第三章

工業(yè)菌種的選育及改進(jìn)

盡管生產(chǎn)菌種最初均是來自于自然界，但天然菌種的生產(chǎn)性能一般比較低下。20世紀(jì)40年代抗生素工業(yè)的興起，推動(dòng)了微生物遺傳學(xué)的快速發(fā)展，也為微生物發(fā)酵工業(yè)優(yōu)良菌種的人工選育奠定了理論基礎(chǔ)。優(yōu)良菌種的選育為生產(chǎn)提供了各種類型的突變株，大幅度提高了菌種產(chǎn)生有利用價(jià)值代謝產(chǎn)物的水平，還可以改進(jìn)產(chǎn)品質(zhì)量，去除不需要的代謝產(chǎn)物或產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物。特別是基因工程、細(xì)胞工程和蛋白質(zhì)工程等較為定向技術(shù)的發(fā)展，使菌種選育技術(shù)不斷更新，而研制出眾多有價(jià)值的微生物工程產(chǎn)品。自然選育、誘變選育、抗噬菌體菌種的選育、雜交育種、原生質(zhì)體融合技術(shù)、基因工程技術(shù)等都被應(yīng)用于生產(chǎn)菌種的選育。【Background】提高菌種生產(chǎn)力的途徑：自然突變體的篩選（自然選育）誘導(dǎo)突變體的篩選（誘變育種）雜交育種原生質(zhì)體融合基因克隆通過遺傳修飾第一節(jié)自然突變體的篩選（自然選育）

不經(jīng)人工處理，利用微生物的自發(fā)（然）突變進(jìn)行菌種選育的過程稱為自然選育(spontaneousmutation)。二、自發(fā)突變機(jī)制（一）自發(fā)突變的定義：

自發(fā)突變是指在沒有人工參與下生物體自然發(fā)生的突變。自發(fā)突變并不意味著這種突變沒有原因，而只是說明我們對它還沒有很好的或很具體的認(rèn)識而已。

一、自然選育的定義

1、

背景輻射和環(huán)境因素的誘變：不少“自發(fā)突變”實(shí)質(zhì)上是由于一些原因不詳?shù)牡蛣┝空T變因素的長期綜合誘變效應(yīng)。例如，充滿宇宙的各種短波輻射或高溫誘變效應(yīng)，以及自然界中普遍存在的一些低濃度的誘變物質(zhì)（在微環(huán)境中有時(shí)也可能是高濃度）的作用等。（二）自發(fā)突變的機(jī)制2、

微生物自身有害代謝產(chǎn)物的誘變效應(yīng)：

過氧化氫是普遍存在于微生物體內(nèi)的一種代謝產(chǎn)物。過氧化氫對脈胞菌（Neurospora）有誘變作用，這種作用可因同時(shí)加入過氧化氫酶而降低；如果在加入該酶的同時(shí)又加入酶抑制劑(KCN)，則又可提高突變率。這就說明，過氧化氫很可能是“自發(fā)突變”中的一種內(nèi)源性誘變劑。在許多微生物的陳舊培養(yǎng)物中易出現(xiàn)自發(fā)突變（劑），可能也是同樣的原因。3、

互變異構(gòu)效應(yīng)：微生物的自發(fā)突變可由于本身DNA在復(fù)制過程中發(fā)生了酮式至烯醇式（或氨基式至亞氨基式）的互變異構(gòu)效應(yīng)而引起的。因?yàn)锳、T、G、C四種堿基的第六位上如果不是酮基（T、G），就是氨基（C、A），所以有人認(rèn)為，T和G會以酮式或烯醇式兩種互變異構(gòu)的狀態(tài)出現(xiàn)，而C和A則會以氨基式或亞氨基式兩種互變異構(gòu)的狀態(tài)出現(xiàn)。圖3.1由5-BU引起的互變異構(gòu)效應(yīng)A-TA-TA-TA-TG-TG-CA-T（酮式）（烯醇式）圖3.2胸腺嘧啶（T）在以酮式或烯醇式狀態(tài)存在時(shí)引起堿基配對的變化由于平衡一般趨向酮式或氨基式，因此在DNA雙鏈結(jié)構(gòu)中一般總是以A：T和G：C堿基配對的形式出現(xiàn);在偶然情況下，T也會以稀有的烯醇式形式出現(xiàn)，因此在DNA復(fù)制到達(dá)這一位置的瞬間，通過DNA聚合酶的作用，在它的相對位置上就不再出現(xiàn)常規(guī)的A而是出現(xiàn)G；同樣，如果C以稀有的亞氨基形式出現(xiàn)在DNA復(fù)制到達(dá)這一位置的剎那間，則在新合成DNA單鏈的與C相應(yīng)的位置上就將是A，而不是往常的G。這或許就是發(fā)生相應(yīng)的自發(fā)突變的原因.必須說明的是，由于在任何一瞬間，某一堿基是處于酮式或烯醇式，還是氨基式或亞氨式狀態(tài)，目前還無法預(yù)測，所以要預(yù)言在某一時(shí)間、某一基因發(fā)生自發(fā)突變?nèi)允遣豢赡艿?。但是，人們在運(yùn)用數(shù)學(xué)方法對這些偶發(fā)事件作大量統(tǒng)計(jì)分析后，還是可以發(fā)現(xiàn)并掌握其中規(guī)律的。例如，據(jù)統(tǒng)計(jì)，DNA鏈在每次復(fù)制中，每個(gè)堿基對錯(cuò)誤配對的頻率是10-7～10-11，而一個(gè)基因平均約含1000bp，故自發(fā)突變頻率約為10-6。4、環(huán)出效應(yīng)：即環(huán)狀突出效應(yīng)

