附件12急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)上下增減劑量法AcuteOralToxicityTestUp-andDownProcedure1范圍本方法規(guī)定了急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)上下增減劑量法（上下法）的基本原則、要求和方法。本方法適用于化妝品原料安全性毒理學(xué)檢測(cè)。2試驗(yàn)?zāi)康募毙越?jīng)口毒性試驗(yàn)是評(píng)估化妝品原料毒性特性的第一步，通過(guò)短時(shí)間經(jīng)口染毒可提供對(duì)健康危害的信息。試驗(yàn)結(jié)果可作為化妝品原料毒性分級(jí)和標(biāo)簽標(biāo)識(shí)以及確定亞慢性毒性試驗(yàn)和其他毒理學(xué)試驗(yàn)劑量的依據(jù)。3定義3.1急性經(jīng)口毒性acuteoraltoxicity一次或在24h內(nèi)多次經(jīng)口給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物受試物后，動(dòng)物在短期內(nèi)出現(xiàn)的健康損害效應(yīng)。3.2經(jīng)口半數(shù)致死量（LD50）oralmediumlethaldose經(jīng)口一次給予受試物后，引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物總體中半數(shù)死亡的毒物的統(tǒng)計(jì)學(xué)劑量。以單位體重接受受試物的重量(mg/kg或g/kg)來(lái)表示。3.3延遲死亡delayeddeath設(shè)定的給藥間隔（通常為48h）內(nèi)不引起受試動(dòng)物死亡或出現(xiàn)瀕死狀態(tài)，但在14d的觀察期間內(nèi)出現(xiàn)死亡。3.4劑量級(jí)數(shù)因子doseprogressionfactor也稱(chēng)為劑量步進(jìn)因子。是指主試驗(yàn)中，當(dāng)前劑量的一只動(dòng)物存活或死亡時(shí)，下一只動(dòng)物染毒劑量增加或降低倍數(shù)。劑量級(jí)數(shù)因子建議為1/（估計(jì)的劑量-反應(yīng)曲線斜率）的反對(duì)數(shù)。默認(rèn)的劑量級(jí)數(shù)因子為3.2，即0.5（1/2）的反對(duì)數(shù)。3.5限值劑量limitdose受試動(dòng)物進(jìn)行急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)的上限劑量（2000mg/kg或5000mg/kg）。3.6逆轉(zhuǎn)reversal是指在某個(gè)染毒劑量下觀察動(dòng)物無(wú)反應(yīng)，在下一個(gè)染毒劑量下觀察動(dòng)物有反應(yīng)的現(xiàn)象，反之亦然（也就是前一個(gè)動(dòng)物發(fā)生反應(yīng)，后一個(gè)動(dòng)物無(wú)反應(yīng)）。因此，一對(duì)不同的動(dòng)物染毒反應(yīng)情況產(chǎn)生一個(gè)逆轉(zhuǎn)。3.7名義受試動(dòng)物量nominalsamplesize是指受試動(dòng)物的總數(shù)量按下列規(guī)則減去一定量動(dòng)物數(shù)：（1）減去染毒序列開(kāi)始時(shí)出現(xiàn)相同反應(yīng)的最后1只動(dòng)物之前的受試動(dòng)物數(shù)量，（2）或減去第一次發(fā)生逆轉(zhuǎn)的一對(duì)動(dòng)物之前受試動(dòng)物的數(shù)量。如在一個(gè)模擬序列：OOOXXOXO中（X表示死亡，O表示存活），此時(shí)，受試動(dòng)物的總數(shù)量（或常規(guī)意義的動(dòng)物數(shù)）是8，名義受試動(dòng)物量是6。3.8概率probit是“概率積分轉(zhuǎn)換（probabilityintegraltransformation）”術(shù)語(yǔ)的縮寫(xiě)，預(yù)期反應(yīng)與劑量（通常為對(duì)數(shù)值）呈標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布（對(duì)稱(chēng)軸為反應(yīng)均值，尺度參數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)差σ），劑量反應(yīng)模型的概率可以通過(guò)其與σ的倒數(shù)成直線關(guān)系進(jìn)行分析。