植物抗寒基因工程研究----謝嶺學(xué)號:序言:植物抗寒基因工程研究進展溫度是影響植物分布、產(chǎn)量及品質(zhì)關(guān)鍵環(huán)境原因,提升植物抗寒性對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)含相關(guān)鍵意義.多年來,伴隨基因工程發(fā)展,對植物抗寒機理進行了深入研究,并克隆了很多與抗寒相關(guān)基因.本文從膜穩(wěn)定性、抗氧化酶活性、抗凍蛋白、低溫信號轉(zhuǎn)錄因子和滲透調(diào)整物質(zhì)等方面對植物耐冷性基因工程研究進展進行了分析、歸納與總結(jié),意在為植物抗寒機理研究及植物抗寒育種提供參考.摘要:溫度是影響植物分布、產(chǎn)量及品質(zhì)關(guān)鍵環(huán)境原因,提升植物抗寒性對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)含相關(guān)鍵意義.多年來,伴隨基因工程發(fā)展,對植物抗寒機理進行了深入研究,并克隆了很多與抗寒相關(guān)基因.本文從膜穩(wěn)定性、抗氧化酶活性、抗凍蛋白、低溫信號轉(zhuǎn)錄因子和滲透調(diào)整物質(zhì)等方面對植物耐冷性基因工程研究進展進行了分析、歸納與總結(jié),意在為植物抗寒機理研究及植物抗寒育種提供參考.

關(guān)鍵詞:植物抗寒性,基因工程,抗寒育種

植物生長發(fā)育過程中,溫度作為一個關(guān)鍵環(huán)境因子對其生長、生殖和分布起著關(guān)鍵作用.低溫不僅在很大程度上限制植物種植范圍,同時還會造成減產(chǎn)和品質(zhì)下降,嚴(yán)重時甚至絕收.全球每年因低溫傷害造成農(nóng)作物損失高達數(shù)千億元,所以,植物抗寒性研究及抗寒育種一直是植物學(xué)研究領(lǐng)域熱點之一.

現(xiàn)在選育耐低溫植物品種關(guān)鍵采取常規(guī)雜交育種方法,即利用抗冷性品種與多種生態(tài)類型不抗冷品種雜交,經(jīng)過混合輪回選擇,取得抗冷品種.經(jīng)過長久研究,育種工作者已育成了不少抗寒新品種,對避免和降低冷害損失起到了關(guān)鍵作用.不過利用常規(guī)育種方法存在抗冷性資源不足、選擇周期長、費用高等不足,嚴(yán)重影響育種目標(biāo)實現(xiàn),極難滿足生產(chǎn)上對抗寒品種迫切需要.

現(xiàn)代生物技術(shù)迅猛發(fā)展為最終處理植物抗寒性展現(xiàn)了良好前景.利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù),大家已從植物中克隆出色多參與植株耐低溫能力形成基因,研究和分析這些基因功效,對于揭示植物抗寒分子基礎(chǔ),加速植物抗寒育種含相關(guān)鍵意義.本文就多年來中國外在植物抗寒基因工程方面研究進展進行了分析與歸納,意在為大家深入認識和利用植物抗寒相關(guān)基因提供參考.

1膜穩(wěn)定性相關(guān)基因

生物膜是植物細胞及細胞器與周圍環(huán)境間一個界面結(jié)構(gòu),它能夠接收和傳輸環(huán)境信息,對環(huán)境脅迫做出反應(yīng).同時,生物膜對保持植物正常生命活動也含相關(guān)鍵作用[2].研究表明,生物膜是低溫冷害作用首要部位,而且低溫傷害原初反應(yīng)發(fā)生在生物膜系統(tǒng)類脂分子相變上[3].早在20世紀(jì)70年代,Lyons[4]就提出“膜相變寒害"假說,認為植物正常生理活動需要液晶相膜狀態(tài),在遭受低溫傷害時生物膜首先發(fā)生膜脂物相改變,這時膜脂從液晶相變?yōu)槟z相,膜脂上脂肪酸鏈由無序排列變?yōu)橛行蚺帕?膜結(jié)合酶活力降低,且膜上出現(xiàn)孔道或龜裂,使膜通透性增大,膜內(nèi)可溶性物質(zhì)大量向膜外滲透,破壞了細胞內(nèi)外離子平衡.同時膜結(jié)合酶結(jié)構(gòu)改變,酶促反應(yīng)速度失去平衡,造成植物細胞生理代謝改變和功效紊亂,從而使植物細胞受到傷害.很多研究表明,膜脂中類脂和脂肪酸成份不飽和度顯著影響膜脂相變溫度.通常認為,膜脂不飽和脂肪酸含量增高,膜脂相變溫度會降低,增加了膜流動性,從而使植物抗寒性對應(yīng)提升.反之,冷敏感植物膜脂相變可能是因為膜脂脂肪酸不飽和程度較低,低溫下膜脂由液晶相向凝膠相轉(zhuǎn)變,造成細胞膜膜相分離,從而引發(fā)細胞代謝紊亂[527].多年來,應(yīng)用基因工程技術(shù)導(dǎo)入脂肪酸去飽和代謝關(guān)鍵酶基因,經(jīng)過降低脂肪酸飽和度以提升植物抗寒性研究,已經(jīng)取得了突破性進展[8,9].