有人提出，在DNA的復(fù)制過程中，如果其中某一單鏈上偶然產(chǎn)生一小環(huán)，則會因其上的基因越過復(fù)制而發(fā)生遺傳缺失，從而造成自發(fā)突變。

圖3.3環(huán)出效應(yīng)

在上鏈中，標(biāo)記B處發(fā)生“環(huán)出”，故只有A及C能獲得復(fù)制，從而發(fā)生自發(fā)突變。而在下鏈中，則復(fù)制仍正常進(jìn)行。5、轉(zhuǎn)座效應(yīng)

轉(zhuǎn)座作用的頻率雖然僅為10-5～10-7，但它卻是一種自然界所固有的“自發(fā)基因工程”或“內(nèi)源性基因工程”。1）轉(zhuǎn)座因子（transposableelement)定義：位于染色體或質(zhì)粒上的一段能改變自身位置的DNA序列。廣泛分布于原核和真核細(xì)胞中。又稱“跳躍基因”2）轉(zhuǎn)座因子的特點(diǎn)在轉(zhuǎn)座時(shí)，通過轉(zhuǎn)座因子的復(fù)制，可將新形成的拷貝以非同源重組的方式轉(zhuǎn)移到染色體的新部位上；

都攜帶有編碼轉(zhuǎn)座酶的基因，該酶具有轉(zhuǎn)移位置的功能，是轉(zhuǎn)座所必需的;

兩端都有正向或反向末端重復(fù)序列。

(3)根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和遺傳性質(zhì)，轉(zhuǎn)座因子可分為3類：插入序列（Insertionsequence,IS）僅含有編碼轉(zhuǎn)座所必需的轉(zhuǎn)座酶的基因，兩端存在9～41bp的反向重復(fù)序列

。但其插入可干擾基因的正常讀碼序列，導(dǎo)致基因失活或引起突變。轉(zhuǎn)座子（Transposon,Tn）除轉(zhuǎn)座基因外，還有抗藥性基因。分為復(fù)合轉(zhuǎn)座子和復(fù)雜轉(zhuǎn)座子Mu噬菌體是以大腸桿菌為宿主的溫和性噬菌體。它在幾方面不同于另一種溫和噬菌體λ：第一、MuDNA幾乎可以插入到宿主染色體的任何一個(gè)位點(diǎn)上；第二、DNA兩端沒有粘性末端；第三、會引起宿主的被插入基因的基因突變。

(4)轉(zhuǎn)座的過程：由轉(zhuǎn)座因子中基因編碼的轉(zhuǎn)座酶能識別受體DNA分子中的靶序列（3-12bp），它可先把靶序列切成兩條單鏈，并使轉(zhuǎn)座因子的一條鏈與靶序列的一條鏈相連接，另一條鏈與靶序列相反一端的另一條鏈相連接。形成的單鏈缺口可經(jīng)DNA多聚酶I的作用而合成，再經(jīng)DNA連接酶的作用而縫合。于是，隨著轉(zhuǎn)座因子的插入就使靶序列得到了復(fù)制。

插入突變

(基因失活)

染色體畸變(染色體的缺失\重復(fù)和倒位)

