反義RNA技術(shù)（Antisense

RNA)反義RNA技術(shù)（Antisense

RNA)反義RNA概述反義RNA技術(shù)關(guān)鍵體內(nèi)、體外篩選高效反義RNA反義RNA的應(yīng)用小結(jié)反義RNA概述反義RNA概念反義RNA與反義ODN的比較反義RNA的機制Antisense

RNA與Sense

RNA的結(jié)合反義RNA概念

反義RNA指的是細胞內(nèi)從載體上轉(zhuǎn)錄的與靶RNA互補的RNA，從而抑制目的基因的表達。反義RNA與反義ODN的比較反義ODN的優(yōu)點：系人工合成，易獲得易標準化易修飾易控制反義RNA的優(yōu)點

是從載體上轉(zhuǎn)錄而來，在細胞內(nèi)存在的時間久

可以使用不同的啟動子而使它的表達具有細胞專一性成本低反義RNA的機制使靶基因轉(zhuǎn)錄減弱影響剪切影響翻譯促進靶RNA的降解Antisense

RNA與Sense

RNA的結(jié)合一步反應(yīng)機制（a

one-step

mechanism)

兩步結(jié)合機制（a

two-step

bindingmechanism)一步反應(yīng)機制（a

one-step

mechanism)

二聚體的形成是從兩條鏈識別的部位開始進行的。例如：RNA-IN/RNA-OUT兩步結(jié)合機制（a

two-step

binding

mechanism)

兩條鏈形成二聚體的部位與其開始識別的部位是分開的。代表有：質(zhì)粒R1中的

CopA/CopT,質(zhì)粒ColE1中的RNAI/RNAII一步反應(yīng)機制舉例

反義鏈的5’leader序列對于結(jié)合是重要的，通過突變分析發(fā)現(xiàn)loop區(qū)域?qū)τ诮Y(jié)合并不重要兩步結(jié)合機制舉例

反義鏈和靶

RNA的loop區(qū)域?qū)τ诙垠w的形成是重要的二：反義RNA技術(shù)關(guān)鍵Antisense

RNA對應(yīng)靶RNA的位置Antisense

RNA與靶RNA的結(jié)構(gòu)Antisense

RNA的長度Antisense

RNA對應(yīng)靶RNA的位置(Nucleic

Acids

Research,2000,Vol

28,1340-1347)有文獻報道基因的5‘UTR、3’UTR、5’加帽區(qū)、spling

donor和receptor

cite、起始密碼所在部位適合作為靶RNA的位置但是到底是這一部位的二級結(jié)構(gòu)重要還是這個部位重要？Antisense

RNA與靶RNA的結(jié)構(gòu)

自然發(fā)生的反義RNA表現(xiàn)出高度的二級

結(jié)構(gòu)，通常有一到幾個莖區(qū)，莖區(qū)頂部

有6--7個不配對堿基組成的環(huán)，這樣的結(jié)構(gòu)也出現(xiàn)在靶RNA中

反義RNA的二級結(jié)構(gòu)也影響它們之間的結(jié)合Antisense

RNA的長度自然發(fā)生的Antisense

RNA的長度文獻普遍認可的長度文獻報道的其它長度針對HIV的Antisense

RNA的長度

一種有爭議的觀點－Antisense

RNA越長越有效自然發(fā)生的Antisense

RNA的長度(

Science

Vol

286,950-一般長25nt952,1999)普遍認可的長度一般是70-110nt文獻報道的其它長度645nt（AR6）69nt150nt全長基因（E6/E7）近200nt（3個ribozyme）針對HIV的Antisense

RNA的長度Y69Y150AR6SR6HIV-1AR2AR10AR6AR5AR115325

536854385926一種有新觀點－Antisense

RNA越長越有效

George

Sczaliel提出的觀點，建立在數(shù)學(xué)模型和實驗的基礎(chǔ)上，我認為不完善。(J.

Mol.Bio.

