ICSDB51四川省地方標(biāo)準(zhǔn)DB51/XXXXX—2013雜交水稻品種純度SSR分子檢測方法四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB51/XXXXX—2013目次前言................................................................................II12范圍..............................................................................1規(guī)范性引用文件....................................................................13術(shù)語和定義........................................................................14原理..............................................................................25主要的儀器設(shè)備....................................................................26試驗(yàn)方法..........................................................................27引物篩選..........................................................................28檢測步驟..........................................................................29純度結(jié)果計(jì)算......................................................................3附錄A（規(guī)范性附錄）主要試劑配制....................................................4附錄B（規(guī)范性附錄）常用SSR引物....................................................5IDB51/XXXXX—2013前言本標(biāo)準(zhǔn)附錄A為規(guī)范性附錄，附錄B為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省農(nóng)業(yè)廳提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局批準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)負(fù)責(zé)起草單位：四川省種子站。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：毛雙林、周會、呂季娟、譚功燮、高宏、韓本達(dá)、秦潔。IIDB51/XXXXX—2013雜交水稻品種純度SSR分子檢測方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了雜交水稻品種純度的SSR分子檢測方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于水稻雜交種的純度鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB／T3543.4農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程發(fā)芽試驗(yàn)NY/T1433水稻品種鑒定DNA指紋方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。品種純度varietalpurity品種個(gè)體與個(gè)體之間在DNA分子標(biāo)記帶型方面典型一致的程度，用本品種的種子數(shù)占供檢驗(yàn)本作物在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程。是一項(xiàng)DNA體外合成放大技術(shù)，能快速特異地在體外擴(kuò)增目的DNA。具有游離的3’-OH末端及特定序列的寡核苷酸短片段，與DNA模板結(jié)合，在DNA聚合酶作用下啟動(dòng)PCR反應(yīng)，延伸合成模板DNA的互補(bǔ)鏈。1DB51/XXXXX—20133.5核心引物coreprimer多態(tài)性、穩(wěn)定性、重復(fù)性等綜合特性好，適用于雜交水稻品種純度鑒定優(yōu)先選用的引物。4原理簡單重復(fù)序列（SSR）分布于水稻整個(gè)基因組，品種間因其重復(fù)次數(shù)不同而存在多態(tài)性，每個(gè)品種均具備特異的分子標(biāo)記圖譜。據(jù)此，根據(jù)每個(gè)簡單重復(fù)序列兩端的高度保守序列設(shè)計(jì)特異引物，利用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，從而檢測特定SSR位點(diǎn)的多態(tài)性，以鑒別水稻品種的純度。5主要的儀器設(shè)備PCR擴(kuò)增儀；電泳儀；電泳槽；膠片觀測臺；96孔深孔板；96孔PCR板；電磁爐。67試驗(yàn)方法參照NY/T1433。引物篩選篩選引物時(shí)，取待測雜交種種子10粒及雙親種子各5粒發(fā)芽，快速提取DNA,利用核心引物進(jìn)行擴(kuò)增，從中確定該品種純度檢測最適宜的1～3對引物。雜株為待測雜交種的雙親時(shí)，1對引物即可滿足檢測要求；雜株為其他類型時(shí)，將引物對數(shù)增加至3對以上。適用于雜交水稻品種純度鑒定的常用SSR引物名稱、染色體位置及序列參見附錄B。選擇時(shí)，優(yōu)先從表B.1的核心引物中進(jìn)行篩選。發(fā)芽從待測雜交水稻樣品中隨機(jī)數(shù)取不少于400粒種子，按GB/T3543.4規(guī)定進(jìn)行發(fā)芽，從發(fā)芽的幼苗中待幼苗長至3cm～5cm左右（種子置床后4～5天），剪取0.5cm長的水稻幼苗莖稈中部，用鑷子放入96孔深孔板中，每孔加入40ulDNA提取液I，沸水煮45秒，取出，每孔加入60ulDNA提取液II,沸水煮2分鐘，取1ul用作模板。每個(gè)待測樣品提取2～4個(gè)96孔板的單株DNA。純度低于97.0%的樣品將待測單株數(shù)增加至300株以上。2DB51/XXXXX—2013從常用引物中篩選1～3對最適宜該品種的引物，所選引物的SSR電泳譜帶須含雙親互補(bǔ)譜帶，且PCR重演性好、電泳易于分離、譜帶清晰、亮度高。8.4PCR擴(kuò)增用篩選出的1～3對引物分別擴(kuò)增待測樣品DNA，PCR擴(kuò)增體系為：模板1ul，2×TagPCRMix5ul，10umol/L正、反向引物各0.5ul，加入滅菌蒸餾水補(bǔ)足10ul。