一、前言 繼50年代的免疫熒光（IFA）和60年代的放射免疫(RIA)分析技術(shù)之后，在 70年代初期又建立了用酶來標(biāo)記抗原或抗體的分技術(shù)被稱為酶聯(lián)免疫吸附試驗 （Enzym—LinkedImmunosorbent 年代初期由WEEMSCHUARS.ENGVAELISA法是免疫診斷中的一項新技術(shù)，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病、 ,因此，也適合于是一種早期診斷的良好方法。因 ELISA法在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的應(yīng)用范圍日益擴大，可概括四ELISA熱線電話：021－6485 網(wǎng)址： 應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的， 由于ELISA ELISA有以下兩個方面。一1、競爭法（Competitionmethod）:方法的基本原理可見圖 抗原，再經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色 這兩組底物降解量之差，即為我們所要測定的未知抗原的量1熱線電話：021－6485 網(wǎng)址： 方法的基本原理可用 2來表2. 再經(jīng)孵育洗滌后，加底物顯色進行測定， 5000的半抗原 及HbS的測定。理可用圖33. a包被于固相載體，經(jīng)洗滌加入含有欲測抗原之待檢樣品。經(jīng)孵育 b于第一次包被于固相載體上的特異性抗體a對被測抗原來說都是特異性的，但不是用同種動物免疫制備的，否則可出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。經(jīng)孵育洗滌后，再加酶標(biāo)記 b抗體，再經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色進行測定。這種方法與熱線電話：021－6485 網(wǎng)址： 用于測定抗原的尚有 4種叫做抑制性測定 4， 然4.(二)測定抗體方面：所用的方法稱為間接法，也是目前最常用的方法，其原理可用 5來熱線電話：021－6485 網(wǎng)址： 5. IgG、IgM)，再經(jīng)孵育洗滌后，加底物顯色 ,底物降解的量，即為欲測抗標(biāo)記抗人IgM,則可用于早期診斷。三、ELISA這是ELISA檢測中的重要部分，可 9個方面加以說明烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應(yīng)板及塑料管。 標(biāo)準(zhǔn)是對每批購置的微量反應(yīng)板或塑料管抽樣， 純化的正常人IgG進行包被，經(jīng)中測定其消光值、光密度（O.D O.D值的誤差不超過10為合格。 O.D值相差太大，或者反應(yīng)板的這一邊與另一邊凹孔的 O.D值相差大，均不 O.D值是否有明顯差別。一般要求有 10倍左右的差熱線電話：021－6485 網(wǎng)址： ELISA中，包被于固相載體表面的抗原或抗體的來源和制備方法對試驗結(jié)果并非均適合用于ELISA法。因此，對某一疾病的診斷，必須通過實踐，才能選出適用的優(yōu)質(zhì)抗原。 （LP (如SDS)所提取的抗原等，在作ELISA時，必須要有1-2種試劑、 O.D值，選擇O.D值≥1.0 O.D值稍大于1.0，而不選擇小于 1.0的抗原濃度。陰性參考血清O.D值要求<0.1-0.2。也就是要求陽性參考血清和陰性參考血清的 O.D值有明顯差別 對時間、溫度、PH均有關(guān)系。溫度高（如37℃、45℃、或56℃）， 下（如0.1mol/L、PH9.6 碳酸鹽緩沖液稀釋抗原）4℃包被過夜較為合適。但在某些試驗中，如用LPS或毒素蛋白包被時，用PH7.2-7.4 稀釋才是滿意的。包被特異蛋白質(zhì)的濃度 1-10ug/ml，而對某些病原微生物原以5- 較為合適，但均應(yīng)通過滴定 ELISA的試驗樣品（標(biāo)本）。但應(yīng)注意 和少量IgG喪失活性。關(guān)于人血清在保存過程中抗體的穩(wěn)定性報導(dǎo)尚不多。