PAGEPAGE6抗風(fēng)濕中藥制劑中非法添加多種化學(xué)成分的HPLC檢測劉放1，唐靚2(1．浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，杭州310013；2．浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院保健食品研究所，杭州310013)摘要：目的應(yīng)用反相高效液相色譜-紫外檢測(RP-HPLC-UV)技術(shù)分析檢測抗風(fēng)濕中藥制劑中可能存在的化學(xué)藥品成分。方法采用的色譜柱分別為AgilentHCC18(250mm4.6mm，5m)；流動相為甲醇-1mLL－1醋酸水溶液(60：40)，流速：1mL·min－1，撿測波長240nm。結(jié)果4種解熱鎮(zhèn)痛類化學(xué)藥物和2種糖皮質(zhì)激素關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；紫外檢測器；醋酸潑尼松；醋酸地塞米松；萘普生；雙氯芬酸鈉；吲哚美辛；布洛芬；中藥制劑DeterminationofpharmaceuticalcomponentinthetraditionalChineseantirheumaticbyRP-HPLC-UVLIUFang1，TANGLiang2(1．InstituteofMateriaMedicaofZhejiangAcademyofMedicalSciences,Hangzhou,,310013，China；2．InstituteofHealthFoodofZhejiangAcademyofMedicalSciences,Hangzhou,,310013，China)Abstract：ObjectiveTodeterminepharmaceuticalcomponentinthetraditionalChineseantirheumaticbyreversedphasehighperformanceliquidchromatography(RP-HPLC)-UV-Detector．MethodsTheseparationwasperformedonAgilentHCC18(4.6mm250mm，5m)withdetectivewavelengthat240nm．Themixturesolutionofmethanoland1mLL－1aceticacid(60：40)wasusedasmobilephasewithflowrateof1.0mLmin－1．ResultsThe4kindsantipyreticanalgesiccategorychemicalsubstancesand2kindsglucocorticoidwereprovedtobeseparatedcompletelyundertheselectedchromatographyconditions．ConclusionThemethodissimpleandaccurate，andcanbeusedfordetectingantipyreticanalgesiccategorychemicalsubstancesandglucocorticoidaduheratedinthepreparationoftraditionalChinesemedicineandhealthfood.Keywords：HPLC；UVD；prednisoneacetate；dexamethasoneacetate；naproxen：diclofenacsodium；indomethacin；ibuprofen；traditiona1Chinesemedicines風(fēng)濕性及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種常見病，多發(fā)病，是臨床醫(yī)學(xué)一大頑癥；其病程長，難于根治，給患者帶來終身痛苦。而抗風(fēng)濕類中藥多數(shù)顯效慢，需長期服用。因此，社會上一些無良企業(yè)和不法分子在抗風(fēng)濕類中藥制劑中非法添加多種化學(xué)藥物，由于用藥人群和用藥劑量難以得到有效控制，加上患者多在不知情下長期服用此類所謂的中成藥，將產(chǎn)生不可預(yù)知的不良反應(yīng)，給患者的健康和生命安全造成嚴(yán)重危害。由于抗風(fēng)濕類中成藥所占市場份額較大，更容易為不法廠商所利用和添加違禁藥品。