項目單位

1.若單位為CFU/g，則選擇GB

4789.3-2016第二法（平板計數(shù)法）。如：GB

19300-2014食品安全國家標準堅果與籽類食品；2.若單位為MPN/g，則選擇GB

4789.3-2016第一法（MPN計數(shù)法）。如：NY/T

1885-2017

綠色食品

米酒；3.若單位為MPN/100g，則選擇GB/T

4789.3-2003。如：Q/KSJ0001S-2018

果蔬脆片。產(chǎn)品標準依據(jù)產(chǎn)品標準選擇檢測標準

微生物要求五要素—環(huán) 準備區(qū)無菌區(qū)培養(yǎng)區(qū)觀察區(qū)用于配制培養(yǎng)基和樣品前處理等，有試劑柜、存放器具或材料的專柜、實驗臺、電爐、上下水道、電源等無菌室一般為4-5平方米、高2.5米的獨立小房間（與外間隔離），專用于微生物實驗室內(nèi)配置各種培養(yǎng)箱，要求溫度較恒定；方便菌落的觀察；與其他功能區(qū)分隔開（污染區(qū)）需監(jiān)控環(huán)境溫濕度，每兩周做沉降菌，沉降菌實驗符合國標（

GB/T

27405-2008）要求

拓展

四級埃博拉病毒、馬爾堡病毒、拉沙病毒二級三級一級不會引起疾病的微生物引起疾病，不構成嚴重危害，傳播風險有限，具備有效治療和預防措施的微生物引起嚴重疾病的，容易傳播的微生物。引起非常嚴重疾病的，以及我國尚未發(fā)現(xiàn)或者已經(jīng)宣布消滅的微生物。冠狀病毒、鼠疫桿菌、結核分枝桿菌、狂犬病毒實驗室生物安全防護水平分級根據(jù)對所操作生物因子采取的防護措施，將實驗室生物安全防護水平分為一級、二級、三級和四級。中國大陸B(tài)SL-4實驗室： 湖北武漢BSL-4病毒實驗室（中國科學院武漢國家生物安全實驗室

）國家動物疫病防控高級別生物安全實驗室（中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所）實驗室基本要求微生物質(zhì)量控制0102

微生物質(zhì)量控制

培養(yǎng)基的質(zhì)量控制內(nèi)部質(zhì)量控制外部質(zhì)量控制

外部質(zhì)量控制

參加能 參加實力驗證 驗室間比對

內(nèi)部質(zhì)量控制

空白對照方法：稀釋液空白（取1mL稀釋液放進平皿）；培養(yǎng)基空白（空白平皿）目的：檢驗培養(yǎng)基是否滅菌徹底、無菌操作是否過關等，排除其他干擾因素人員比對方法：同設備儀器、室內(nèi)環(huán)境下，由兩個或多個人員先后（或同步）操作后取得的結果目的：內(nèi)部比對評價檢測能力，提高檢測水平，保障檢測結果的準確性平行實驗方法：同一批樣品，以完全一致的條件（溫度、濕度、儀器、試劑，以及試驗人）進行試驗，看其結果的一致性目的：防止偶然誤差的產(chǎn)生

培養(yǎng)基的質(zhì)量控制

保存在陰涼干燥處，避免陽光直射；開瓶在瓶身標注開啟日期；開瓶后注意防潮（專門的柜子；除濕機）；在有效期或6個月內(nèi)用完。貯存購買值得信賴的品牌，如海博、環(huán)凱、國藥等購置制備加貼標識，標日期現(xiàn)配現(xiàn)用（

VRBA煮沸滅菌，

孟加拉紅見光易分解）滅菌以后培養(yǎng)基應該迅速冷卻至所需溫度，避免長時間保存在滅菌鍋內(nèi)，造成過度滅菌，影響培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分或選擇性效果；

培養(yǎng)基的質(zhì)量控制—培養(yǎng)基驗收

培養(yǎng)基的質(zhì)量控制—培養(yǎng)基驗收 相關概念環(huán)境的監(jiān)控設備工器具與手的監(jiān)控整改措施相關文件、記錄二、車間空凈涂抹基礎知識目的監(jiān)控生產(chǎn)過程中微生物，以達到規(guī)定標準，保障生產(chǎn)產(chǎn)品的質(zhì)量。01020304范圍適用于生產(chǎn)車間空氣、操作人員手部、與食品有直接接觸面的檢測。職責車間人員負責計劃開展、采樣及送檢。檢測室負責檢測及結果反饋。生產(chǎn)相關人員根據(jù)（不合格）結果進行整改。原則監(jiān)控頻率：原則上涂抹須覆蓋每條生產(chǎn)線；空凈個數(shù)依據(jù)車間面積大小而定。檢測頻率為每周1次或根據(jù)實際情況增加頻次。相關概念設備工器具與手的監(jiān)控0103整改措施相關文件、記錄0405環(huán)境的監(jiān)控02相關概念環(huán)境的監(jiān)控B采樣時間：正常生產(chǎn)狀態(tài)下隨機采樣C采樣方法：面積≤30m2時，對角線上取里、中、外3點，兩端距墻1