但一般認(rèn)為作 熱線電話：021－6485 網(wǎng)址： -20）或稱濕潤劑的緩沖液來稀釋。也可加入一些蛋白質(zhì)，如牛血清白蛋白等來稀釋。然后再加到已經(jīng)用抗原或抗體包被的固相載體中的診斷來說，最好先用一系列稀釋度作一批標(biāo)本測定，求出對診斷有意義的一個稀釋度（劑量反應(yīng)曲線） 以1：200稀釋度測定比較適當(dāng)，而試驗標(biāo)本的(即含抗體)作用時間一般為室溫或 37℃1-2小時。但現(xiàn)在對有些標(biāo)本（如流腦抗原）測定時，僅用37℃5分鐘。對單克隆抗體檢測也可縮短作用時間。（四）結(jié)合物：在ELISA中，用酶標(biāo)記的抗體或抗原統(tǒng)稱為結(jié)合物，此為進行 ELISA法的主要問題是能夠簡便地制備酶結(jié)合物，而此種制備好的酶結(jié)合物底物分子發(fā)生反應(yīng)的酶）。3、酶制劑易得、價廉符合上述條件的酶有：堿性磷酸酶，一般用分子量為 Phospatase,簡稱辣根過氧化物酶（HorseRadishPeroxidase, 4×10）,另外尚有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖甙酶，糖化酶及乙酰膽堿酯酶等等。其中以前兩種（ 和HR）最為常用。AP活力高，制備好的酶結(jié)合物可加 Na3防腐，但此種酶不易獲得，因其是從小牛腸粘膜中 HR。HRP活性也高，價格較便宜。但制得酶結(jié)合物不能 Na3 緩沖甘油等量混合后少量分裝，保存冰箱，一般可 1-2年由于HRP最為常用，故先把 (HRP的性質(zhì)):HRP系從辣根菜的根中所提取，這種酶是無色酶蛋白與暗棕色的鐵卟 啉（E鐵血素）相結(jié)合的一種醣蛋白，可簡寫 Fe- 個）同 熱線電話：021－6485 網(wǎng)址： 40000，等電點為PH7.2。能被58-62%飽和硫酸銨沉淀，在 PH3.5-12均較穩(wěn)定。63℃15分鐘，室溫數(shù)周、甲苯和其他苯類有機溶劑處理都不影響它的活性。 280nm和403nm有二個最大吸收峰，其兩者的比值即O.D403nm/O.D280nm稱為RZ值（系由德文Reinnoit-Zah）而來，表示酶的純度。高純度酶制品 值可達(dá)3.4。而RZ值0.6的酶其中非酶蛋白含量高達(dá) 75。不適合作ELISA用，經(jīng)純化后才能應(yīng) HRPRZ值達(dá)2.5-3.0，亦可作 ELISA用。 IgG 5033 DEAE-維素柱析后所制成的IgG亦可標(biāo)記。如將IgG再通過葡聚糖凝膠 G-200膠濾（用PH7.2PBS洗脫）所得純化IgG用HRP標(biāo)記則更佳。但損失較大，也有人用親和層析法提純抗體來標(biāo)記的。但在用酶來 玻片雙相瓊脂擴散法），中央孔加1mg/ml抗原，周圍孔加不同稀釋度粗制或提純抗體（馬或羊抗IgG， 24小時，沉淀反應(yīng)效價達(dá) 1：16以上者即可應(yīng)用。而蛋白質(zhì)含量可 紫外線分光光度計測定，也可 酚法測定 （1）不影響酶及抗體活性，（2）不產(chǎn)生干擾物質(zhì)，（3）抗體和酶結(jié)合后應(yīng)有較高的產(chǎn)量，（4）不出現(xiàn)非特異性反應(yīng),(5)結(jié)合程序簡便，（6）來源易、價廉。 2個邊接起來而形成的酶結(jié)合物。例如酶（Fe-E- 2C2O）N2 +OHC-(CH 2)3-CHO+H2N-Ig-->Fe-E-N=C-(CH 2)3-C=N-Ig+2H2OC2OH 低聚醣基 戊二 免疫球蛋 酶結(jié)合 熱線電話：021－6485 網(wǎng)址： 量戊二醛（可通過葡聚糖凝 G-25過柱或用透析法除去），然后，再加入抗體球蛋白，使之與戊二醛復(fù)合物反應(yīng)，形成酶結(jié)合物。而酶結(jié)合物的多余醛基可用加入小分子的氨基酸如賴氨酸 比一步法高10其方法是將gHR溶于l含戊二醛的H8LPBS 中，置室溫8時，充分透析或經(jīng)葡聚糖凝膠 5層析除去多余戊二醛，加生理鹽水至，然后加入g純化的抗體球蛋白及l(fā)H6 的1L 碳酸鹽緩沖液，混合后于 ℃冰箱放置 4小時，加入l2L 的賴氨酸溶液，室溫置 2小時，用H2、5LPBS 充分透析，藉離心除去沉淀，上清即為酶結(jié)合物。必要時可作進一步純化后使用。