日本國立基礎(chǔ)生物化學(xué)研究所首先利用脂肪酸去飽和酶基因進行了植物抗寒性分子改良.1993年,High等[10]篩選了一個膜脂不飽和脂肪酸突變藍藻(SynechocystisPCC6803)菌株fad12,并克隆了Δ12去飽和酶基因desA,研究表明desA基因表示是因為低溫首先降低了膜脂流動性,刺激desA轉(zhuǎn)錄,使膜脂不飽和度增加,從而增加膜脂流動性.Los等[11]發(fā)覺,藍細菌在低溫脅迫過程中,desA基因表示水平在1h內(nèi)就增加10倍,抗寒性得到提升.Kodama等[12]將從擬南芥中克隆葉綠體ω23脂肪酸去飽和酶基因(FAD7)導(dǎo)入煙草中進行表示,轉(zhuǎn)基因煙草中十六碳三烯酸和十八碳三烯酸含量提升,其前體物質(zhì)對應(yīng)降低,在l℃低溫下表現(xiàn)出顯著抗寒性.Ariizumi等[13]將FAD7基因?qū)胨局?取得轉(zhuǎn)基因植株不僅增強了抗寒性,而且也提升了低溫下光合速率和生長速率.除了FAD7基因外,Gibson等[14]從擬南芥中分離得到另一個受低溫誘導(dǎo)脂肪酸去飽和酶基因FAD8,編碼合成葉綠體ω23去飽和酶,它與FAD7基因含有75%核苷酸同源組成,二者葉綠體ω23去飽和酶能夠相互功效互補,共同催化膜脂中脂肪酸去飽和.另外,John等[15]又從藍細菌和高等植物中克隆了分別編碼Δ6、Δ9以及ω23酰基酯去飽和酶基因desD、desC和desB,這些基因均含有冷調(diào)整特征.Ovkova等[16]將從藍細菌中克隆Δ9去飽和酶基因des9轉(zhuǎn)入煙草后,轉(zhuǎn)基因煙草葉片中不飽和脂肪酸含量和植株低溫耐受性都有很大提升.Kwon等[17]克隆了辣椒(Capsicum)葉綠體ω23脂肪酸去飽和酶基因,而且在辣椒基因組中存在一個小基因家族,該基因在葉片中表示而在根中不表示,當(dāng)葉片受到傷害時轉(zhuǎn)錄量快速提升,而且隨即亞麻酸含量提升.

脂酰甘油(PG)含有較多飽和脂肪酸,是決定膜脂相變關(guān)鍵原因.而甘油232磷酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAT)又是PG生物合成過程中第一個?；セ?對決定植物膜PG不飽和度起關(guān)鍵作用[18].現(xiàn)在已取得多個植物GPAT基因cDNA或基因組DNA片段.1992年Murata等[19]將冷敏植物南瓜GPAT酶基因轉(zhuǎn)至煙草,植株膜脂脂肪酸飽和度增加,相反轉(zhuǎn)移抗冷植物擬南芥?；D(zhuǎn)移酶基因,能夠使煙草內(nèi)囊體PG脂肪酸組成趨向不飽和,煙草植株抗寒性大大提升.Wolter等[20]將GPAT基因?qū)霟煵莺蛿M南芥,結(jié)果改變了其體內(nèi)磷脂?；视椭舅峤M成,提升了其不飽和度,增強了抗寒性.Ariizumi等[13]將擬南芥和菠菜AGPAT和SGPAT基因分別轉(zhuǎn)化水稻,T1代植株葉片內(nèi)磷脂酰甘油順式不飽和脂肪酸含量均顯著高于野生型;同時轉(zhuǎn)基因植株鮮重也顯著高于對照.Yokio等[21]將擬南芥GPAT基因?qū)胨局?結(jié)果提升了葉片葉綠體膜上PG不飽和脂肪酸含量,從而增強了水稻抗寒性.由以上敘述可見,利用生物技術(shù)方法改變植物體內(nèi)脂肪酸代謝路徑,增加不飽和脂肪酸含量,可提升植物抗寒性.

