--egcg單體的制備工藝研究

不包括未經處理的堅果茶素[（eg）]。從綠茶中提取出來的生物活性成分具有低毒性。具有抗逆性、降血脂、降膽固醇、抗癌、抗癌、抗菌、細菌和病毒等生理藥理活性?？蓮V泛應用于食品、藥物、精細化工等領域。(-)-EGCG的提純分離方法主要有sephadexLX-20柱層分離,高效液相色譜法的制備分離和高速逆流色譜分離等。這些提取分離方法工藝流程長、提取過程中使用氯仿或重金屬等有毒物質,設備投資高,分離材料昂貴,限制了其在食品、糧油、醫(yī)藥等領域的廣泛應用。本文采用聚酰胺柱層分離法制備高純度的(-)-EGCG,與所報道的提取純化工藝相比較具有工藝簡單、所用溶劑無毒無污染、安全、價廉、溶劑和聚酰胺可重復循環(huán)使用等優(yōu)點,適合工業(yè)化生產。1實驗部分1.1gan-n-o-rapod元素分析方法Waters600型高效液相色譜儀(HPLC)(美國);BRUKER(500MHz)核磁共振儀(德國),D2O作溶劑;FINNIGAN液-質聯用儀(美國);UV-1601型紫外分光光度儀(日本);VECTOR-22型紅外光譜儀(德國);WZZ-2S數字式旋光儀;ALPHAI-6型冷凍干燥機(德國);CHN-O-Rapid元素分析儀(德國)。玻璃層析柱規(guī)格1200mm×40mm;聚酰胺粒徑0.170～0.210mm;甲醇(色譜純);乙酸乙酯(分析純);乙醇(工業(yè)品),綠茶(安徽滁州市施集茶廠);實驗用水為蒸餾水。1.2綠茶中--ecgg標準線性方程的制備取(-)-EGCG標準樣用HPLC法測定濃度-峰面積標準線性方程如下:Y=5586243.3X-125577.5式中,Y為峰面積(μV·s);X為(-)-EGCG的質量濃度(mg/L);方程的線性相關系數為1.00;色譜條件:以V(CH3OH)∶V(H2O)=3∶7的混合溶劑為流動相,檢測波長為275nm,流速為1mL/min。參考文獻方法,稱取1.0g/份的經粉碎過孔徑為0.960mm篩的綠茶粉末3份,置于3個圓底燒瓶中。分別加入體積分數為50%的乙醇溶液10mL,在水浴中恒溫50℃回流提取2h,過濾。濾餅再按以上步驟重復提取2次。合并濾液,定容至50mL容量瓶中作為供試品液。用HPLC法測定峰面積,根據標準樣的濃度-峰面積標準線性方程計算綠茶中(-)-EGCG的質量分數(ω)為8.0%。在后續(xù)醇提和脫色工藝研究中,每次取提取液或脫色液總體積的1/5,分別加入體積分數為50%的乙醇,定容至50mL容量瓶中作為供試品液;在聚酰胺柱層分離工藝研究中,每次取洗脫液80mL,分別加入體積分數為50%的乙醇,定容至100mL容量瓶中作為供試品液。用HPLC法測定各供試品液的峰面積,根據標準樣的濃度-峰面積標準線性方程計算供試品液中(-)-EGCG的質量分數(ω′),按下式計算(-)-EGCG的提取率:(-)-EGCG的提取率(%)=ω′ω×100%(%)=ω′ω×100%1.3重復使用的回收將50g聚酰胺置于600mL乙醇中加熱回流2h,過濾,濾餅用蒸餾水洗3次,濾液中的乙醇回收重復使用。再向聚酰胺中加入300mL蒸餾水浸泡過夜。用脫脂棉塞住層析柱底部,將蒸餾水浸泡處理好的備用聚酰胺細粉除去氣泡后,倒入層析柱中,使聚酰胺自然沉降,放出柱內多余的蒸餾水,至水面略高于聚酰胺粉表面時關閉活塞,待用。1.4茶多酚的提取和測定稱取10g綠茶,粉碎過孔徑為0.960mm篩,用乙醇液熱提,抽濾,濾液經旋轉蒸發(fā)回收乙醇,得比重為1.03的濃縮液,加入3.6g活性炭脫色。用乙酸乙酯萃取,萃取液經旋轉蒸發(fā)回收乙酸乙酯,得茶多酚粗品。加適量蒸餾水溶解,配成質量分數為25%的水溶液加入到聚酰胺柱上。