致死量的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布曲線是對(duì)稱(chēng)的，曲線的中值就是真實(shí)LD50或中位值。3.9標(biāo)準(zhǔn)偏差（σ）standarddeviation是一個(gè)對(duì)數(shù)正態(tài)曲線的標(biāo)準(zhǔn)偏差，用來(lái)描述受試動(dòng)物對(duì)受試物的耐受范圍（如染毒劑量超過(guò)耐受劑量，受試動(dòng)物預(yù)期能發(fā)生反應(yīng)）。預(yù)估的σ值可以預(yù)測(cè)受試動(dòng)物對(duì)整個(gè)染毒劑量區(qū)間發(fā)生反應(yīng)的變異性。3.10斜率（劑量-反應(yīng)曲線）slope(ofthedose-responsecurve)劑量反應(yīng)曲線的斜率，是反應(yīng)曲線相對(duì)于劑量數(shù)軸的傾斜程度。在進(jìn)行概率分析時(shí)，用概率值表示的反應(yīng)相對(duì)于對(duì)數(shù)劑量呈直線關(guān)系，此時(shí)，斜率是σ的倒數(shù)（σ是表示受試動(dòng)物耐受性正態(tài)分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差）。4試驗(yàn)的基本原則該方法旨在以最小量的動(dòng)物測(cè)出化妝品原料的急性經(jīng)口毒性，適合于能引起動(dòng)物快速死亡的受試物。按照預(yù)定的試驗(yàn)規(guī)則和程序，以管飼法經(jīng)口給予受試物。染毒后觀察動(dòng)物的毒性反應(yīng)和死亡情況。試驗(yàn)期間死亡的動(dòng)物要進(jìn)行尸檢，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)仍存活的動(dòng)物要處死并進(jìn)行尸檢。本方法主要適用于嚙齒類(lèi)動(dòng)物的研究，通常選用雌性大鼠。也可選用其他嚙齒類(lèi)動(dòng)物。該方法分為限量試驗(yàn)（limittest）和主試驗(yàn)（maintest）。限量試驗(yàn)用不多于5只動(dòng)物評(píng)價(jià)受試物L(fēng)D50是否高于限值劑量（2000mg/kg，或5000mg/kg），主要用于有資料提示受試物毒性可能較小的情況。主試驗(yàn)采用一個(gè)單一劑量級(jí)數(shù)染毒序列，每次一只動(dòng)物，根據(jù)動(dòng)物的存活情況確定下一只動(dòng)物的染毒劑量，染毒間隔通常為48h。當(dāng)滿足停止規(guī)則之一時(shí)，停止染毒，采用最大似然法對(duì)LD50進(jìn)行計(jì)算。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果對(duì)LD50和置信區(qū)間進(jìn)行評(píng)估。本方法給出了試驗(yàn)停止規(guī)則和LD50計(jì)算方法，實(shí)際工作中可采用計(jì)算機(jī)化的程序進(jìn)行劑量設(shè)計(jì)和結(jié)果計(jì)算。5試驗(yàn)方法5.1受試物受試物應(yīng)溶解或懸浮于適宜的介質(zhì)中，建議首選水，其次考慮使用植物油（如玉米油）或其他介質(zhì)（如羧甲基纖維素、明膠、淀粉等），制成溶液、混懸液或乳濁液。對(duì)非水介質(zhì)，應(yīng)了解其毒理特性，否則應(yīng)在試驗(yàn)前先確定其毒性。每次經(jīng)口染毒液體的最大容量取決于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的大小，對(duì)嚙齒類(lèi)動(dòng)物所給液體容量一般為1mL/100g，水溶液可至2mL/100g。通過(guò)調(diào)整受試物溶液濃度使各劑量組經(jīng)口染毒的容量一致。5.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)環(huán)境嚙齒類(lèi)動(dòng)物中首選大鼠，也可選用其他嚙齒類(lèi)動(dòng)物。通常選用單一性別大鼠。