2、過碘酸鈉氧化法：本法是目前酶標(biāo)記抗體較好的方法， 7090采用本法首先是用氟代二硝基苯（Fluorodinitrobengene2.4 —硝基苯，F(xiàn)DN）封閉 交聯(lián)。然后用過碘酸鈉來氧 — +HCHO----> — C2OH C2OH —E —E +H N=Fe—E 2N-Ig--->Fe —E +H 熱線電話：021－6485 網(wǎng)址： 其標(biāo)記步驟是：10mgHRP溶于新鮮配制的0.3mol/LPH8.1 碳酸氫鈉2ml中，加0.2ml1%氟代二硝基苯無水乙醇溶液，室溫中攪拌1小時以封閉HRP表面的游離氨基。再加2ml0.08mol/LNaIO4水溶液，于室溫中輕攪 30分鐘，用0.16mol/L乙二醇溶液終止氧化反應(yīng)。1 析袋中置0.01mol/LPH9.5 取6ml醛化酶加20mg抗體球蛋白（用2ml碳酸鹽緩沖液溶解），混勻，室溫攪拌2-3小時后加10mg硼氫酸鈉鹽，4℃冰箱4小時或過夜。次日取出加等量飽和硫酸銨沉淀酶結(jié)合物 (去游離酶)，并用50飽和硫酸銨洗滌 1-2次。再溶于3mlPH7.4PBS 60甘油PB，分裝保存，冰箱備用。法是取10mgHRP加1ml0.1 mol/L醋酸鈉或水溶解，充分混勻，約 5分鐘后加0.08mol/L 水溶液1.0ml混合后，置冰箱內(nèi) 20分鐘，加0.4mol/L 乙二醇溶液0.5ml終止氧化反應(yīng)，30 鐘后加21%NaCL溶液0.3ml，再加1.2ml冰冷的無水乙醇（AR）沉淀醛化酶，離心去上清，沉淀酶再用6ml80冰冷的乙醇溶液浸泡洗滌一次后，離心傾去乙醇（盡量去除乙醇） ，沉淀用PH9.6的0.05mol/L 2ml溶解，然后加入2ml羊或馬抗人IgG（內(nèi)含蛋白量20mg左右）， 10mgNaB4混勻，3小時后加等量飽和硫酸銨沉淀酶結(jié)合 50 0.01mol/LPBS3ml溶解，置透析袋中用冰冷的生理鹽水透析除鹽（需換液 5次），如有沉淀藉離心除去，上清呈 60甘油PB，分裝保存?zhèn)溆谩?A403/A280—0.4— 為宜 280nm403nmO.D（1）mg/ml=O.D403nm×0.4,其中0.4為酶O.D403nm=1.0時相當(dāng)于0.4mg酶。mg/ml=（O.D280nm-O.D403nm×0.42）×0.94×0.62其中 為酶蛋白結(jié)合戊二醛后 280nm應(yīng)有的O.D，抗體球蛋白0.62為蛋白與酶--戊二醛結(jié)合后O.D280nm值約應(yīng)以加6，故以0.94校正之。換算系數(shù)，故最后要乘于 (2）用過碘酸納氧化法的計算：mg/mlO.D403nm×0.3為酶蛋白本身在280nm應(yīng)有的O.D值。熱線電話：021－6485 網(wǎng)址：mg/ml（酶） 球蛋白 克分子比=--------- ÷---------------=-------------- （球蛋白一般要求制備好的酶結(jié)合物二者克分子比 0.8-1.2，但不能超 2或稍高 正常 O.D值，選擇O.D值≥1.0 1：12000稀釋。酶結(jié)合物稀釋 O.D 增加本底顏色,產(chǎn)生假陽性反應(yīng),這是限制 ELISA特異性的一個因素.因此不少學(xué)者在稀釋劑及洗（BS）和吐溫—20 BSA為0.5～1；吐溫—20 為0.05%（有 0.05%吐溫-20 或0.02mol/LPB（PH7.）加0.05%吐溫-20 都是良好的）。在一般的洗滌劑和稀釋劑中還加有 NaN3防腐，但是用HRP制備酶結(jié)合物時則不能加3因Na3能抑制HRP的活性，需要注意BSA加入洗滌劑或稀釋劑中雖可改善 的結(jié)果觀察，但由于BSA比較昂貴，又不易得到，故也不是非加不可的。有人在洗滌劑中加入 白明膠，免血清，有利于加強封阻作用。最近有人報告用 PH7.40.02mol/LTris-Hcl 中加入0.05%吐溫-20 但不需加0.2‰的KCl在稀釋劑和洗滌劑中所加的吐 很重要。它不僅能消除非特異性的本底反應(yīng)，而且還增加陽性標(biāo)本的敏感度，這可能與吐溫- 能分離所吸附的非特異性物質(zhì)有關(guān)。目前采用的洗劑為PH7.4 PB（含0.2‰KC）加0.05%吐溫-20，如無吐溫-20，也可用吐溫故-40 代替。