轉(zhuǎn)座作用的頻率雖然僅為10-5～10-7，但它卻是一種自然界所固有的“自發(fā)基因工程”或“內(nèi)源性基因工程”。(5)轉(zhuǎn)座的遺傳學(xué)效應(yīng)：三、自然選育在工業(yè)生產(chǎn)上的意義1、在工業(yè)生產(chǎn)上，由于各種條件因素的影響，自然突變是經(jīng)常發(fā)生的，也造成了生產(chǎn)水平的波動(dòng)，所以技術(shù)人員很注意從高生產(chǎn)水平的批次中，分離高生產(chǎn)力的菌種再用于生產(chǎn)。2、自然變異可能會產(chǎn)生兩種截然不同的結(jié)果，一種是菌種退化而導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量或質(zhì)量下降；另一種是對生產(chǎn)有益的突變。為了保證生產(chǎn)水平的穩(wěn)定和提高，應(yīng)經(jīng)常的進(jìn)行生產(chǎn)菌種自然選育，以淘汰退化的，選出優(yōu)良的菌種。3、經(jīng)誘變或雜交選育獲得的突變株，往往會繼續(xù)發(fā)生變異，導(dǎo)致不同生產(chǎn)能力菌株的比例改變，這種情況下，自然選育可以有效地用于高性能突變株的分離。四、自然選育的特點(diǎn)自然選育是一種簡單易行的選育方法，可以達(dá)到純化菌種，防止菌種退化，穩(wěn)定生產(chǎn)，提高產(chǎn)量的目的。自然選育的效率低，因此經(jīng)常與誘變育種交叉使用，以提高育種效率。五、自然選育的方法自然選育的一般程序是將菌種制成菌懸液，用稀釋法在固定平板上分離單菌落，再分別測定單菌落的生產(chǎn)能力，從中選出高水平菌種。第二節(jié)誘導(dǎo)突變體的篩選（誘變育種）一、誘變育種在工業(yè)生產(chǎn)上的意義微生物在長期的進(jìn)化過程中，形成了一套嚴(yán)密的代謝調(diào)控機(jī)制。其自身代謝過程是被嚴(yán)格調(diào)控的，并且還存在著代謝產(chǎn)物的分解途徑，所有的代謝產(chǎn)物都不會過量積累。因此從自然環(huán)境中分離的菌種的生產(chǎn)能力有限，一般不能滿足生產(chǎn)的實(shí)際需要。誘變育種是提高菌種生產(chǎn)能力，使所需要的某一種特定的代謝產(chǎn)物過量積累的有效方法之一。二、誘變育種的原理誘變育種的理論基礎(chǔ)是基因突變，突變主要包括染色體畸變和基因突變兩大類。染色體畸變是指染色體或DNA片段發(fā)生缺失、易位、逆位、重復(fù)等。基因突變指的是DNA中的堿基發(fā)生變化即點(diǎn)突變。誘變育種就是利用各種被稱為誘變劑的物理因素和化學(xué)試劑處理微生物細(xì)胞，提高基因突變頻率，再通過適當(dāng)?shù)暮Y選方法獲得所需要的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌種的育種方法。常用的誘變劑包括物理、化學(xué)和生物的三大類。表3.1常用的各種誘變劑二、誘變育種的基本方法誘變育種一般包括誘變和篩選兩個(gè)部分，誘變部分成功的關(guān)鍵包括：

出發(fā)菌株的選擇、誘變劑種類和劑量的選擇，合理的使用方法。篩選部分包括初篩和復(fù)篩來測定菌種的生產(chǎn)能力。誘變育種是誘變和篩選過程的不斷重復(fù)，直到獲得高產(chǎn)菌株。1、出發(fā)菌株的選擇用來進(jìn)行誘變的出發(fā)菌株性能對提高誘變效果和效率十分重要，選擇出發(fā)菌株應(yīng)注意，誘變出發(fā)菌株要有一定的目標(biāo)產(chǎn)物的生產(chǎn)能力。其他生產(chǎn)性能如:生產(chǎn)繁殖快營養(yǎng)要求低產(chǎn)孢子多且早對誘變劑敏感(變異幅度大)還必須了解用作誘變的出發(fā)菌株的產(chǎn)量、形態(tài)、生理等方面的情況。可選擇已經(jīng)經(jīng)過誘變處理的菌株，因?yàn)檫@樣的菌株對誘變劑的敏感性會有所提高。2、誘變劑的使用方法在微生物誘變育種中，誘變的方法有單一誘變劑處理和復(fù)合誘變劑處理。對野生菌株單一誘變劑處理有時(shí)也能取得好的效果。對經(jīng)過多次誘變處理的老菌種，單一誘變因素重復(fù)處理效果甚微?？梢圆捎脧?fù)合誘變劑處理來提高誘變效果。