先用蒸餾水洗脫,流速為2.5mL/min,至收集液由黃色變成無色為止。換體積分數為50%的乙醇水溶液洗脫,流速為4.0mL/min,按每份50mL收集,HPLC檢測至洗脫完全。將含(-)-EGCG的流份合并,回收乙醇,濃縮液經冷凍干燥后,得0.4g(-)-EGCG的類白色粉末,提取率50%,HPLC測得(-)-EGCG含量為99%。2結果與討論2.1產品結構的性能2.1.1旋轉光的測量在與文獻相同的條件下,測定提取物的旋光度,結果與文獻值完全一致,[α]D=-148.0(c=1.0,THF)。2.1.2吸收峰和峰數提取物水溶液紫外光譜上的最大吸收波長為275nm,與文獻報道的(-)-EGCG的紫外吸收峰273.4nm一致。提取物的紅外光譜在1692cm-1處有1組較強的νC—O伸縮振動吸收峰,在1190～1240cm-1處有1組較強的νC—O—C非對稱伸縮振動吸收峰,在1450～1610cm-1處有苯環(huán)骨架特征振動吸收峰,與文獻報道一致。2.1.3以下一步發(fā)展為例,有3.提取物的質譜峰m/z:457(100%,M+-H),413(15%),357(14%),335(10%),317(10%)。(-)-EGCG分子量為458,質荷比457的基峰應是分子離子脫氫形成的,因此提取物的質譜與(-)-EGCG的結構一致。提取物按C22H18O11的元素分析值(計算值)/%:C57.55(57.65),H4.02(3.96),與(-)-EGCG的結構一致。2.1.4提取物的結構表征提取物的氫譜為:1HNMR(D2O,500MHz),δ:6.73(s,1H),6.72(s,1H),6.31(s,1H),6.30(s,1H),5.88～5.89(m,2H),5.20(d,J=2.5Hz,1H),4.52～4.54(m,1H),2.66(bs,2H)。結合ChemDrawUltra8.0軟件的預測,各峰的歸屬如Scheme1所示。苯環(huán)A和B上各有2個H,因化學環(huán)境不完全相同,化學位移略有差異(相差δ0.01)。苯環(huán)C上的2個H可能存在W偶合,出現多重峰。在δ2.66處的CH2基團出現比較寬的單峰,可能是因為分辨率不高,峰的裂分未顯示出來。對提取物進行氫譜分析所用的是500MHz核磁共振儀,溶劑是D2O;而文獻是采用400MHz核磁共振儀,溶劑是acetone-d6/D2O(2∶1)。得到的氫譜圖與文獻有區(qū)別,但通過上述分析表明,所得到的氫譜圖與(-)-EGCG的結構一致。提取物的核磁共振碳譜化學位移值如下:13CNMR(D2O,500MHz)實測值(文獻值),δ:167.1(166.4),155.5(156.6),155.4(156.0),145.1(145.5),144.4(145.2),138.2(138.5),132.1(132.4),129.9(129.9),120.5(120.5),110.0(109.4),106.8(106.1),99.3(98.1),96.2(95.8),95.5(95.0),77.3(77.4),69.3(69.5),25.1(25.9)。結果可見,與文獻(100MHz,CDCl3)基本一致。2.2影響--egcg分離純度的因素2.2.1綠茶粒度對--ecgg提取率的影響(-)-EGCG為醇溶性的兒茶素類成分,采用體積分數為95%乙醇為溶劑進行提取。選擇綠茶粒度(mm)、回流提取次數(T)、每次加入體積分數為95%乙醇用量(mL)這3個因素,每個因素選取3個水平,采用L9(34)正交試驗。綠茶均取5.0g,每次提取時間為1.0h,以(-)-EGCG的提取率為考察指標。由正交試驗得出,各因素對(-)-EGCG的提取率影響程度依次為:回流提取次數>綠茶粒度>95%的乙醇用量。