2024細(xì)胞外囊泡分離與檢測(cè)技術(shù)專家共識(shí)要點(diǎn)(全文)本共識(shí)由中國研究型醫(yī)院學(xué)會(huì)細(xì)胞外囊泡研究與應(yīng)用專業(yè)委員會(huì)訂。2023年7月14日啟動(dòng)，成員間多次線上線下反復(fù)討論形成初稿，之后召開3次專家組研討會(huì)，最終針對(duì)推薦意見進(jìn)行投票表決，于2024年4月10日完成定稿。本共識(shí)專家組成員均填寫了利益聲明表，不存在方與維普等數(shù)據(jù)庫，綜合國內(nèi)外研究進(jìn)展進(jìn)行證據(jù)選擇。最終選擇66篇自我復(fù)制且不含功能性細(xì)胞核[1]。建議使用通用術(shù)語“EV”指代“exosome”和“ectosome”等，只應(yīng)在有強(qiáng)有力證原核細(xì)胞，如革蘭陽性和陰性細(xì)菌[3,4]。細(xì)胞培養(yǎng)條件能直接或間接影響EV的產(chǎn)量、組成和功能[5]。因此在真核細(xì)胞和原核細(xì)EV亞型和數(shù)量的分布[8]。最后，微生物及其組份可能影響宿主細(xì)成為理想的液體活檢標(biāo)志物，受到本領(lǐng)域研究者的廣泛關(guān)注[10]。血小板釋放EV,從而保證血液樣本EV分析的準(zhǔn)確性；(3)樣本收集與如RNA測(cè)序和蛋白組學(xué)分析[17]。EV研究中必須考慮幾個(gè)特異性因素：(1)某些蛋白質(zhì)(如總Tau蛋白或血液中的蛋白質(zhì)濃度是腦脊液的200~400倍，腦脊液EV蛋白標(biāo)志物研集的時(shí)間很重要；(5)由于腦脊液樣本采集方式具有侵入性、體積小且EV豐度低，其研究需要高產(chǎn)量的分離方法和高靈敏的檢測(cè)方法[18,4.唾液：健康成年人每天唾液分泌量為500~1500ml,并隨人體病理與生理狀態(tài)而變化[21]。唾液的非侵入性采樣特性使其成為一種極具用量需求如下：采樣時(shí)間應(yīng)選在上午8:00—10:00,以盡可能減少晝等口腔清潔操作。若采樣后立即檢測(cè)，唾液樣本可在室溫下短暫放置 下保存(不超過6h)。在-80℃條件下，唾液樣本可以長(zhǎng)期存放數(shù)年。最常用的唾液采集方法[22,23]。(三)組織標(biāo)本分離的樣品[24,25]。外基質(zhì)[27,28]。這種方法可能導(dǎo)致不同程度的細(xì)胞損傷，從而產(chǎn)些潛在的限制和變異[27]。(ultracentrifugation,UC)、尺寸排阻層析(sizeexclusion量濃度為60%、密度為1.32g/ml的碘克砂醇溶液)等試劑制作密度梯度/緩沖墊，從而實(shí)現(xiàn)EV及其亞類的精細(xì)分離[33]。UC法產(chǎn)物系將不同粒徑的顆粒分不同組份洗出的一種色譜學(xué)方法[34]。當(dāng)不具有較好的特異性[35]。但是，該方法只能分離具有特定表面標(biāo)志向出口，據(jù)此，AF4可獲得不同大小的顆粒[37]。該法對(duì)EV生物蛋白等)污染問題。膜壓力，將小顆粒和溶液推過濾膜，同時(shí)截留大顆粒在濾膜上的堆積從而提高過濾效率[38]。當(dāng)作為獨(dú)立分離技術(shù)使用時(shí)，切向流過濾法通常只能去除樣本內(nèi)粒徑小于EV的雜質(zhì)蛋白或顆粒。其操作簡(jiǎn)便，顆?；厥章矢?可達(dá)80%),是樣品和/或粗提產(chǎn)物濃切向流過濾法適用于大部分生物樣品特別是大體時(shí)，陰離子交換填料上結(jié)合的EV或其他物質(zhì)可與洗脫液中的離子發(fā)生交料的結(jié)合能力也不同，所以被洗脫到洗脫液中取及純化[39,40]。