復(fù)合誘變處理包括：

同一誘變劑多次處理兩種以上誘變劑先后分別處理兩種以上誘變劑同時(shí)或多次處理例如，青霉菌的選育中先用不足以引起突變的氮芥短時(shí)處理，再用紫外線處理，可使誘變效率大大提高。3、誘變劑的劑量選擇對不同的微生物使用的劑量不同，誘變劑的劑量與致死率有關(guān)，而致死率又與誘變率有一定的關(guān)系。因此可用致死率作為誘變劑劑量選擇的依據(jù)。一般來說，誘變率隨誘變劑劑量的增加而提高，但達(dá)到一定程度以后，再提高劑量反而使誘變率下降。因此近年來已將處理劑量從過去的致死率99%--99.9%降至70%--80%，甚至更低。誘變劑劑量也不宜過低，高劑量誘變可導(dǎo)致一些細(xì)菌的細(xì)胞核發(fā)生變異，也可使另一些細(xì)胞核破壞，引起細(xì)胞死亡，形成較純的變異菌落。并且高劑量會引起細(xì)胞遺傳物質(zhì)發(fā)生難以恢復(fù)的巨大損傷，促使變異菌株穩(wěn)定，不易產(chǎn)生回復(fù)突變。三、突變菌株的篩選誘變處理后，正向突變的菌株通常為少數(shù)，須進(jìn)行大量的篩選才能獲得高產(chǎn)菌株。通過初篩和復(fù)篩后，還要經(jīng)過發(fā)酵條件的優(yōu)化研究，確定最佳的發(fā)酵條件，才能使高產(chǎn)菌株的生產(chǎn)能力充分發(fā)揮出來。經(jīng)誘變后，菌種的性能有可能發(fā)生各種各樣的變異，如營養(yǎng)變異、抗性變異、代謝變異、形態(tài)變異、生長繁殖變異和發(fā)酵溫度變異等。這些變異的菌種可用各種方法篩選出來。第三節(jié)雜交育種一、概念：雜交育種的目的是將不同菌株的遺傳物質(zhì)進(jìn)行交換、重組，使不同菌株的優(yōu)良性狀集中在重組體中，克服長期誘變引起的生活力下降等缺陷。二、意義生產(chǎn)上，長期使用誘變劑處理，會使菌種的生活能力逐漸下降，如生長周期延長，孢子數(shù)量減少，代謝速率減慢，產(chǎn)量增加緩慢，因此有必要利用雜交育種的方法，提高菌種的生產(chǎn)能力。通過雜交還可以擴(kuò)大變異范圍，改變產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，甚至創(chuàng)造出新品種。由于多數(shù)微生物（細(xì)菌、放線菌及霉菌中的半知菌等）尚未發(fā)現(xiàn)有性世代，因此直接親本菌株應(yīng)具有適當(dāng)?shù)倪z傳標(biāo)記，如顏色、營養(yǎng)要求（即營養(yǎng)缺陷標(biāo)記）或抗藥性等。三、

雜交育種應(yīng)用（一）真核微生物的有性雜交1、定義：不同遺傳型兩性細(xì)胞間發(fā)生的接合和隨之進(jìn)行的染色體重組，進(jìn)而產(chǎn)生新遺傳型后代的一種育種技術(shù)。凡能產(chǎn)有性孢子的酵母菌、霉菌，原則上都能應(yīng)用與高等動(dòng)、植物雜交育種相似的有性雜交方法進(jìn)行育種。在真核微生物中，有的能產(chǎn)生單倍體的有性孢子，這類微生物和高等植物一樣，能進(jìn)行有性雜交，通過減數(shù)分裂細(xì)胞中的染色體變換和隨機(jī)分配而導(dǎo)致基因重組。2、釀酒酵母的有性雜交育種程序：