在缺乏構(gòu)效關(guān)系或無(wú)提示雄性更為敏感性別動(dòng)物的前提下，一般選用雌性動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)用雄性大鼠做試驗(yàn)時(shí)，要提供充分的理由。應(yīng)選用年輕健康動(dòng)物和非經(jīng)產(chǎn)、未受孕的雌性動(dòng)物。在試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，動(dòng)物應(yīng)在8周~12周齡，體重變異應(yīng)不超過(guò)平均體重的±20%。如果進(jìn)行連續(xù)的試驗(yàn)，要注意確保在整個(gè)研究中動(dòng)物的體重和周齡符合要求。試驗(yàn)前動(dòng)物要在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房環(huán)境中至少適應(yīng)3~5d時(shí)間。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房應(yīng)符合國(guó)家相應(yīng)規(guī)定。選用標(biāo)準(zhǔn)配合飼料，飲水不限制。5.3劑量水平限量試驗(yàn)采用限值劑量（2000mg/kg，或5000mg/kg）。主試驗(yàn)按照低于最佳估算LD50一級(jí)的劑量給第一只動(dòng)物染毒。如果受試動(dòng)物存活，第二只動(dòng)物采用高一級(jí)劑量染毒；如果第一只受試動(dòng)物死亡，第二只動(dòng)物就采用低一級(jí)劑量。劑量級(jí)數(shù)因子默認(rèn)為3.2。對(duì)每只動(dòng)物都應(yīng)認(rèn)真觀察至48h后，才能決定是否對(duì)下一只動(dòng)物染毒或染毒劑量的多少。當(dāng)滿足停止規(guī)則之一時(shí)，停止染毒。大多數(shù)情況下，在出現(xiàn)第一次逆轉(zhuǎn)后再進(jìn)行4只動(dòng)物就可完成試驗(yàn)。5.4試驗(yàn)步驟5.4.1染毒動(dòng)物在染毒前應(yīng)禁食（大鼠禁食不禁水過(guò)夜，小鼠禁食不禁水3h~4h）。禁食后對(duì)動(dòng)物稱(chēng)重，根據(jù)禁食后的動(dòng)物體重計(jì)算染毒劑量，然后再進(jìn)行染毒。對(duì)動(dòng)物用管飼法一次進(jìn)行染毒，若估計(jì)受試物毒性很低，一次給予容量太大，也可在24h內(nèi)分2~3次染毒，但合并作為一次劑量計(jì)算。染毒后繼續(xù)禁食3h~4h。若采用分批多次染毒，根據(jù)染毒間隔長(zhǎng)短，必要時(shí)可給動(dòng)物一定量的食物和水。5.4.2限量試驗(yàn)和主試驗(yàn)如果有相關(guān)的資料表明受試物可能無(wú)毒（致死量高于限值劑量），可以進(jìn)行限量試驗(yàn)。受試物的毒性信息可以通過(guò)相似化合物或相似混合物及產(chǎn)品的測(cè)試信息來(lái)獲得。當(dāng)受試物的毒性信息很少或沒(méi)有時(shí)，或推測(cè)到受試物有毒時(shí)，應(yīng)進(jìn)行主試驗(yàn)。5.4.2.1限量試驗(yàn)（1）2000mg/kg限量試驗(yàn)用2000mg/kg劑量對(duì)一只動(dòng)物進(jìn)行染毒。間隔期內(nèi)（48h）如果動(dòng)物出現(xiàn)死亡，進(jìn)行主試驗(yàn)并計(jì)算LD50。如果動(dòng)物存活，對(duì)另外4只動(dòng)物進(jìn)行連續(xù)染毒，動(dòng)物總數(shù)為5只。觀察期內(nèi)（14d）如果有3只動(dòng)物出現(xiàn)死亡，停止限量試驗(yàn)，進(jìn)行主試驗(yàn)。如果3只或3只以上動(dòng)物存活，那么LD50大于2000mg/kg。如果試驗(yàn)中動(dòng)物出現(xiàn)意外的延遲死亡，此時(shí)要停止染毒并觀察所有的動(dòng)物，看其他動(dòng)物在相同的觀察周期是否也會(huì)出現(xiàn)死亡。延遲死亡的動(dòng)物應(yīng)同其他死亡的動(dòng)物一樣記入死亡數(shù)量。結(jié)果評(píng)估如下（O=無(wú)反應(yīng)即存活，X=反應(yīng)即死亡）：a)當(dāng)3只或以上動(dòng)物出現(xiàn)死亡，LD50低于限量劑量（2000mg/kg），需進(jìn)行主試驗(yàn)。