同時得出,用95%乙醇提取(-)-EGCG的最佳工藝條件為:綠茶粒度0.960mm,每次加入60mL的體積分數為95%乙醇,提取3次,每次1.0h。按照優(yōu)選工藝條件重復試驗3次,所得(-)-EGCG的平均提取率為96.8%。綠茶粒度對(-)-EGCG的提取率的影響:綠茶粒度較小時,在提取的滲透階段,體積分數為95%乙醇易于滲入到綠茶顆粒內部;在擴散階段,由于其具有較大的擴散面積,較短的擴散距離,有利于(-)-EGCG的浸出。但是,如果綠茶粉碎得太細,導致大量的細胞破裂,使細胞內的一些高分子物質(如樹脂、黏液質等)易溶于浸出液中,從而使綠茶外部的溶液黏度增加,(-)-EGCG擴散系數降低,導致(-)-EGCG的提取率下降。如果綠茶的粒度過大,使綠茶顆粒的總擴散面積下降,(-)-EGCG有較長的擴散距離,也導致(-)-EGCG的提取率下降。在提取時間一定的條件下(為1.0h),回流提取次數對(-)-EGCG的提取率有顯著的影響,若提取次數過少,將會使(-)-EGCG浸出不完全。而提取次數過多,生成成本增加。在(-)-EGCG的醇提過程中,每次所用體積分數為95%乙醇的量過少,將使(-)-EGCG的擴散存在較小的濃度梯度和較小的擴散系數,從而降低(-)-EGCG的浸出;但若用量過大,將導致生成成本增加.2.2.2最佳工藝條件的確定選擇活性炭用量(g)、脫色次數(T)、脫色時間(min)3個因素,每個因素選取3個水平,采用L9(34)正交試驗。取綠茶粗粉(粒度為0.960mm)90g,用12倍量體積分數為95%的乙醇溶液在85℃回流提取3次,將3150mL合并提取液均分為9份,以(-)-EGCG提取率及脫色溶液中葉綠素A(663nm處)和葉綠素B(645nm處)吸收度作為綜合考察指標。綜合考察指標=25%Xˉˉˉ/X+25%Yˉˉˉ/Y+50%Z/Zˉˉˉ=25%Xˉ/X+25%Yˉ/Y+50%Ζ/Ζˉ。式中,X為9份脫色液中葉綠素A吸收度,XˉˉˉXˉ為其平均值;Y為9份脫色液中葉綠素B吸收度,YˉˉˉYˉ為其平均值;Z為9份脫色液中(-)-EGCG的提取率,ZˉˉˉΖˉ為其平均值。由正交試驗得出,各因素對(-)-EGCG的提取率及脫色溶液中葉綠素A和葉綠素B吸收度綜合影響程度依次為:脫色次數>活性炭用量>脫色時間。綠茶的醇提液用活性炭脫色的最佳工藝條件為:活性炭粉末3.6g,回流脫色3次,每次30min。根據優(yōu)選工藝條件重復試驗3次,所得(-)-EGCG的提取率為65.4%。脫色液中葉綠素A和葉綠素B的吸收度分別為0.0132和0.0136,綜合指標為2.2103?；钚蕴坑昧繉G茶醇提取液脫色效果有著顯著的影響,當活性炭用量較大時,對色素的吸附力增強,脫色效果亦增強;但若過大,將增加對(-)-EGCG的吸附力,導致(-)-EGCG的提取率下降。當活性炭用量較小時,對(-)-EGCG吸附力減弱,使(-)-EGCG的提取率增加;但對色素的吸附力減弱,脫色效果下降。隨著活性炭脫色次數的增加和脫色時間的延長,活性炭對色素的吸附能力增大、脫色能力增強,當加入活性炭粉末3.6g,回流脫色2次,每次30min,即有較好的脫色效果,再增加活性炭脫色次數和延長脫色時間,脫色液無明顯變化,而(-)-EGCG的提取率不斷下降。2.2.3--ecgg與雜質成分分離度的影響在(-)-EGCG的柱層分離過程中,以(-)-EGCG的提取率和洗脫液的流速作為考察指標,對聚酰胺的粒度進行了優(yōu)選,結果見表1。粒度越小,分離效果越好,但流速減慢,分離時間延長,效率下降;粒度越大,雖然流速加快,但是(-)-EGCG與雜質成分的分離度下降,影響(-)-EGCG的提取率。綜合考慮,以