兩親本菌株的選擇單倍體細(xì)胞的分離與驗(yàn)證單倍體細(xì)胞遺傳標(biāo)記的制作雜交雜合子的檢出優(yōu)良性狀個(gè)體的篩選與性能測試[過程]以Sac.cerevisiae為例：從自然界分離到的或在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用的酵母，一般都是其“2n”細(xì)胞。將不同性狀的A、B兩個(gè)親本（2n）分別接種到產(chǎn)孢子培養(yǎng)基（如CH3COONa培養(yǎng)基）斜面上，使其產(chǎn)生子囊，經(jīng)減數(shù)分裂后，在每個(gè)子囊內(nèi)會產(chǎn)生四個(gè)單倍體的子囊孢子。用蒸餾水洗下子囊，經(jīng)酶法（如蝸牛酶）破碎子囊，再經(jīng)離心后用獲得的子囊孢子涂布平板，就可以得到單倍體培養(yǎng)物。把兩個(gè)親本的不同性別（“+”及“-”）的單倍體細(xì)胞密集在一起就有更多機(jī)會出現(xiàn)種種雙倍體的雜交后代。它們的雙倍體細(xì)胞和單倍體細(xì)胞有很大不同，易識別。表3.2Sac.cerevisiae的雙倍體和單倍體細(xì)胞間的區(qū)別

雙倍體單倍體細(xì)胞大、橢圓形小、球形菌落大、形態(tài)均一小、形態(tài)多變液體培養(yǎng)繁殖較快，細(xì)胞較分散繁殖較慢，細(xì)胞聚集成團(tuán)在產(chǎn)孢子培養(yǎng)基上形成子囊不形成子囊3、有性雜交應(yīng)用（二）細(xì)菌的雜交育種細(xì)菌的雜交可以通過細(xì)菌的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合、以及相關(guān)F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)、R因子轉(zhuǎn)移等方法促使基因重組。在這些基因重組的過程中，并不涉及整個(gè)染色體組，所形成的都是部分合子。在細(xì)菌接合中，將帶有兩個(gè)以上不同選擇性遺傳標(biāo)記的兩個(gè)菌株進(jìn)行雜交，如A+B-和A-B+，雜交中會出現(xiàn)A+B-、A-B+、A+B+和A-B-這四種重組類型，為了獲得原養(yǎng)型A+B+，采用了排斥親本A+B-和A-B+，以及另一重組類型A-B-，只允許原養(yǎng)型A+B+生長的培養(yǎng)條件，將雜交菌株篩選出來。一、概念。通過人為的方法，使遺傳性狀不同的兩個(gè)細(xì)胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并進(jìn)而發(fā)生遺傳重組以產(chǎn)生同時(shí)帶有雙親性狀的、遺傳性穩(wěn)定的融合子（Fusant）的過程，稱原生質(zhì)體融合（protoplastfusion）。融合是繼轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合之后發(fā)展出來的一種更有效地轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)的手段。第四節(jié)原生質(zhì)體融合技術(shù)對微生物育種來說，有性重組的局限性很大，這是因?yàn)槠癜l(fā)現(xiàn)有雜交現(xiàn)象的微生物并不多，這就妨礙了基因重組在微生物育種中的應(yīng)用。原生質(zhì)體融合技術(shù)提供了充分利用遺傳重組雜交的方法。原生質(zhì)體融合技術(shù)首先是在動(dòng)植物細(xì)胞融合研究的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，然后才應(yīng)用于真菌、細(xì)菌和放線菌。由于這一技術(shù)可以打破種屬間的界限，提高重組頻率，擴(kuò)大重組幅度，而倍受關(guān)注。二、

意義：

1、是當(dāng)前重要的育種手段之一（除基因克隆之外）細(xì)胞原生質(zhì)體融合促使育種工作發(fā)生了四個(gè)改變：低效→高效；

隨機(jī)→定向；

不自覺→自覺；近緣雜交→遠(yuǎn)緣雜交。原生質(zhì)體融合的重組頻率目前最高可以達(dá)10-1以上，而誘變育種僅能達(dá)10-6。

2、為遠(yuǎn)緣雜交提供了一個(gè)重要手段（或途徑）細(xì)胞融合現(xiàn)已越過種、屬間，發(fā)展到科間或者更遠(yuǎn)緣的微生物和高等生物間，可以獲得更優(yōu)良的新物種三、

融合的范圍（或?qū)ο螅┰宋⑸镎婧宋⑸锔叩葎?dòng)、植物及人體的不同細(xì)胞四、

細(xì)胞融合技術(shù)和方法的歷史回顧其發(fā)展經(jīng)歷了三個(gè)階段：1、仙臺病毒（上世紀(jì)５０～６０年代）：自1955年Okada發(fā)現(xiàn)紫外滅活的仙臺病毒可以誘導(dǎo)細(xì)胞融合以來，細(xì)胞融合技術(shù)得到了迅速的發(fā)展與應(yīng)用。由于滅活的仙臺病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合存在著以下問題:制備困難；細(xì)胞融合率差別極大所以從１９７５年起聚乙醇（ＰＥＧ）逐漸代替了仙臺病毒進(jìn)行細(xì)胞融合。