m處各取1點；>30m2時，取東、西、南、北、中5點，周圍4點距墻1

m各取1點

。A物資準備：按要求配置平板計數(shù)瓊脂（PCA），滅菌后倒好平板備用。環(huán)境的監(jiān)控操作要點：打開皿蓋置采樣點(與地面垂直高80-150cm)，注意避開空調(diào)、門窗等空氣流通處，空氣中暴露15分鐘，蓋上皿蓋送檢菌落總數(shù)的檢測：36±1℃培養(yǎng)48±2h結果計算：空氣中菌落總數(shù)（CFU/皿）=所有培養(yǎng)皿菌落數(shù)總和/培養(yǎng)皿個數(shù)（數(shù)值<1時，結果取1；數(shù)值>1時，按四舍五入計算取整）檢測限值：空氣中菌落總數(shù)應≤30

CFU/皿環(huán)境的監(jiān)控0102整改措施相關文件、記錄0405設備工器具與手的監(jiān)控03相關概念

設備工器具與手的監(jiān)控

涂抹稀釋液的制備：將25cm2(5×5cm)面積的試紙1張置于裝有25mL生理鹽水的螺口玻璃瓶內(nèi)，滅菌后備用，此液為1:1稀釋液采樣方案：

設備工器具與手的監(jiān)控

涂抹位置采樣時間采樣方法送檢設備工器具①鏟子、設備、稱等，正常生產(chǎn)狀態(tài)下隨機采樣②毛巾、原料桶、工服等，消毒后消毒處理的鑷子→取出25cm2無菌規(guī)格紙，貼在待測部位→取下放回玻璃瓶內(nèi)。采樣后必須盡快進行檢測，送檢時間不得超過6h。手部員工操作過程中消毒處理的鑷子→取出25cm2無菌規(guī)格紙，于手指曲面來回涂擦整只手（被檢人五指并攏）→取下放回玻璃瓶內(nèi)。結果處理：涂抹位置檢測指標單位結果計算限值設備工器具菌落總數(shù)CFU/cm2平皿上菌落的平均數(shù)×樣液稀釋倍數(shù)1≤20CFU/cm2大腸菌群CFU/cm2平皿上菌落數(shù)×（陽性管數(shù)/證實管數(shù)）×樣液稀釋倍數(shù)1<1

CFU/cm2手部菌落總數(shù)CFU/只手平皿上菌落的平均數(shù)×樣液稀釋倍數(shù)1×樣液體積（25）≤300

CFU/只手大腸菌群CFU/只手平皿上菌落數(shù)×（陽性管數(shù)/證實管數(shù)）×樣液稀釋倍數(shù)1×樣液體積（25）<1

CFU/只手

設備工器具與手的監(jiān)控

（結果按四舍五入計算取整）環(huán)境的監(jiān)控0102設備工器具與手的監(jiān)控相關文件、記錄0305整改措施04相關概念設備工器具設備工器具的定期清每2小時更換（消毒）操作器具環(huán)境加大車間衛(wèi)生清潔力度洗消毒，且清潔到位，

與頻次，清除衛(wèi)生死角，并注意防蟲防鼠，適當?shù)耐L保持干燥結果根據(jù)場人排查

整改措施

加管半查處理檢測結果進行車間現(xiàn)、機、料、環(huán)等因素改善。原料 人員強原料端的監(jiān)

注意個人衛(wèi)生，個人監(jiān)控（原材料、

防護，規(guī)范操作，人成品的進廠檢

員清潔消毒措施到位和工序檢驗）車間的消毒廠區(qū)、生產(chǎn)車間周圍等定期用75%酒精擦拭、84消毒液浸泡、紫外線殺菌等空氣用紫外線或臭氧滅菌環(huán)境小件設備器具：用80-100ppm二氧化氯或有效氯溶液浸泡20-30min。大件設備器具：用150-200ppm二氧化氯或有效氯溶液擦拭。設備洗手池：進車間用50-80ppm的二氧化氯溶液或有效氯溶液洗手，時間1min，然后清洗。

直接接觸物料的工作人員：操作期間每隔0.5-1小時，手部清洗擦干后用75%的乙醇消毒1次。人員手部環(huán)境的監(jiān)控0102設備工器具與手的監(jiān)控整改措施0304相關文件、記錄05相關概念

相關文件

《GB/T

27405-2008

實驗室質(zhì)量控制規(guī)范

食品微生物檢測》《SB/T10514