目前，抗風(fēng)濕類中藥非法添加的西藥成分主要有兩大類，一類為解熱鎮(zhèn)痛抗炎類藥物，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎和抗風(fēng)濕等作用，————————————————————————————基金項目：浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計劃項目(編號：2012C037045)主要有雙氯芬酸鈉、吡羅昔康、布洛芬等；另一類為糖皮質(zhì)激素類藥，有著抗炎、抗過敏、抗毒素、抗休克和抑制免疫反應(yīng)等作用，主要有醋酸潑尼松、醋酸地塞米松等。這些藥物若長期、大量服用大都有嚴(yán)重的不良反應(yīng)，應(yīng)在醫(yī)師的指導(dǎo)下根據(jù)患者病情需要合理由于非甾體類抗炎藥和糖皮質(zhì)激素在治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病時效果顯著，因此成為對癥中成藥中非法添加化學(xué)藥品的主要對象。近年來這類藥物常被違法地不加標(biāo)注性的添加到中成藥制劑中以增強效果，這種現(xiàn)象已受到藥學(xué)工作者的普遍關(guān)注，已成為藥品檢驗研究的熱點之一。目前，在中成藥中數(shù)個或單類添加解熱鎮(zhèn)痛抗炎類藥物或糖皮質(zhì)激素藥物的分析報道較多[1-2]，但多種不同類非法添加成分的同時檢測報道較少[3-4]，故建立同時檢測不同類非法添加成分的方法是十分必要的。本文針對治療風(fēng)濕和類風(fēng)濕的中成藥制劑中非甾體抗炎藥和糖皮質(zhì)激素類藥的違規(guī)添加現(xiàn)象，建立了一種RP-HPLC-UVD快速分析方法，以對4個非甾體抗炎藥和2個糖皮質(zhì)激素類西藥成分進行快速篩查、定性識別和準(zhǔn)確定量。1儀器與試藥1.1儀器Shimadzu高效液相色譜系統(tǒng)(包括LC-10AT泵，CTO-10ASvp柱溫箱，SPD-10Avp檢測器)；HypersilC18(250mm4.6mm，5m)色譜柱（大連依利特），HypersilC8(250mm4.6mm，5m)色譜柱（大連依利特），AgilentHCC18(250mm4.6mm，5m)色譜柱（安捷侖公司）；N-2000se色譜工作站（浙江大學(xué)智達信息技術(shù)研究所），SartoriusBP124S電子天平(感量：1.2試藥對照品：醋酸潑尼松（批號100012-200706）、醋酸地塞米松（批號100122-200805）、萘普生（批號10198-200403）、吲哚美辛（批號100258-200904）、雙氯芬酸鈉（批號10334-200302）、布洛芬（批號100179-201105）對照品(中國藥品生物制品檢定所)。實驗樣品：17個廠家18批抗風(fēng)濕制劑從市場購置。試劑：乙腈(色譜純，MERCKLTD．)，甲醇（色譜純，上海陸都化學(xué)試劑廠），甲醇（色譜純，安徽時聯(lián)特種溶劑股份有限公司），甲醇（分析純，上海陸都化學(xué)試劑廠），冰醋酸（分析純，杭州化學(xué)試劑廠），乙醚（分析純，杭州化學(xué)試劑有限公司），水為純化水（自制）。2方法與結(jié)果2.1對照品的紫外吸收光譜繪制精密稱取醋酸潑尼松、醋酸地塞米松、萘普生、吲哚美辛、雙氯芬酸鈉和布洛芬適量，用甲醇制成每1mL約含10~20g的溶液，作為供試品溶液。以甲醇為參比，1cm比色杯，在波長200~400nm范圍內(nèi)進行掃描，結(jié)果醋酸潑尼松的max=239nm，萘普生的max=231nm、醋酸地塞米松的max=239nm、雙氯芬酸鈉的max=278nm、吲哚美辛的max=208nm、布洛芬的2.2色譜條件色譜柱：AgilentHCC18(250mm4.6mm，5m)色譜柱。流動相：甲醇-1mLL－1醋酸=60:40；流速：1.0mLmin－1；檢測波長：240nm；柱溫：30C；進樣體積：10L。在此色譜條件下，被測組分2.3溶液的制備2.3.1對照品溶液的制備分別精密稱取醋酸潑尼松、醋酸地塞米松、萘普生、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛、布洛芬6種對照品各約10.0mg，分別置10mL棕色量瓶中，加甲醇使其溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL各含1精密量取上述對照品儲備液各1mL，分置6只10mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL各含100g精密量取上述對照品儲備液各1mL（其中量取萘普生對照品儲備液0.5mL，布洛芬對照品儲備液4mL），置10mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL含萘普生50g、醋酸潑尼松醋酸地塞米松、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛各100g、布洛芬400g的混合對照品溶液。