2、ＰＥＧ（上世紀(jì)７０年代）：１９７４年起，英國的Peberdy研究組在微生物方面（尤其是真菌方面）做了大量理論研究和應(yīng)用實(shí)踐，證明ＰＥＧ誘導(dǎo)真菌細(xì)胞雜交具有簡便、快速和效率高等優(yōu)點(diǎn)?！締栴}】其一，ＰＥＧ誘導(dǎo)細(xì)胞融合的有效濃度是在一非常窄的范圍內(nèi)，最適濃度是在５０－５５％，此時(shí)對細(xì)胞毒性很大。其二，ＰＥＧ誘導(dǎo)懸浮細(xì)胞融合效率要遠(yuǎn)低于誘導(dǎo)單層培養(yǎng)時(shí)同樣細(xì)胞的融合率。其三，ＰＥＧ誘導(dǎo)產(chǎn)生雜交細(xì)胞的頻率仍在１×10-5這一很低水平。其四，不能在顯微鏡下觀察細(xì)胞的融合過程。

3、電融合（上世紀(jì)80年代）：

70年代末和80年代初以Zimmermann和Neumann等人率先采用了一種新的方法進(jìn)行融合研究，稱作“電融合技術(shù)（electrofusionmethod）”。

80年代初，Zinmermann利用非均勻的高壓電脈沖（變壓電場）處理酵母菌，核配頻率為5×10-3，質(zhì)配頻率為10-2。至80年代末期，電融合技術(shù)一般采用均一的高壓脈沖（低電流）作用于細(xì)胞懸液，并且細(xì)胞懸液不直接和兩極接觸（例如美國BAEKON-2000，德國eppendorf產(chǎn)品）。圖3.4細(xì)胞融合儀（左）及細(xì)胞融合模擬圖（右）【電融合在育種上的優(yōu)點(diǎn)】1）誘導(dǎo)產(chǎn)生雜交細(xì)胞的頻率是PEG的100倍，為1×10-3；2）操作簡便、快速；3）系物理刺激，不具有細(xì)胞毒性發(fā)生問題；4）可用顯微鏡觀察融合過程。五、

融合方法與步驟：1、遺傳標(biāo)記的選擇（選擇營養(yǎng)缺陷型或抗藥性標(biāo)記）2、制備原生質(zhì)體（需摸索的參數(shù)：酶的種類、酶源、酶濃、菌齡、滲透壓穩(wěn)定劑等因素均會影響原生質(zhì)體制備的效果）3、