OXOXXOOXXXOXXOXOXXXb)測(cè)試5只動(dòng)物。當(dāng)3只或3只以上動(dòng)物存活，則LD50大于限量劑量（2000mg/kg）。OOOOOOOOXOOOOOXOOOXXOXOXOOXOOO/XOOXXOOOXOO/XOXXOO（2）5000mg/kg限量試驗(yàn)只在為滿足監(jiān)管需求的特殊情況下才使用5000mg/kg進(jìn)行限量試驗(yàn)。出于對(duì)動(dòng)物的人道考慮，不主張對(duì)GHS（全球化學(xué)品統(tǒng)一分類(lèi)和標(biāo)簽制度）第5類(lèi)（LD50介于2000mg/kg~5000mg/kg）物質(zhì)進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，只有當(dāng)試驗(yàn)結(jié)果極可能涉及人類(lèi)或動(dòng)物健康以及環(huán)境保護(hù)等因素時(shí)，方考慮進(jìn)行該試驗(yàn)。對(duì)一只動(dòng)物用5000mg/kg劑量進(jìn)行染毒，如果動(dòng)物死亡，就進(jìn)行主試驗(yàn)來(lái)確定LD50。如果動(dòng)物存活，繼續(xù)對(duì)另外兩只動(dòng)物進(jìn)行染毒。如果兩只動(dòng)物都存活，則LD50高于限值劑量，限量試驗(yàn)結(jié)束（持續(xù)觀察14d，不對(duì)另外的動(dòng)物進(jìn)行染毒）。如果一只或者兩只動(dòng)物出現(xiàn)死亡，那么再給另外兩只動(dòng)物染毒，每次一只。如果試驗(yàn)中有一只動(dòng)物出現(xiàn)延遲死亡且其他動(dòng)物存活，此時(shí)應(yīng)停止染毒并觀察所有的動(dòng)物，看其他動(dòng)物在相同的觀察周期是否也會(huì)死亡。延遲死亡的動(dòng)物應(yīng)同其他死亡的動(dòng)物一樣記入死亡數(shù)量。結(jié)果評(píng)估如下：當(dāng)3只或更多的動(dòng)物死亡，LD50低于5000mg/kg。OXOXXOOXXXOXXOXOXXX當(dāng)3只或更多的動(dòng)物存活，LD50高于5000mg/kg。OOOOXOXOOXOOOOXXOOOXOOXXOO5.4.2.2主試驗(yàn)（1）通常每間隔48h對(duì)每只動(dòng)物逐一染毒。染毒間隔可根據(jù)毒性反應(yīng)發(fā)生、持續(xù)時(shí)間和毒性癥狀的嚴(yán)重性調(diào)整。應(yīng)當(dāng)確認(rèn)先前染毒的動(dòng)物仍然存活后，方可進(jìn)行下一個(gè)劑量的染毒。染毒間隔時(shí)間可做酌情調(diào)整（如結(jié)果不確定時(shí)）。采用固定的染毒間隔試驗(yàn)較易進(jìn)行。但試驗(yàn)中調(diào)整了染毒間隔也不必要重新計(jì)算染毒劑量和似然比。選擇起始劑量時(shí)，可參考所有可得到的資料，包括與受試物在結(jié)構(gòu)上相關(guān)的物質(zhì)信息以及受試物的所有毒性測(cè)試結(jié)果，來(lái)預(yù)估受試物L(fēng)D50和劑量反應(yīng)曲線的斜率。（2）第一只動(dòng)物的染毒劑量要比LD50的最佳預(yù)測(cè)值低一級(jí)。如果這只動(dòng)物存活，就使用較高的劑量給第二只動(dòng)物染毒。如果這只動(dòng)物出現(xiàn)死亡或者瀕死的狀況，就用低一級(jí)的劑量對(duì)第二只動(dòng)物進(jìn)行染毒。劑量級(jí)數(shù)因子應(yīng)該選擇為1/（預(yù)估的劑量-反應(yīng)曲線斜率）的反對(duì)數(shù)，而且在整個(gè)測(cè)試中應(yīng)該保持不變。當(dāng)沒(méi)有受試物的斜率信息時(shí)，使用默認(rèn)劑量級(jí)數(shù)因子為3.2（對(duì)應(yīng)的斜率為2）。染毒上限為2000mg/kg，劑量依次為1.75mg/kg，5.5mg/kg，17.5mg/kg，55mg/kg，175mg/kg，550mg/kg，2000mg/kg（有特殊監(jiān)管要求時(shí)可使用染毒上限5000mg/kg，劑量依次為1.75mg/kg，5.5mg/kg，17.5mg/kg，55mg/kg，175mg/kg，550mg/kg，1750mg/kg，5000mg/kg的序列）。如果無(wú)法預(yù)測(cè)受試物的致死量信息，染毒劑量應(yīng)當(dāng)從175mg/kg開(kāi)始。