2抗氧化酶活性基因

大量研究表明,植物在低溫脅迫過程中,對O2利用能力降低,多出O2則在代謝過程中被轉(zhuǎn)化成對植物有毒害作用活性氧(ROS),打破體內(nèi)活性氧平衡,從而引發(fā)或加劇膜脂過氧化作用,降低膜脂不飽和度,并可引發(fā)膜蛋白聚合及變性,造成膜脂流動性降低,膜通透性增強,生物膜受損[22].一定范圍低溫脅迫下,植物能夠動員其本身抗氧化防御系統(tǒng)清除自由基,調(diào)整膜透性及增加膜結(jié)構(gòu)和功效穩(wěn)定性,降低細胞傷害.不過這種本身保護含有一定程度,超出某一范圍即會成為不可逆?zhèn)?最終致使整株死亡.植物抗氧化防御系統(tǒng)由包含超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)和谷胱甘肽還原酶(GR)等組成[23,24].低溫脅迫下這些物質(zhì)協(xié)同作用以去除植物體內(nèi)活性氧自由基,其中尤以SOD最為關(guān)鍵,它是植物體內(nèi)第一個清除活性氧關(guān)鍵抗氧化酶[25].

多年來,利用基因工程技術(shù)經(jīng)過轉(zhuǎn)入抗氧化酶基因來提升植物抗寒性已成為研究熱點.McKersie等[26]將煙草中克隆Mn2SODcDNA置于35S開啟子下轉(zhuǎn)化到苜蓿線粒體和葉綠體等細胞器中,提升和增強了轉(zhuǎn)基因植株中超氧化物歧化酶含量和活性,并經(jīng)大田試驗發(fā)覺大大提升了轉(zhuǎn)基因植株越冬存活率,同時還增強了對除草劑二苯乙醚抗性,除草劑對植株生長抑制顯著減輕.低溫造成煙草株高、葉片數(shù)和生物量顯著下降[27].Gupta等[28]將豌豆Cu/Zn2SOD基因?qū)霟煵葜?發(fā)覺轉(zhuǎn)基因植株葉綠體中SOD基因超量表示,同時也提升了APX活性,從而增加了煙草抵御低溫引發(fā)光抑制能力,提升了轉(zhuǎn)基因植株對凍害耐受力.Allen等[29]將SOD基因轉(zhuǎn)入煙草中,增強了煙草抗氧化能力;將其轉(zhuǎn)入棉花,也增強了轉(zhuǎn)基因棉花植株對低溫逆境抗性.Samis等[30]將Mn2SOD基因?qū)胱匣ㄜ俎?不僅提升了轉(zhuǎn)基因植物膜穩(wěn)定性,同時還增加了植物生物量.另外,APX和谷氨酰胺合成酶與植物抗寒性也相關(guān)系.Sato等[31]報道,熱激處理水稻幼苗后可誘導(dǎo)APXa基因表示,使APX活性升高,從而提升水稻幼苗抗寒性.Liorente等[32]從水稻基因組中克隆了與POD活性相關(guān)冷誘導(dǎo)基因RCI3,該基因不僅對低溫有很高耐受性,而且對水分和鹽脅迫也有很好耐受性.說明利用基因工程手段將抗氧化酶基因轉(zhuǎn)入植物中,清除植物在低溫脅迫過程中產(chǎn)生對植物有毒害作用活性氧物質(zhì),能夠提升植物抗寒性.