融合：PEG（PEG分子量、濃度、作用時(shí)間）電融合（脈沖電壓/電流、兩極間距、作用時(shí)間）4、融合子再生培養(yǎng)（CM上再生。需摸索再生培養(yǎng)基的種類組成、再生時(shí)間和條件）5、融合子檢出（在MM上采用影印接種法檢出或采用其他選擇條件，如抗藥性或改變培養(yǎng)溫度），6、篩選出優(yōu)良性狀的融合子（檢測融合子的酶活或代謝物的表達(dá)）。圖3.5原生質(zhì)體融合的操作示意圖圖3.6用影印平板法檢出營養(yǎng)缺陷型突變株六、原生質(zhì)體融合的優(yōu)越性1、無供體和受體之分：受結(jié)合型或致育型的限制小，兩親體沒有供體和受體之分，有利于不同種屬微生物的雜交。2、重組頻率相對高：重組頻率高于其他雜交方法。有報(bào)道，放線菌原生質(zhì)體融合頻率達(dá)10-2--10-1，絲狀真菌達(dá)10-3--10-2，細(xì)菌和酵母也可達(dá)10-6--10-5.3、遺傳物質(zhì)傳遞充分與完善：遺傳物質(zhì)的傳遞更加充分、完善，既有核配又有質(zhì)配。原核微生物可以有兩個(gè)以上完整基因組融合的機(jī)會。放線菌還能形成短暫的或擬雙倍體，真菌中也能形成暫時(shí)的或穩(wěn)定的雙倍體。4、可鈍化菌株提高篩選效率：可以采用溫度、藥物、紫外線等處理鈍化親株的一方或雙方，然后使其融合，篩選再生重組子菌落，提高篩選效率。七、原生質(zhì)體融合的問題討論1、融合效果的認(rèn)可和確認(rèn)（即發(fā)表論文的要求）：必須做遺傳分析，首先檢測倍數(shù)是否加倍，要求測融合后的細(xì)胞體積及重量、DNA含量是否加倍；其次檢測DNA上是否有基因結(jié)構(gòu)和數(shù)量上的改變。2、有關(guān)融合效果保持的方法與技巧：鑒于融合二倍體存在著穩(wěn)定性的問題（即有分離的風(fēng)險(xiǎn)），可利用單倍體化試劑（如秋水仙素）促進(jìn)融合子單倍體化，使特定的優(yōu)良性狀長期保存。3、減少了篩選工作量的方法與技巧：利用加熱、UV處理滅活等手段，殺死一方標(biāo)記的原生質(zhì)體而進(jìn)行融合，有利于融合后的菌種篩選，減少工作量。4、遺傳標(biāo)記的獲得問題：如沒有合適的遺傳標(biāo)記菌株，則要采用生物技術(shù)的若干方法制備標(biāo)記菌株，如篩選抗藥性菌株，或人工誘變營養(yǎng)缺陷型菌株。八、原生質(zhì)體融合技術(shù)在微生物育種中的應(yīng)用由于目前應(yīng)用于生產(chǎn)的菌種，大多數(shù)是經(jīng)過反復(fù)誘變處理獲得的，對許多誘變劑已經(jīng)不敏感，效果也不明顯。采用原生質(zhì)體融合技術(shù)，獲得了不少有工業(yè)利用價(jià)值的菌株。1、用于選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株應(yīng)用（1）釀酒酵母可以利用葡萄糖生產(chǎn)酒精，但不能利用淀粉和糊精，糖化酵母能利用淀粉和糊精，將這兩個(gè)菌株進(jìn)行原生質(zhì)體融合，可得到利用淀粉和糊精直接產(chǎn)生酒精的融合子應(yīng)用（2)產(chǎn)生蛋白酶的地衣芽孢桿菌對噬菌體敏感，很容易被噬菌體感染，將產(chǎn)蛋白酶對噬菌體敏感的菌株與抗噬菌體菌株進(jìn)行融合，獲得了抗噬菌體的高產(chǎn)蛋白酶菌株。2、產(chǎn)生新的產(chǎn)物有效的種間原生質(zhì)體融合，有可能發(fā)生不同菌種的調(diào)節(jié)基因和結(jié)構(gòu)基因的重組，誘發(fā)原處于抑制狀態(tài)的沉默基因的表達(dá)。特別是在抗生素產(chǎn)生菌中可以產(chǎn)生新的雜種抗生素。例如，慶豐霉素產(chǎn)生菌和井岡霉素產(chǎn)生菌的原生質(zhì)體種間融合，得到的重組子中有的產(chǎn)生聚醚類抗生素，有的產(chǎn)生環(huán)狀多肽類新的抗生素。第五節(jié)基因克?。ɑ蚬こ碳夹g(shù)）一、概念：將外源DNA通過體外重組后，導(dǎo)入受體細(xì)胞，使其在受體細(xì)胞中復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)的技術(shù)稱為基因工程或DNA體外重組技術(shù)。這項(xiàng)在微生物遺傳學(xué)和分子生物學(xué)基礎(chǔ)理論上發(fā)展起來的新興技術(shù)，不僅是生命科學(xué)研究發(fā)展的里程碑，也使現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)生了革命性的變化。二、發(fā)展歷史1974年，波依耳（Boyer,USA）和科恩（Cohen）首次在實(shí)驗(yàn)室中實(shí)現(xiàn)了基因轉(zhuǎn)移（genetransform），為基因工程（geneengineering）開啟了通向現(xiàn)實(shí)的大門，從而使人有可能在實(shí)驗(yàn)室中組建按人們意志設(shè)計(jì)出來的新生命體。這樣我們就可以通過這些重組體的培養(yǎng)而“借腹懷胎”地獲得所需要的目標(biāo)產(chǎn)品。此后，利用微生物細(xì)胞表達(dá)和生產(chǎn)了許多重組基因產(chǎn)物，包括受體細(xì)胞自身原有的和原來不能產(chǎn)生的各種物質(zhì)。例如許多在疾病診斷、預(yù)防和治療中有重要價(jià)值的內(nèi)源生理活性物質(zhì)作為藥物已應(yīng)用了多年，像治療糖尿病的胰島素，治療侏儒癥的人生長激素、細(xì)胞因子、神經(jīng)多肽、調(diào)節(jié)蛋白、酶類、凝血因子以及某些疫苗等。由于上述藥物在傳統(tǒng)制藥工業(yè)制造過程中或是材料來源困難，或是制造技術(shù)問題，或是造價(jià)過于昂貴，而無法大量生產(chǎn)并在臨床上廣泛付諸應(yīng)用。然而利用微生物生長繁殖迅速，人工培養(yǎng)方便等特點(diǎn)，將重組基因?qū)胛⑸锛?xì)胞來生產(chǎn)這些生理活性物質(zhì)，從根本上解決了上述問題。1982年第一個(gè)基因工程產(chǎn)品---人胰島素在美國問世，吸引和鼓勵(lì)了大批科學(xué)家投身這一領(lǐng)域的研究和開發(fā)，獲得了大批的成果，也產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。三、基因工程的基本操作步驟目的基因的取得（即外源基因或供體基因）載體系統(tǒng)的選擇目的基因與載體基因的構(gòu)建重組載體導(dǎo)入受體細(xì)胞“工程菌”的表達(dá)、篩選及鑒定工程菌生產(chǎn)性試驗(yàn)及大規(guī)模生產(chǎn)圖3.7將目的基因克隆到大腸桿菌細(xì)胞中的操作步驟（一）目的基因的取得取得具有生產(chǎn)意義的目的基因主要有3條途徑：從適當(dāng)?shù)墓w生物包括微生物、動(dòng)物或植物中提?。煌ㄟ^逆轉(zhuǎn)錄酶的作用，由mRNA合成cDNA（complementaryDNA，即互補(bǔ)DNA）；由化學(xué)合成方法合成有特定功能的目的基因（二）優(yōu)良載體的選擇基因工程使用的載體分為克隆載體和表達(dá)載體。無論原核基因還是真核基因要在大腸桿菌中復(fù)制和表達(dá)，都必須將其與合適的表達(dá)載體連接后導(dǎo)入宿主細(xì)菌，才能表達(dá)成蛋白質(zhì)。1、克隆載體

