抗生素類(lèi)藥物的質(zhì)量分析方法（一）

氨基糖苷類(lèi)抗生素概況抗生素是指在低濃度下即能殺滅或抑制其他病原微生物的藥物，按其結(jié)構(gòu)可以分為β-內(nèi)酰胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)及其他抗生素。氨基糖苷類(lèi)抗生素是由氨基環(huán)醇與氨基糖縮合而成的一類(lèi)多羥基抗生素，是臨床上常用的一類(lèi)廣譜抗生素。可通過(guò)微生物發(fā)酵或半合成而制得。目前藥典收載的品種主要有：鏈霉素、卡那霉素、阿米卡星、妥布霉素、奈替米星、依替米星、慶大霉素、新霉素等結(jié)構(gòu)——慶大霉素結(jié)構(gòu)——鏈霉素一、藥典方法

中國(guó)藥典(2000年版)，美國(guó)藥典(25版)、英國(guó)藥典(2000年版)對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素的含量測(cè)定大多采用微生物法，有關(guān)物質(zhì)的檢查大多采用薄層色譜法或反相高效液相色譜法。微生物法作為一種經(jīng)典的方法，仍被各國(guó)藥典所采用。本法系利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散作用，采用量反應(yīng)平行線(xiàn)原理設(shè)計(jì)，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品兩者對(duì)接種的試驗(yàn)菌產(chǎn)生抑菌圈的大小，以測(cè)定供試品效價(jià)。微生物法所需設(shè)備簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，但影響因素復(fù)雜，操作費(fèi)時(shí)。以下介紹本組同學(xué)查閱的其他方法：一、色譜分析法氣相色譜法(GC)

高效液相色譜法(HPLC)

離子交換色譜法（IEC）薄層色譜法(TLC)

高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)氣相色譜法(GC)

氨基糖苷類(lèi)抗生素為非揮發(fā)性化合物，且在紫外可見(jiàn)光區(qū)無(wú)吸收，須先進(jìn)行衍生化，使其適于分析。HoebusL等用六甲基二硅烷柱前衍生測(cè)定大觀霉素，用填充柱氣相色譜法，氫火焰離子化檢測(cè)器檢測(cè)，在75％一125％的濃度范圍內(nèi)，呈良好的線(xiàn)性，雜質(zhì)的定量限為0.1％。PreuL等選擇適當(dāng)?shù)难苌噭捎妹?xì)管氣相色譜。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)分析氨基糖苷類(lèi)抗生素也是應(yīng)用比較廣泛的一種聯(lián)用技術(shù)。

高效液相色譜法(HPLC)

HPLC測(cè)定此類(lèi)藥物含量大多采用反相色譜或離子對(duì)色譜系統(tǒng)，根據(jù)檢測(cè)手段的不同可分為紫外檢測(cè)、熒光檢測(cè)、電化學(xué)檢測(cè)及質(zhì)譜檢測(cè)等。柱前衍生反相HPLC是此類(lèi)藥物最為常用的一種測(cè)定方法。中國(guó)藥典采用鄰苯二甲醛(0PA)柱前衍生化，紫外檢測(cè)硫酸慶大霉素C組份。同時(shí)，有報(bào)道用柱后衍生，熒光檢測(cè)食品中的鏈霉素殘留量。為了避免使用衍生化試劑，可以采用靈敏度較高的電化學(xué)檢測(cè)器及采用LC-MS聯(lián)用技術(shù)。LC-MS將HPLC的高分離效能和質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度及豐富的結(jié)構(gòu)信息相結(jié)合，已成為重要的分離分析方法之一。離子交換色譜法（IEC）采用高效陰離子交換色譜分離硫酸慶大霉素、硫酸新霉素和硫酸奈替米星及其雜質(zhì)，然后采用積分脈沖安培檢測(cè)進(jìn)行直接測(cè)定，不需衍生，簡(jiǎn)便快速。缺點(diǎn)：檢測(cè)器的靈敏度對(duì)藥物中的微量雜質(zhì)仍顯不足，體系對(duì)有些組分的分離不盡理想，重現(xiàn)性較差來(lái)源：儀器分析網(wǎng)HPLC—蒸發(fā)光散射檢測(cè)法(HPLC—ELSD)