通常這個(gè)劑量是亞致死量，采用此劑量可以減少動(dòng)物的疼痛和受苦程度。如果動(dòng)物對(duì)受試物的耐受程度變化范圍預(yù)計(jì)很大（即反應(yīng)-對(duì)數(shù)劑量曲線預(yù)計(jì)斜率低于2.0），開(kāi)始試驗(yàn)前應(yīng)考慮在默認(rèn)劑量級(jí)數(shù)因子（3.2）上增加劑量級(jí)數(shù)。對(duì)于已知斜率很陡的受試物，應(yīng)選擇比默認(rèn)值小的劑量級(jí)數(shù)因子。表1提供了從1到8的整數(shù)斜率的劑量級(jí)數(shù)表，包括常用起始劑量175mg/kg。（3）觀察至設(shè)定的時(shí)間間隔后（如48h），根據(jù)所有動(dòng)物的試驗(yàn)結(jié)果確定是否繼續(xù)進(jìn)行染毒。當(dāng)符合以下停止規(guī)則之一時(shí)，染毒可以停止：a)在試驗(yàn)上限劑量時(shí)有連續(xù)3只動(dòng)物存活；b)在連續(xù)測(cè)試的任意6只動(dòng)物中有5個(gè)逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象發(fā)生；c)第一個(gè)逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象后至少有4只受試動(dòng)物，求得的似然比超過(guò)臨界值（從第一個(gè)逆轉(zhuǎn)后的第4只動(dòng)物開(kāi)始，每一次染毒后都要進(jìn)行計(jì)算）。對(duì)于絕大多數(shù)LD50和斜率的組合情況，試驗(yàn)出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)后再進(jìn)行4到6只動(dòng)物即可滿足停止規(guī)則c）。在一些情況下，對(duì)于劑量-反應(yīng)曲線斜率較小的化學(xué)物質(zhì)，可能需要更多的動(dòng)物（最高試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)為15）。（4）試驗(yàn)滿足停止規(guī)則后，根據(jù)最終試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算LD50。（5）出于人道而處死的瀕死動(dòng)物應(yīng)等同于試驗(yàn)死亡動(dòng)物。如果試驗(yàn)中一只動(dòng)物發(fā)生延遲死亡，并且其他給予同等或更高劑量的動(dòng)物仍存活，比較合適的做法是停止染毒，并觀察所有動(dòng)物，看其它動(dòng)物是否會(huì)在相似的觀察期內(nèi)死亡。如果其他存活的動(dòng)物同樣出現(xiàn)死亡，則表明所有劑量水平都超過(guò)了LD50，應(yīng)重新進(jìn)行試驗(yàn)，起始劑量至少低于最低的死亡劑量?jī)杉?jí)（并延長(zhǎng)觀察時(shí)間）。如果存活動(dòng)物在之前死亡的動(dòng)物相同或者更高劑量能夠存活，則不需要改變劑量級(jí)數(shù)，因?yàn)檩^低劑量的死亡動(dòng)物納入計(jì)算會(huì)求得更低的LD50值。5.5觀察5.5.1染毒后，對(duì)每只動(dòng)物都應(yīng)有單獨(dú)全面的記錄，在染毒后的30min內(nèi)每只動(dòng)物至少分別觀察一次，第1d內(nèi)要定時(shí)觀察（在前4h內(nèi)要特別注意）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的中毒表現(xiàn)和死亡情況，其后至少每天進(jìn)行一次仔細(xì)的檢查。詳細(xì)記錄被毛和皮膚、眼睛和粘膜，呼吸、循環(huán)、自主神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肢體活動(dòng)和行為等改變。特別注意是否出現(xiàn)震顫、抽搐、流涎、腹瀉、嗜睡和昏迷等癥狀。應(yīng)記錄毒作用體征出現(xiàn)和消失的時(shí)間和死亡時(shí)間。發(fā)現(xiàn)處于瀕死狀態(tài)動(dòng)物以及動(dòng)物表現(xiàn)出劇烈的疼痛或持續(xù)嚴(yán)重痛苦的病癥時(shí)給予人道處死。當(dāng)動(dòng)物因人道原因處死或被發(fā)現(xiàn)死亡時(shí)，應(yīng)盡可能準(zhǔn)確地記錄死亡時(shí)間。