2.3.2供試品溶液的制備[1-2,5]樣品若為片劑、丸劑，則取其研細(xì)；樣品若為粉末，則直接取樣；若樣品為膠囊劑，則取內(nèi)容物研細(xì)，并與剪碎的膠囊殼混合均勻；樣品若為液體制劑，則直接取樣；稱取或量取上述樣品適量(相當(dāng)于藥品的1次服用量)，置100mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定質(zhì)量，超聲(300W，40kHz)提取30min，放冷至室溫，再用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45m微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液。樣品若為貼膏劑，則取1片，剪成碎片后，置于50mL具塞錐形瓶中，加乙醚15mL，多次洗滌并超聲，直至基質(zhì)從襯布上脫落并溶解，取乙醚溶液置蒸發(fā)皿中，于水浴上蒸發(fā)至近干后，殘渣用甲醇分次溶解和洗滌，合并甲醇液并全部轉(zhuǎn)移至50mL棕色量瓶中，再用甲醇稀釋置刻度，搖勻，用0.452.3.3陰性樣品對照溶液的制備取按標(biāo)準(zhǔn)檢驗符合規(guī)定，不含上述解熱鎮(zhèn)痛類和糖皮質(zhì)激素類化學(xué)藥物的陰性樣品1次服用量（6粒），將內(nèi)容物研細(xì)，并與剪碎的膠囊殼混合均勻，按2.2.2項下的方法制備2.3.4陽性樣品對照溶液的制備取按標(biāo)準(zhǔn)檢驗符合規(guī)定，不含上述解熱鎮(zhèn)痛類和糖皮質(zhì)激素類化學(xué)藥物的陰性樣品的一次服用量（6粒），將內(nèi)容物研細(xì)，并與剪碎的膠囊殼混合均勻，分別加入醋酸潑尼松、醋酸地塞米松、雙氯芬酸鈉和吲哚美辛各約2.5mg、萘普生約1.5mg、布洛芬約10.0mg，按2.2.2項下的方法制備陽2.4專屬性實驗分別精密量取上述單一對照品溶液、混合對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品對照溶液和陽性樣品對照溶液各10L，分別注入液相色譜儀，在2.2色譜條件下，6種化學(xué)藥品與中藥制劑中各成分之間均達到基線分離(R1.5)。陽性樣品對照溶液在與6種對照品色譜相應(yīng)位置上出現(xiàn)一一對應(yīng)的色譜峰，陰性樣品對照溶液在與6種2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制取2.3.1項下的混合對照品溶液，按2.2色譜條件，進樣量依次別為2.5，5.0，7.5，10.0，12.5，15.0和17.5L，記錄色譜圖，以進樣體積（X）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)色譜峰峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，結(jié)果6種成分在線性范圍內(nèi)的進樣體積（X）與峰面積（Y表16種化學(xué)藥品的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢測限及定量限Tab.1Theregressionequationoflinearrangeof6kindsofchemicaldrugscorrelationdetectionlimitandthelimitofquantification編號化學(xué)藥品回歸方程線性范圍/gmL－1相關(guān)系數(shù)檢測限/ng定量限/ng1醋酸潑尼松Y=4697.48X－10145.9825.5~178.50.99928.628.62萘普生Y=6385.33X+8248.4512.0~84.00.99881.86.03醋酸地塞米松Y=3911.67X－7377.4625.0~175.00.998912.541.64雙氯芬酸鈉Y=2666.43X－7689.1225.0~175.00.999011.839.35吲哚美辛Y=6339.37X－12978.2925.0~175.00.999111.237.36布洛芬Y=1877.22X－3275.6292.0~644.00.998520.568.32.6回收率實驗取上述陰性樣品一次服用量（6粒），將內(nèi)容物研細(xì)，并與剪碎的膠囊殼混合均勻，置具塞錐形瓶中，平行操作9份，按高、中、低質(zhì)量濃度，3份為一組，分別加入一定量的上述對照品儲備液，再按2.2.2項下方法制備供試品溶液。