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，循環(huán)35次；72℃延伸8分鐘；10℃恒溫冷卻。8.5非變性聚丙烯酰胺電泳按照NY/T1433進(jìn)行點(diǎn)樣、電泳、染色、讀帶。9純度結(jié)果計(jì)算鑒定電泳譜帶的特征和一致性，計(jì)數(shù)待測樣品幼苗株數(shù)和非本品種幼苗株數(shù)，并按下列公式計(jì)算品種純度（X），以百分率表示：A－BX（%）=——————×100...............................(1)A式（1）中：A——待測樣品幼苗株數(shù)；B——非本品種幼苗株數(shù)。測定結(jié)果的有效位數(shù)保留一位有效數(shù)字。3DB51/XXXXX—2013AA附錄A（規(guī)范性附錄）主要試劑配制A.12.5mol/LHCl:加25ml濃HCl到91ml蒸餾水中，于室溫保存。A.21mol/LTris-HCl（pH8.0）：取三羥甲基氨基甲烷(Tris)60.55g溶于適量蒸餾水中，用鹽酸(HCl)調(diào)pH至8.0，加水定容至500mL，高壓滅菌。A.3DNA提取液I:取NaOH1g，先用80mL蒸餾水溶解后，再加水定容至100mL。A.4DNA提取液II:取8ml2.5mol/L的HCl,20ml1mol/LTris-HCl（pH8.0），500ulIGEPAL-CA630，加滅菌蒸餾水定容至120ml。A.5引物：用超純水溶解引物至終濃度為10μmol/L。A.6凝膠與電泳試劑配制：按照NY/T1433進(jìn)行配制。A.7銀染試劑配制：按照NY/T1433進(jìn)行配制。4DB51/XXXXX—2013BB附錄B（規(guī)范性附錄）常用SSR引物表B.1雜交水稻品種純度分子檢測核心SSR引物位置序號標(biāo)記染色體正向引物序列反向引物序列（cM）32093949876053736341095202176026848153176474021871337676271078875859747442178084412432080615301935135946975469523825125288143454254982565181014695212RM297RM7112tctttggaggcgagctgagctagaggcgaaaacgagatgccaaagatgaaacctggattgaccatggttcaagagtgaaacctcgcttatgagagcttcgctttgtctatctcaagacaccttacagagaaacggcatcgccggcgataaaacaatgagcgtcggatgatgtaaagccttggtagtataggtactaaacatatatgagttgctgtcgtgcgcaaaaacagagcagatgacatggaccacaaacgaccttctctgcaagccttgtctgatgccggtatccttcgatattgcgaagccgtcgtgaagttacctgcagacatagagaaggaagtgtccttcaagagtgcaaaaccttccctctcatgagctccatgtaggaaaggaagggcagaggtagtgagcctaacaataatctgctgtatgtagctcgcaccatcgatcgatcttcacgaggtgccctgttattttcttctctccgaagggtacatctgcttaggggtgggcgaggtaataatggcacaaggtgagcagtccacagctcaacctgttgagtgcttctccatcactcccatggttgcagatgttcttcctgatggctggtttgtttcaggttcggcatcggtcctaactaagggcatatcggcattcgcctg3RM8534RM5414RM274RM190RM336RM724556677889RM219RM311RM209RM19923456789193200201801426827201740269548145DB51/XXXXX—2013表B.2雜交水稻品種純度分子檢測備選SSR引物位置序號標(biāo)記染色體正向引物序列反向引物序列（cM）1RM423RM7389RM567RM421RM176RM432RM477RM316RM184RM332RM7102RM488RM1385RM231RM119RM413RM225RM180RM152OSR28RM590RM212338368663615526434533716239763413026543918958599280751601075107163588952840361132113622480750826640596245325621242569221273634165965735274682962agcacccatgccttatgttgagcgacggatgcatgatcatcagggaaatcctgaagggagctcaggtgaaacatccaccggctcccgctacgacgtctccttctgtctcacgctggattgtctcgcggtatagtttgtgcctagttgggcatacgatggcatcccattcgccaaaaccggccgcgaaggcgaaggtgaagtaggagtgtttagagtgccacagctagggttttgaggctgatgacaggtaaggtgtggtgccagattatttcctgaggtccatccccctgctgctgctgctgggcgattcttggatgaagagtgcccatatggtctggatgctacatcggcttaggtgtagcaacacggaaaccaccacacctcaccgagcagctatagcttagctggcatctccgctctccatgccctttttcagtagccctcccttgagccggaggtagtcttgggaaggagcaatcaccactgatccagaatccattgaccccagcgatgcgctggaagaggtgcagctgcgtacgtgatgaatgaccactaccagcagcctctgacgcttatatgttacgtcaactgacacttggagagcggtgtggcatgagtgatctcactcaccctcggtttgcttatacatcag234455667788991011121101112131415161718192021222324252627282930tagcaacaaccagcgtatgctgaacatcatcttcgaatcccacttgcatagttctgcattgcgccggatgtgtgggactagcgtccccaccaatcttgtcttc23456gaaagtggatcaggaaggcacttgctctacttgtggtgagggactgccgtagaccttcttgaagtagactgcacatgagcagagacaggagttggggtcttgttcg7892345676DB51/XXXXX—2013位置序號標(biāo)記染色體正向引物序列反向引物序列（cM）3132333435363738394041RM331RM566RM333RM3133R