5.5.2觀察期限一般不超過(guò)14d，但觀察時(shí)間并非一成不變，要視動(dòng)物中毒反應(yīng)的嚴(yán)重程度、癥狀出現(xiàn)快慢和恢復(fù)期長(zhǎng)短而定。若有延遲死亡跡象，可延長(zhǎng)觀察時(shí)間。觀察期內(nèi)存活動(dòng)物每周稱(chēng)重，觀察期結(jié)束存活動(dòng)物應(yīng)稱(chēng)重，處死后進(jìn)行尸檢。5.5.3對(duì)全部動(dòng)物進(jìn)行大體解剖學(xué)檢查，并記錄全部大體病理改變。對(duì)存活24h和24h以上動(dòng)物并存在大體病理改變的器官可進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。5.6試驗(yàn)數(shù)據(jù)需要提供個(gè)體動(dòng)物的數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)應(yīng)以列表形式匯總，內(nèi)容包括在每個(gè)染毒劑量試驗(yàn)所用的動(dòng)物數(shù)量、出現(xiàn)毒性癥狀的動(dòng)物總數(shù)，試驗(yàn)過(guò)程中死亡的或人道處死的動(dòng)物數(shù)量，個(gè)體動(dòng)物的死亡時(shí)間，以及毒性表現(xiàn)及其可逆性的時(shí)間過(guò)程，尸檢結(jié)果。同時(shí)提供選擇起始劑量和劑量級(jí)數(shù)的基本理由和所有支持?jǐn)?shù)據(jù)。5.6.1主試驗(yàn)中LD50的計(jì)算5.6.1.1除了5.6.1.2描述的特殊情況以外，采用最大似然法對(duì)LD50的進(jìn)行計(jì)算。所有死亡動(dòng)物，包括直接死亡、延遲死亡或人道處死，都應(yīng)納入最大似然法分析中。似然函數(shù)見(jiàn)式（1）。L=L1L2…Ln （1）如果第i個(gè)動(dòng)物存活，Li=1-F(Zi)或 （2）如果第i個(gè)動(dòng)物死亡，Li=F(Zi) （3）式中:L——試驗(yàn)結(jié)果的似然值;n——試驗(yàn)動(dòng)物的總數(shù)；F——標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)累積分布函數(shù)（標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的概率密度函數(shù)）；Zi——〔log(di)-μ〕／σ；di——第i個(gè)動(dòng)物的染毒劑量。μ和σ為給定，σ為標(biāo)準(zhǔn)偏差。真實(shí)LD50的估算值由似然值L取最大值時(shí)的μ計(jì)算得到。σ的估計(jì)值一般為0.5。5.6.1.2在某些情況下，不能進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算或有可能得出錯(cuò)誤結(jié)果。出現(xiàn)以下情況時(shí)可以通過(guò)特殊方法確定LD50的估算值：a)如果試驗(yàn)基于規(guī)則a）（即重復(fù)進(jìn)行上限劑量試驗(yàn)）停止，或基于限值劑量停止試驗(yàn)，則LD50高于限值劑量。分類(lèi)也在此基礎(chǔ)上完成。b)如果所有死亡動(dòng)物的染毒劑量比所有存活動(dòng)物的高（或者所有存活動(dòng)物的染毒劑量比所有死亡動(dòng)物的高，雖然這幾乎是不可能的），則LD50介于存活動(dòng)物染毒劑量和死亡動(dòng)物染毒劑量之間。這時(shí)試驗(yàn)結(jié)果不能進(jìn)一步給出準(zhǔn)確LD50的信息。但基于給定的σ值，也可以計(jì)算出最大似然LD50。c)如果只有一個(gè)染毒劑量同時(shí)出現(xiàn)存活和死亡動(dòng)物，其他死亡動(dòng)物都出現(xiàn)在更高的染毒劑量而其他存活動(dòng)物都出現(xiàn)在更低的染毒劑量，或者出現(xiàn)相反的情況，則LD50等于那個(gè)染毒劑量。如果受試物是一個(gè)與之非常接近的相關(guān)物質(zhì)，應(yīng)該使用一個(gè)較小染毒劑量級(jí)數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)。除上述情況外，用最大似然法計(jì)算LD50。5.6.1.3最大似然計(jì)算可以采用SAS、BMDP等統(tǒng)計(jì)軟件。