3抗凍蛋白基因

抗凍蛋白(antifreezeprotein,AFP)是一類含有熱滯效應(yīng)和冰晶生長抑制效應(yīng)蛋白質(zhì),能以非線性形式降低水溶液冰點,但對熔點影響甚微,從而造成水溶液熔點和冰點之間出現(xiàn)差值,它們在受低溫環(huán)境脅迫時能使有機體抵御冰凍環(huán)境[33].抗凍蛋白最早是在極地海魚中發(fā)覺,在魚類和昆蟲類中研究比較深入,現(xiàn)在已經(jīng)有將這類基因轉(zhuǎn)入植物報道.黃永芬等[34]采取花粉管通道法及子房注射法將美洲擬鰈afp基因?qū)敕?田間抗寒性試驗表明,在春季平均氣溫低于正常年份4.4℃條件下,轉(zhuǎn)基因植株生長優(yōu)于對照,致死溫度也比對照降低了2℃.對植物AFP研究較晚,1992年,加拿大Griffith等[35]首次報道從經(jīng)過低溫鍛煉可忍受細胞外結(jié)冰冬黑麥中發(fā)覺了植物內(nèi)源性AFP,標(biāo)志著植物抗凍蛋白研究開始,隨即已從多個植物中取得含有熱滯效應(yīng)AFP[36].1997年Wallis等[37]將植物凝集素基因和AFP基因共同構(gòu)建到植物轉(zhuǎn)化載體pKY2LX35S中,以后在轉(zhuǎn)化馬鈴薯中發(fā)覺,在-2℃條件下,非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯葉片電滲值比轉(zhuǎn)基因馬鈴薯葉片高2倍多,而且非轉(zhuǎn)基因植株遭受到了嚴(yán)重凍害.Worrall等[33]從冷誘導(dǎo)胡蘿卜中純化出一個分子量為36kDAFP,并克隆了它基因,以后將AFP基因?qū)霟煵?所取得轉(zhuǎn)基因煙草提取物能抑制冰晶生長,而且轉(zhuǎn)基因植株抗凍性顯著高于對照.1999年,Meyer等[38]采取CaMV35S開啟子,用農(nóng)桿菌介導(dǎo)胡蘿卜AFP基因重組子轉(zhuǎn)化擬南芥,轉(zhuǎn)基因植物提取液有顯著抗凍活性,能夠修飾冰晶形態(tài),表明抗凍活性與AFP基因轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān).,尹明安等[39]克隆了胡蘿卜AFP基因,并構(gòu)建了其植物表示載體,為深入利用其轉(zhuǎn)化番茄、甜椒等作物奠定了試驗基礎(chǔ).Huang等[40]將樹狀抗凍基因DAFP21轉(zhuǎn)入擬南芥,轉(zhuǎn)基因植株抗凍性和對照植株相比提升了0.6～3.3℃.王艷等[41]將準(zhǔn)噶爾小胸鱉甲抗凍蛋白基因MPAFP149轉(zhuǎn)入煙草中,-1℃處理48h,發(fā)覺轉(zhuǎn)基因煙草相對電導(dǎo)率和表型顯著優(yōu)于野生型煙草.室溫恢復(fù)試驗驗證表明,轉(zhuǎn)基因煙草可存活并恢復(fù)生長,而野生型煙草受到了不可逆低溫凍害.

抗凍蛋白發(fā)覺為植物抗寒性研究提供了一條新路徑,這類蛋白質(zhì)含有高度親水性和熱穩(wěn)定性,能夠保護植物細胞免受低溫傷害.不過現(xiàn)在從植物中分離克隆并能夠用于轉(zhuǎn)化植物抗凍蛋白基因并不多,所以以后相關(guān)植物抗凍蛋白基因分離克隆將是植物抗寒基因工程研究一個熱點.

4展望

伴隨對植物抗寒分子機理深入研究,分子生物學(xué)及生物化學(xué)技術(shù)不停發(fā)展,為低溫相關(guān)基因克隆及其應(yīng)用研究奠定了堅實基礎(chǔ),利用基因工程使植物取得抗寒性成為植物抗寒育種最有效路徑之一.但因為植物抗寒基因工程是一個新興研究領(lǐng)域,研究基礎(chǔ)比較微弱,還有很多問題有待深入研究:(1)抗寒基因工程大多是圍繞單個基因研究,但植物抗寒性是由多基因控制性狀,僅靠轉(zhuǎn)移1個基因就取得抗寒植物比較困難,轉(zhuǎn)化單基因植株抗寒性提升程度相當(dāng)有限,所以必需轉(zhuǎn)移多個基因,但現(xiàn)在同時轉(zhuǎn)化多個基因技術(shù)還不成熟.(2)可利用目基因不多.植物抗寒性受一個龐大調(diào)控網(wǎng)絡(luò)控制,包含大量基因,而現(xiàn)在分離關(guān)鍵是部分保護類基因,且多來自擬南芥等模式植物.要想植物抗寒育種取得更大突破,必需從不一樣植物分離更多基因,深入研究植物抗寒分子機理.(3)轉(zhuǎn)基因表示系統(tǒng)不完善.現(xiàn)在