但吐溫-80 本底較高，不宜應(yīng)用。（0.5mol/LNaCL）和兔血清加入稀釋劑中，可提高（六） HR， 熱線電話：021－6485 網(wǎng)址： （2）所顯色澤易干洗脫；（3）顯 因此，對AP酶結(jié)合物來講，一般均用硝基苯磷酸鹽 顯色后呈桔黃色，色澤穩(wěn)定，用2 403nm測定O.D值。AP催化底物產(chǎn)生顏色的反應(yīng)如下 AR—O--P—OH+H2 R—OH+H3POO 對硝基酚脂肪 對硝基AP是一種磷酸酯酶,它能催化磷酸酯水介釋放出無機磷酸而顯色。 lene-diamine，簡稱，穩(wěn)定、敏感，其降解產(chǎn)物呈桔紅色，可溶。用 2mol/LH 2S4或檸檬酸終止反應(yīng)，可在492nm波長的酶標(biāo)比色計上測定 O.D值，也可目測。HRP在催化反應(yīng)中可使 NH +H2O2------- 、P、DO.P.D用鄰聯(lián)甲苯胺（Ortho-Toli dine，簡稱O，顯色以后呈蘭色，可用波長 630nm測O.D值，不需 熱線電話：021－6485 網(wǎng)址： 405nm測定O.D值。1、用O.P.D作底物：先配 PH5.0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液。 0.1mol/L 克/升 24.3ml，加0.2mol/L（27.4 克/升）Na2HP4溶液25.7ml，再加蒸餾水 將40mgO.P.D溶解其中，再加30%H2O20.10ml 2、用OT作底物，先配PH3.7的醋酸鹽緩沖液，取 0.2M醋酸（12ml/升）和醋酸鈉（16.4克/升）溶液等量混和，然后稱取OT21.2mg先溶于1ml二甲基乙酰胺中，再將OT溶液傾入100mlPH3.7的醋酸鹽緩沖液中，并加入 30%220.05ml （七）任意確定一個時間 如20分鐘或30分鐘終止反應(yīng)，測定被檢標(biāo)本和陽性參考標(biāo)本 校正后O.D=被檢標(biāo)本的O.D值×陽性標(biāo)本的O.D制備好一批酶結(jié)合物后預(yù)試時間，在反應(yīng)溫度固定時，當(dāng)陽性參考血 O.D值達(dá)到 30分鐘，以后用本批酶結(jié)合物測定待檢樣品時都采用同一時間國外在使用自動測定儀時，加底物后隨時測定，每塊試驗板上陽性參考血清 O.D值，當(dāng)1.0時，立即將全板上被試標(biāo)本終止反應(yīng)進行測定，這樣所得結(jié)果比較一致。我國也有自動ELISA由于ELISA叫實驗研究，在酶結(jié)合物已經(jīng)確定的情況下，一般要求預(yù)測以 5個條件熱線電話：021－6485 網(wǎng)址：（八）結(jié)果判斷:ELISA 計作精確測定。當(dāng)然,后者更為正確。而肉眼觀察更為簡便，而且也有一定正確性。據(jù)Adler（1980） 報告,目測為±1、2、3、4相當(dāng)于分光光度計測 ≤0.04 0.08～0.250.26～0.5 ～1.0 > (九)試驗的重復(fù)性（精確度），有二種方法來檢驗試驗的精確度：通常用變異系數(shù)來表示：1、幾個樣品用ELISA法同時進行多次測定求出 CV；2多次測定求出變異系數(shù)。CV是個體參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差與平均數(shù)的比率。S/ ＝CV，CV10，不應(yīng)大于10～15 1：200一個1+”：所有超過規(guī)定的O.D值（如O.D，0.4）的標(biāo)本均屬陽性，此規(guī)定O.D值是根據(jù)事先測定大量陰性標(biāo)本所取得的，此規(guī)定值是陰性標(biāo)本的上限?；蛘咭砸唤M陰性標(biāo)本O.D平均值加2～3個標(biāo)準(zhǔn)差作為陽性閾值。2、直接以O(shè).D值來表示，如 0.4、0.7、1.2，O.D值越大，陽性反應(yīng)越強，但此數(shù)值是在固 O.D值與一組陰性標(biāo)本 O.D值的比值，例如為陰性標(biāo)本的2倍或3倍，即為陽性，比值小于 2.1而大于1.5為可疑，<1.5 測定標(biāo)本O.D值空白O.D—————————————陰性對照O.D值空白O.D值如在此測定時以空白校正“O”