294,1127-1134,

1999)假設(shè)的根據(jù)

溫度在Tm和Tm-30

oC時，結(jié)合常數(shù)K和最短鏈長度的平方根成正比L(

溫度低于Tm-30

oC時，K和10

=0.0017)成正比實驗步驟

首先體外轉(zhuǎn)錄靶RNA和反義RNA，在5’端用同位素標記反義RNA

通過3’堿水解產(chǎn)生連續(xù)缺失，把反義RNA

e和靶RNA在37 c和一定的緩沖液存在的條件下退火，

不同時間取出部分產(chǎn)物電泳，切割雙鏈部分，再進行變性膠電泳，篩選與靶RNA高效結(jié)合的反義RNA。圖示實驗結(jié)果體外篩選針對HBV的反義RNAAntisense

RNA小結(jié)結(jié)構(gòu)更加重要

含有這一結(jié)構(gòu)的Antisense

RNA并不是都有效

但是Antisense

RNA越長，含有的有效結(jié)構(gòu)越多，盡管某些二級結(jié)構(gòu)會改變。仍然有必要進行篩選體內(nèi)、體外篩選高效反義RNA體外篩選高效反義RNA體內(nèi)篩選高效反義RNA體外篩選高效反義RNA方法如前面所述體內(nèi)篩選高效反義RNA

Kazunarl

Taira描述了一種方法，構(gòu)建了兩個質(zhì)粒。把一個靶基因的ORF區(qū)融合到luciferase的前面。另一個質(zhì)粒為由可誘導(dǎo)性啟動子調(diào)控的tRNA包埋

Ribozyme,共轉(zhuǎn)染Tet-Hela細胞，檢測

luciferase的活性來篩選高效Ribozyme，可以用同樣的方法篩選高效反義RNAMaRX方法MaRX:

An

Approach

to

Genetics

inMammalian

Cells(Science

283,1129-1130,

1999)

MaRX

system,

a

specialized

strategy

to

facilitate

function-based

gisolation

in

mammalian

cells.

This

system

relies

on

two

concepts

to

overcome

impediments

to

the

use

of

genetic

methods

in

cultured

cellFirst

is

the

use

of

nucleic

acid

as

a

"virtual

mutagen"

rather

thanreliance

on

chemical

or

other

mutagens.

Second,

the

tendency

of

such

phenotypes

to

revertspontaneously

has

been

accommodated.

The

system

allowsefficient

introduction

of

cDNA

libraries

into

target

cand

allows

efficient

recovery

of

either

individual

gencomplex

sublibraries

from

cell

populations

that

have

benriched

on

the

basis

of

a

specific

biological

characteFig.

1.

The

MaRX

cycle.

A

normalized

DNA

library

is

converted

into

alibrary

of

retroviruses

by

using

a

packaging

cell

line

(linX).

Then,

thinfected

recipient

cells

are

selected

or

enriched

on

the

basis

of

a

specbiological

property.

Proviruses

are

recovered

and

used

for

virus

produand

subsequent

rounds

of

screening.Fig.

2.

Recombinase

excision

of

the

MaRX

vector.

(A)

A

representation

of

theintegrated

MaRX

provirus

and

the

consequences

of

recombinase

treatment

in

viand

in

vivo.

(B)

NIH-3T3

cells

(1)

were

infected

with

a

MaRX

virus

that

directsgalactosidase

expression

(2).

These

cells

were

then

transducted

with

a

retrothat

directs

recombinase

expression

(3).

Upon

recombinase

expression

andcontinued

passage

(4),

the

phenotype

of

these

cells

(b-galactosidase

expressrevertedMaRX在反義RNA的應(yīng)用?

用104個克隆的p53cDNA的文庫克隆到反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染p53tsp53-/-MEF，39度正常生長，32度p53變?yōu)橐吧?，?dǎo)致細胞生長停止，如果反義RNA有效，細胞會繼續(xù)生長，用這種方法篩選到19個克隆，包括14個反義RNA片段，40-140bp,對應(yīng)與p53的兩個區(qū)段。其中兩個非常有效，可以抑制正常細胞的p53.發(fā)現(xiàn)反義RNA只抑制蛋白質(zhì)的翻譯，而不促進RNA的降解。(Nucleic

Acid

Research.2000.

Vol

.

28.No.11)反義RNA的應(yīng)用抗病毒與細胞增殖相關(guān)的基因研究信號傳導(dǎo)抗病毒研究HBVHIVHPVHCV用反義RNA研究與細胞增殖相關(guān)的基因

用反義RNA研究靶基因被抑制后與細胞增殖、細胞周期的變化用反義RNA研究細胞信號傳導(dǎo)

用反義RNA抑制靶基因的表達，檢測靶基因被抑制后其它基因的表達變化，從而尋找下游基因。

用反義RNA抑制已知基因