得到的結(jié)果是logLD50估算值及其標(biāo)準(zhǔn)誤差。5.6.1.4似然比停止規(guī)則c）是基于試驗(yàn)程序中的三次測(cè)量，分別是對(duì)應(yīng)于不同μ值的似然性結(jié)果。當(dāng)?shù)?只名義受試動(dòng)物不能滿足停止規(guī)則（a）或（b）時(shí)，對(duì)之后的每個(gè)動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)行計(jì)算。如果符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)則，試驗(yàn)停止，可用最大似然法計(jì)算出LD50。5.6.2置信區(qū)間的估計(jì)5.6.2.1根據(jù)主試驗(yàn)和LD50值的計(jì)算，可能得出LD50的置信區(qū)間。置信區(qū)間反應(yīng)了主試驗(yàn)的可靠性和實(shí)用性。置信區(qū)間寬表明LD50計(jì)算值有較多的不確定性。LD50計(jì)算值可靠性低，其實(shí)用性也有限。置信區(qū)間窄表明LD50計(jì)算值不確定性小。LD50計(jì)算值可靠性高，其實(shí)用性也好。這就意味著，此時(shí)如果重復(fù)進(jìn)行主試驗(yàn)，那么新的LD50計(jì)算值應(yīng)與原來(lái)的LD50計(jì)算值接近，并且這兩個(gè)LD50計(jì)算值都接近真實(shí)LD50。5.6.2.2根據(jù)主試驗(yàn)結(jié)果，可得出真實(shí)LD50兩種類(lèi)型置信區(qū)間中的一種。（1）當(dāng)至少有三個(gè)染毒劑量，且中間劑量染毒至少有一只動(dòng)物存活和一只動(dòng)物死亡，此時(shí)，可以用輪廓似然（profile-likelihood）的計(jì)算程序得到一個(gè)置信區(qū)間，該區(qū)間用于描述在95%的情況下包含真實(shí)LD50值。然而，由于希望使用少量的動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)，實(shí)際可信度水平一般不高。使用隨機(jī)停止規(guī)則改善了應(yīng)對(duì)條件變化的能力，但也會(huì)導(dǎo)致報(bào)告的置信水平與真實(shí)置信水平存在稍許差別。（2）如果在某一染毒劑量或低于該劑量的所有的動(dòng)物存活，且所有的動(dòng)物在相鄰的高一級(jí)染毒劑量時(shí)死亡，則計(jì)算的置信區(qū)間下限為所有動(dòng)物存活時(shí)的最高染毒劑量，上限為所有動(dòng)物死亡時(shí)的染毒劑量。這個(gè)區(qū)間標(biāo)注為“近似”，即這個(gè)區(qū)間的準(zhǔn)確置信水平不能明確。但由于這種類(lèi)型的反應(yīng)僅發(fā)生在劑量反應(yīng)曲線較陡時(shí)，在大多數(shù)情況下，真實(shí)LD50位于計(jì)算的置信區(qū)間內(nèi)或非常接近。這個(gè)區(qū)間相對(duì)較窄，且在大多數(shù)的實(shí)際使用中比較準(zhǔn)確。5.6.2.3在某些情況下，報(bào)告的置信區(qū)間為無(wú)窮大，此時(shí)它的下限為零，或上限為無(wú)窮大，或兩者兼而有之。此類(lèi)置信區(qū)間可見(jiàn)于所有動(dòng)物死亡或所有動(dòng)物存活的情況。5.7試驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果時(shí)，應(yīng)將LD50與觀察到的毒性效應(yīng)和尸檢所見(jiàn)相結(jié)合考慮，LD50值是受試物毒性分級(jí)和標(biāo)簽標(biāo)識(shí)以及判定受試物經(jīng)消化道攝入后引起動(dòng)物死亡可能性大小的依據(jù)。引用LD50值時(shí)一定要注明所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種屬、性別、染毒途徑、觀察期限等。評(píng)價(jià)應(yīng)包括動(dòng)物接觸受試物與動(dòng)物異常表現(xiàn)（包括行為和臨床改變、大體損傷、體重變化、致死效應(yīng)及其他毒性作用）的發(fā)生率和嚴(yán)重程度之間的關(guān)系。毒性分級(jí)見(jiàn)表2。如無(wú)特殊要求，急性經(jīng)口