通過不同離子濃度緩沖液的梯度洗脫，還可在一定程度(表面基團(tuán)的不同)上實(shí)現(xiàn)EV的純化及細(xì)分[41]。陰離子交換色譜法適用于大量液體如細(xì)胞培養(yǎng)上太多雜蛋白混雜，比如培養(yǎng)細(xì)胞需要用無血清品中會(huì)混雜部分和EV帶同樣電荷的蛋白，可以根據(jù)不同的下游應(yīng)用場(chǎng)景建議4EV目前仍然缺乏通用的特異性標(biāo)志物，現(xiàn)有EV分離技術(shù)均不能在純度、特異性、回收率、操作復(fù)雜度和經(jīng)濟(jì)性等方面取得完美的平衡。離方法或方法組合作為基線，以評(píng)價(jià)所分離EV的科學(xué)有效推動(dòng)EV領(lǐng)域研究成果的臨床轉(zhuǎn)化。在大規(guī)模的細(xì)胞上清、大體積的研究特定EV亞群時(shí)推薦親和富集法(強(qiáng)推薦)。(二)新興EV分離方法合臨床應(yīng)用[42]。該方法可分離不同尺寸的EV亞群，但目前沒有子層產(chǎn)生的缺陷，經(jīng)靜電相互作用與富含磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)的彎曲膜結(jié)合[43],探針偶聯(lián)磁珠建議5以上新興EV分離方法在保留EV生物學(xué)活性、純化速度、操作便捷性、樣本體積要求等方面，較常用EV分離方法具有一定優(yōu)勢(shì)。超聲納濾法在基于尺寸的EV亞群分離中優(yōu)勢(shì)顯著,適用于EV亞群組成分析，但存在非膜性顆粒污染情況；多肽探針捕獲法和脂質(zhì)探針法適用于EV總?cè)旱姆蛛x，然而需注意其識(shí)別靶點(diǎn)具有脂膜親染；dSEC是簡(jiǎn)化改進(jìn)的SEC技術(shù)，其應(yīng)用還需更多地探索與研究(專electronmicroscopy,TEM)、掃描電子顯微鏡(scanningelectrmicroscopy,SEM)和原子力顯微鏡(atomicforcemicroscopy,AFM)等是在單顆粒水平對(duì)EV形貌、粒徑等物理形狀進(jìn)行表征的傳統(tǒng)技術(shù)，存在樣本制備繁瑣、分析速度慢、粒徑分布缺乏統(tǒng)計(jì)代表性等缺點(diǎn)[47,48,49]。冷凍透射電鏡(cryogenictransmissionelectroncryo-TEM遠(yuǎn)不能滿足EV的日常表征需求[50]。EV粒徑和顆粒濃度的快速測(cè)定[47,51,52]。其中DLS是一路徑小于真實(shí)值，因此其粒徑測(cè)定結(jié)果偏大[51]。TRPS是一種利細(xì)胞大小的微粒進(jìn)行快速定量分析或分選的技術(shù)[53]。當(dāng)其應(yīng)用于是最常用的EV蛋白表征技術(shù)[55,56]。然而，WB存在所需EV對(duì)已知蛋白進(jìn)行定性或定量表征[56]。和純化特定亞群的EV,為后續(xù)的功能研究提供了支持[53]。EV核酸標(biāo)志物的檢測(cè)[58]。然而，這兩種技術(shù)均在集權(quán)平均水平3.數(shù)字PCR技術(shù)：數(shù)字RCR(digit及RNA的數(shù)字化分析[59]。與傳統(tǒng)的熒光定量PCR相比數(shù)字PCR核酸標(biāo)志物檢測(cè)，有望進(jìn)一步應(yīng)用于早期臨床診斷等研究[60]。(四)單個(gè)EV分析技術(shù)并有望成為臨床實(shí)驗(yàn)室單個(gè)EV分析的理想檢測(cè)平臺(tái)[61]。此外，不同EV中的異質(zhì)性分布[62,63]。近年來，基于單EV的FCM2.單顆粒干涉反射成像技術(shù)(singleparticleinterferometric行干涉成像[6