近年來(lái)出現(xiàn)的蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)由于其響應(yīng)值不依賴(lài)被測(cè)物質(zhì)的光學(xué)性質(zhì)，任何揮發(fā)性低于流動(dòng)相的樣品均能被檢測(cè)，并且物理性質(zhì)相似的物質(zhì)其響應(yīng)因子基本一致，靈敏度是示差折光檢測(cè)器的2-10倍，現(xiàn)已逐漸成為目前常用的通用型檢測(cè)器。在用HPLC-ELSD法測(cè)定硫酸小諾霉素(C2b)注射液時(shí)發(fā)現(xiàn)有些樣品含有慶大霉素C1a雜質(zhì)；在分析慶大霉素C組分時(shí)發(fā)現(xiàn)有的樣品在C2與C2a峰之間有小諾霉素(C2b)雜質(zhì)峰。由此看出，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的應(yīng)用已為全面分析無(wú)紫外吸收的氨基糖苷類(lèi)抗生素的質(zhì)量提供了一種新的手段。但本法也有一些不足之處，例如靈敏度比紫外檢測(cè)的低(2—3個(gè)數(shù)量級(jí))．?dāng)?shù)據(jù)處理相對(duì)繁瑣。薄層色譜法(TLC)

TLC作為一種定性的方法鑒別氨基糖苷類(lèi)抗生素已被各國(guó)藥典廣泛采用。掃描密度計(jì)與TLC技術(shù)相結(jié)合產(chǎn)生的高效薄層色譜法(HPTLC)因其靈敏度、分離度和準(zhǔn)確度都有很大提高，已用于藥物定量分析。TLC具有使用范圍廣，樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單，優(yōu)化展開(kāi)劑的組成方便等優(yōu)點(diǎn)，隨著吸附劑高效化，定量分析儀器化、自動(dòng)化，TLC仍然是不可替代的一種分析方法。高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)

HPCE是一類(lèi)以毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的新型液相色譜分離技術(shù)。根據(jù)分離模式的不同，又可分為毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)、毛細(xì)管等電聚焦(CIEF)、毛細(xì)管凝膠電泳(CEC)，膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜(MEKC)等。氨基糖苷類(lèi)抗生素的HPCE檢測(cè)方法，最為常用的是柱前及柱內(nèi)衍生的CZE技術(shù)，然后進(jìn)行紫外檢測(cè)。二、免疫法(IA)

IA是近年發(fā)展起來(lái)的一種用于體內(nèi)藥物監(jiān)測(cè)的分析方法，將分析方法與免疫原理相結(jié)合，進(jìn)行超微量分析，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、用樣少等優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)對(duì)抗原標(biāo)記方法不同，IA可分為放射免疫法(RIA)，酶免疫法(EIA)，熒光免疫法(FIA)，化學(xué)發(fā)光免疫法(CLIA)，毛細(xì)管電泳免疫分析法（CEIA)和濁度免疫分析法。三、流動(dòng)注射法(FIA)

流動(dòng)注射法(FIA)是一種自動(dòng)分析法，適用于醫(yī)院制劑的快速檢驗(yàn)及中間體質(zhì)量控制。用恒流量泵使硫酸鐵銨試劑和載液(水)流過(guò)內(nèi)徑為0.5lmm的四氟乙烯泵管，與進(jìn)樣口注量的一定濃度硫酸鏈霉素水溶液在反應(yīng)圈中混合，反應(yīng)呈包，于520nm處用721分光光計(jì)測(cè)A，通過(guò)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換器，在記錄儀上獲得相應(yīng)的峰高。硫酸鏈霉素呈色原理：硫酸鏈霉素在NaOH中水解成麥芽酚，與Fe3+呈色，在520nm處有最大吸收峰。四、絡(luò)合物光度法

絡(luò)合物光度法利用金屬離子或有機(jī)試劑與氨基糖苷類(lèi)抗生素形成有色絡(luò)合物，如依文思藍(lán)、曲利本紅、曲利本藍(lán)、滂胺天藍(lán)等。應(yīng)用的方法有顯色法、褪色法和雙波長(zhǎng)疊加法對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定。如依文思藍(lán)所例；

硫酸新霉素、卡那霉素、慶大霉素和妥布霉素4種氨基糖苷類(lèi)抗生素均為飽和烴的取代衍生物，分子結(jié)構(gòu)中只含σ鍵和非鍵電子(n)，而σ一σ*，n一σ*

躍遷需要的能量較高，其吸收光譜帶位于遠(yuǎn)紫外區(qū)。在200~800nm波長(zhǎng)范圍幾乎無(wú)吸收。依文思藍(lán)(EB)系酸性雙偶氮染料，它具有大的共軛體系，在紫外—可見(jiàn)光區(qū)產(chǎn)生強(qiáng)烈吸收，其最大吸收波長(zhǎng)為609nm。當(dāng)上述4種氨基糖昔類(lèi)抗生素與EB染料反應(yīng)形成絡(luò)合物后，其最大吸收波峰視其抗生素不同而分別紅移幾或幾十納米，吸光度有不同程度的增大，但在染料最大吸收波長(zhǎng)附近，即產(chǎn)生褪色反應(yīng)