按2.1項下色譜條件，分別進樣測定，并計算平均加樣回收率。結(jié)果回收率分別為：醋酸潑尼松104.9％(RSD=2.3％，n=3)；萘普生104.9％(RSD=2.3％，n=3)；醋酸地塞米松100.9％(RSD=2.7％，n=3)；雙氯芬酸鈉106.0％(RSD=1.4％，n=3)；吲哚美辛103.6％(RSD=3.5％，n=3)；布洛芬101.4％(RSD=2.1％，n=3)。2.7日內(nèi)和日間精密度實驗取2.3.1項下的混合對照品溶液，按2.2色譜條件，連續(xù)進樣5次，每次10L，結(jié)果6種化學(xué)藥品峰面積的RSD為0.74%～1.57%(n=5)，相應(yīng)色譜峰保留時間的RSD為0.59%～0.87%(n=5)；取上述混合對照品溶液，每天進樣1次，每次10L，連續(xù)5d，結(jié)果6種化學(xué)藥品峰面積的RSD為1.96%～2.66%(n=5)，相應(yīng)色譜峰保留時間的RSD為0.92%～1.18%(n2.8重復(fù)性實驗按2.3.4項下操作，平行制備6份陽性樣品對照溶液，按2.2項下依法進行測定，結(jié)果6份陽性樣品對照溶液中6種化學(xué)藥品峰面積的RSD為0.29％~2.07％(n=6)，相應(yīng)色譜峰保留時間的RSD為0.20%～0.41%(n=6)，2.9供試品溶液穩(wěn)定性實驗取2.3.4項下的陽性樣品對照溶液，在室溫下分別在0，2，4，6，8和12h進樣，每次10L，結(jié)果6種化學(xué)藥品峰面積的RSD為1.22%～2.07%(n=6)，相應(yīng)色譜峰保留時間的RSD為1.23%～2.07%(n=6)。表明供試品溶液在室溫下12h內(nèi)，各成分色譜峰峰面積基本無變化，具有較好的穩(wěn)定性。2.10最低檢測限與最小定量限以信噪比(S/N)為3作為檢出限(LOD)，信噪比(S/N)為10作為定量限(LOQ)，取2.3.1項下每1mL含100g的6種化學(xué)對照品儲備液，用甲醇稀釋至一定質(zhì)量濃度2.11耐用性實驗取2.3.1項下的混合對照品溶液，分別采用3種不同品牌的色譜柱：①HypersilC18(250mm×4.6mm，5m)色譜柱；②AgilentHCC18(250mm×4.6mm，5m)色譜柱；③HypersilC8(250mm×4.6mm，5m)；按2.2項下色譜條件進行實驗，得到6種化學(xué)藥品相應(yīng)的系統(tǒng)適用性參數(shù)，見表2。結(jié)果顯示：4種非甾體抗炎類和2種糖皮質(zhì)激素類成分在上述3種不同品牌的色譜柱中均能夠表26種化學(xué)藥品在不同品牌色譜柱上的系統(tǒng)適用性參數(shù)Tab.2Theapplicabilityofsystemparametersindifferentcategoriesofchromatographiccolumnof6kindsofchemicaldrugs色譜柱類型系統(tǒng)適用性參數(shù)醋酸潑尼松萘普生醋酸地塞米松雙氯芬酸鈉吲哚美辛布洛芬HypersilC18理論板數(shù)/n7587.32110848.4579527.44914696.29413688.29116062.351分離度/R14.8186.5742.16017.1311.6443.810托尾因子/T1.1261.0551.0460.9910.9931.025AgilentHCC18理論板數(shù)/n10107.78513500.83311791.48616397.8415514.97117322.002分離度/R18.6617.3293.28218.0133.1331.991托尾因子/T1.0991.0631.0791.0190.9921.087HypersilC8理論板數(shù)/n7699.1009818.5388963.61711842.15613262.91614624.189分離度/R13.2655.5681.84014.1582.4505.186托尾因子/T1.0751.0180.9280.9580.9350.9632.12樣品分析取上述混合對照品溶液及17批批治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的中藥制劑，按2.3.2項下操作制備供試品溶液，按2.2色譜條件，依法測定，結(jié)果有3批為可疑樣品，其色譜圖中具有與醋酸潑尼松對照品溶液色譜保留時間相近的色譜峰，后經(jīng)LC-MS/MS確認(rèn)后，為陰性樣品予以排除；其余14批治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的中藥制劑均未檢出上述6種化學(xué)藥品成分。