熱線電話：021－6485 網(wǎng)址：用不同稀釋度作ELISA檢測后，以O(shè).D值為縱坐標(biāo)，單位數(shù)為橫坐標(biāo)，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。以后可根據(jù)被檢標(biāo)本的 出被檢標(biāo)本的單位數(shù)。O.D值>2.0

上面已經(jīng)把ELISA中各步驟的影響因素作了說明， ELISA的操作程序列于表1供參考：1：ELISA操作步驟

間接法（測抗體至最適濃度（5～

（測抗原

競爭法（測抗原 抑制性測定20μ ）各 板每 個凹孔中,4℃過夜或37℃水浴2～3小時,貯存冰箱

最適濃度（1～10μg/ml，每凹孔加0.3ml，4℃過夜，或37℃水浴3

沖液（ 溫-20）洗3每次5

同 同 同熱線電話：021－6485 網(wǎng)址：孔加入用含有 0.2ml，37℃，作用1～2小時

每凹孔加入0.2ml37℃作用

2組,a組加酶標(biāo)原混合液0.2ml，記抗原液0.2ml，37℃作用1～2成不同稀釋度）。

a組加參考抗體和0.2ml，另一組加稀釋劑 0.2ml， 1～2小洗滌：重復(fù) 同 洗滌：同 洗0.2ml37℃作用1～2小時 間接法（測抗體

加入0.2ml用稀釋1～2小時或由預(yù)（測抗原

各加入0.2ml抗參物37℃作用1～2競爭法（測抗原 抑制性測定洗滌：重復(fù) 同 洗加入0.2ml底物溶液于每