苯胺藍(lán)

在酸性條件下，苯胺藍(lán)的多個(gè)磺酸基上的質(zhì)子離解而以陰離子狀態(tài)存在，此時(shí)卡那霉素則以陽(yáng)離子形式存在，兩者共存時(shí)，由于靜電引力和電荷轉(zhuǎn)移作用形成復(fù)合物使水溶苯胺藍(lán)溶液褪色。五、脈沖極譜法

原理鏈毒素由鏈霉胍、鏈霉糖和N—甲基—L—葡萄糖胺三部分以糖苷鍵彼此相連構(gòu)。鏈霉胍結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)—C＝NH，在滴汞電極上可以發(fā)生氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生陰極波。實(shí)驗(yàn)選用滴汞電極為工作電極，滴汞間隔為15秒鐘，Ag-AgCl電極為參比電極，內(nèi)裝1.0mol/L的KCl參比溶液。選用微鉑電極為輔助電極，以穩(wěn)定電極電壓。藥物濃度在200~700u/ml時(shí)，藥物濃度與導(dǎo)數(shù)峰電流呈線(xiàn)性關(guān)系，且線(xiàn)性關(guān)系極為顯著。六、吸附伏安法

B-R+(CH3)2CHCH0體系中，該類(lèi)抗生素的吸附伏安行為認(rèn)為其電極反應(yīng)過(guò)程為化學(xué)反應(yīng)(Schiff堿反應(yīng))——吸附富集(在-1.35v左右)——不可逆還原過(guò)程，測(cè)得參加反應(yīng)的電子數(shù)為2，氫離子數(shù)為1，并導(dǎo)出了反應(yīng)方程式。對(duì)不同醛作衍生化劑的情況作比較發(fā)現(xiàn)，在陰極掃描過(guò)程中，以異丁醛衍生化劑所得的還原峰，比相應(yīng)的甲醛、乙醛衍生物的還原峰靈敏度高，峰形對(duì)稱(chēng)，重現(xiàn)性好。傅曉航張黎明異丁醛存在下氨基糖苷類(lèi)抗生素吸附伏安法研究浙江樹(shù)人大學(xué)學(xué)報(bào)第3卷第2期2003年3月其他方法

旋光法---旋光法快速測(cè)定硫酸卡那霉素注射液的含量黃而娟等旋光法快速測(cè)定硫酸卡那雷素注射液的含量吉林畜牧獸醫(yī)2004年第4期在氨基糖苷類(lèi)抗生素的定性檢測(cè)方面，核磁共振波譜(NMR)作為一種新型的技術(shù)已被用于此類(lèi)物質(zhì)的構(gòu)型研究。在該類(lèi)抗生素的體內(nèi)藥物監(jiān)測(cè)方面，自動(dòng)的免疫試劑盒仍然是首選的方法。色譜技術(shù)和毛細(xì)管電泳技術(shù)以其專(zhuān)一性強(qiáng)、分辨率高，操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，將逐步取代微生物法等準(zhǔn)確度低、精密度差的方法。隨著MS技術(shù)在定量方面的進(jìn)一步完善，和LC、GC聯(lián)用，將成為此類(lèi)藥物分析中一種必不可少的檢測(cè)手段，最具有前景的將是CE-MS聯(lián)用技術(shù)。That’sall

Thankyou9、春去春又回，新桃換舊符。在那桃花盛開(kāi)的地方，在這醉人芬芳的季節(jié)，愿你生活像春天一樣陽(yáng)光，心情像桃花一樣美麗，日子像桃子一樣甜蜜。2月-252月-25Sunday,February23,202510、人的志向通常和他們的能力成正比例。21:11:4221:11:4221:112/23/20259:11:42PM11、夫?qū)W須志也，才須學(xué)也，非學(xué)無(wú)以廣才，非志無(wú)以成學(xué)。2月-2521:11:4221:11Feb-2523-Feb-2512、越是無(wú)能的人，越喜歡挑剔別人的錯(cuò)兒。21:11:4221:11:4221:11Sunday,February23,202513、志不立，天下無(wú)可成之事。2月-252月-2521:11:4221:11:42February23,202514、ThankyouverymuchfortakingmewithyouonthatsplendidoutingtoLondon.ItwasthefirsttimethatIhadseentheToweroranyoftheotherfamoussights.IfI'dgonealone,Icouldn'thaveseennearlyasmuch,becauseIwouldn'thaveknownmywayabout.。23二月20259:11:42下午21:11:422月-2515、會(huì)當(dāng)凌