3討論3.1色譜條件的選擇3.1.1檢測波長的選擇根據(jù)2.1項下對照品的紫外吸收光譜的結(jié)果，以上多數(shù)化學(xué)藥品在240nrn左右有最大吸收，本文在220~280nm波長范圍內(nèi)對上述化學(xué)藥品的檢測波長進行了選擇。為兼顧響應(yīng)較低的藥物(雙氯芬酸鈉和布洛芬)的檢測靈敏度和基線平穩(wěn)，并參考有關(guān)文獻[1，6-9]，實驗選擇240nm作為分析3.1.2流動相的選擇3.1.2.1流動相組成根據(jù)文獻報道，中成藥中非法添加非甾體抗炎藥或糖皮質(zhì)激素的檢測，采用的流動相主要有乙腈-水[1，7-9]、甲醇-醋酸[10-11]、乙腈-醋酸銨[2-12]、甲醇-水-冰醋酸[13-14]等，經(jīng)過比較，最后經(jīng)綜合考慮各化合物的峰形及分離度等因素，確定甲醇-1mLL-1醋酸（60:40）為流動相。中藥成分一般為極性物質(zhì)，保留時間較小，在本文的色譜系統(tǒng)中，中藥制劑中輔料及其它成分的色譜峰的保留時間大多在10min以前，因此，對所分析的非甾體抗炎藥和糖皮質(zhì)激素的檢出干擾不大；而6種化學(xué)成分保留時間均大于10min，能與中藥制劑中輔料及其它成分完全分離。3.1.2.2醋酸含量實驗考察了用1，2和4mLL－1的醋酸溶液對色譜分離的影響，結(jié)果3種醋酸含量對色譜峰的分離度、峰形及峰面積基本一致，均能取得滿意的分離效果。出于對儀器及色譜柱的保護，綜合考慮各方面因素，選用酸性最小的1mLL－13.1.2.3流速實驗考察了0.8，1.0和1.2mLmin－13個流速對色譜分離的影響，結(jié)果當(dāng)流速為0.8mLmin－1時，各成分的保留時間延長，尤其是保留時間30min色譜峰變寬，峰形變差；當(dāng)流速分別為1.0和1.2mLmin－1時，各成分的保留時間適中，色譜峰的峰形良好，峰面積之間差別不大；但流速為1.2mLmin－1時，柱壓升高明顯，且相同時間內(nèi)流動相用量增加，分析成本加大；綜合考慮各個因素，實驗選用色譜分析中較為常用的流速：1.0mLmin－13.2制樣方法的選擇3.2.1提取溶劑的選擇一般甲醇對中藥制劑中的成分的提取效率較高，參考中國藥典[6]中被測各化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和溶解性能，經(jīng)綜合考慮確3.2.2提取方法的選擇實驗選用一般中藥制劑含量分析中較為常用的超聲提取方法，并對超聲提取時間進行比較(20、30和40min)，結(jié)果超聲提取30min，即可提取完全。樣品若為貼膏劑，提取方法則選用文獻的方法3.3分析對象（化學(xué)藥品）的選擇本文選擇的6種化學(xué)藥品包括4種非甾體類抗炎藥(萘普生、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛和布洛芬)、2種糖皮質(zhì)激素(醋酸潑尼松和醋酸地塞米松)，它們都與抗風(fēng)濕類中成藥作用相似、且這些原料成本相對偏低，價格便宜、容易被不法廠商非法添加到該類中成藥中；本文將6種化學(xué)藥品采用同一方法檢測，能夠使此類中成藥中摻偽的檢出更加快速和方便。3.4實驗應(yīng)避光操作由于本實驗所檢測的6種組分中，大部分對光不穩(wěn)定，所以在實驗過程中，應(yīng)注意避光操作。4小結(jié)中藥制劑及保健品中通常含有多種成分，為達到最好的分析結(jié)果，需選擇合適的提取溶劑、提取方法和優(yōu)化液相色譜的分離條件。在本文的選定的色譜條件下，中藥制劑中的輔料及其它成分的色譜峰的保留時間大多在10min以前，而各6種被測化學(xué)成分的出峰時間均在10min以后，故中藥制劑中的輔料及其它成分對所分析的非甾體抗炎藥（4種）和糖皮質(zhì)激素（2種）的檢出干擾不大。本法是一種快速篩查方法，一次提取和進樣可完成多種成分的定性，適用于懷疑摻有上述6種抗風(fēng)濕化學(xué)藥品的中藥制劑的快速篩查，方法的專屬性較強。由于化學(xué)藥品添加的量一般都很大，因此摻偽的色譜峰容易識別。但因抗風(fēng)濕類中藥制劑通常含有多味中藥，每種藥材中均含有多種組分，而紫外檢測器選擇性不強，光譜特征性不夠，僅采用色譜保留時間和紫外光譜鑒別易得出錯誤的結(jié)論?？傊?，HPLC法適用于對可疑樣品進行初篩，而準(zhǔn)確對中藥制劑中非法添加化學(xué)成分的鑒定還需要采用液-質(zhì)聯(lián)用儀進行確證。參考文獻：[1]吳小紅，李煥德．高效液相色譜法-二極管陣列檢測器同時分析測定中成藥及保健品中非法添加的9種糖皮質(zhì)激素[J]．中南藥