優(yōu)良的克隆載體必須具備的條件：1）是一個(gè)具自我復(fù)制能力的復(fù)制子（replicon）；2）能在受體細(xì)胞內(nèi)大量增殖；3）載體上最好只有一個(gè)限制性內(nèi)切核酸酶的切口，使目的基因能固定地整合到載體DNA的一定位置上；4)其上必須有一種選擇性遺傳標(biāo)記，以便及時(shí)高效地選擇出工程菌。2、表達(dá)載體

表達(dá)載體必須具備以下條件：1）應(yīng)具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子，能被大腸桿菌的RNA聚合酶識別。

【啟動(dòng)子是指在一條DNA鏈內(nèi)，在轉(zhuǎn)錄起始期間可以被RNA聚合酶識別并結(jié)合的一段DNA序列。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)通常在啟動(dòng)子序列內(nèi)?！?）應(yīng)具有使啟動(dòng)子受到抑制的阻遏子，只有在受到誘導(dǎo)時(shí)才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。因外源基因的高效表達(dá)往往會抑制宿主細(xì)胞的生長、增值，而阻遏子可使宿主細(xì)胞免除此不良影響。例如可先使宿主細(xì)胞快速生長增值到相當(dāng)量，再通過瞬時(shí)消除阻遏，使所表達(dá)的蛋白質(zhì)在短時(shí)間內(nèi)大量積累，同時(shí)也可減少表達(dá)產(chǎn)物的降解。阻遏子的阻遏作用可以由物理（如溫度）、化學(xué)（如IPTG、IAA等）因素進(jìn)行調(diào)節(jié)，這樣可人為地選擇啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄mRNA的時(shí)機(jī)。3）所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號，即起始密碼AUG和SD序列（核糖體結(jié)合序列）。4）應(yīng)具有很強(qiáng)的終止子，以便使RNA聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因，而不轉(zhuǎn)錄其他無關(guān)的基因。同時(shí)強(qiáng)終止子所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定。誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，由于強(qiáng)啟動(dòng)子所致的高水平轉(zhuǎn)錄反過來會影響質(zhì)粒DNA自身的復(fù)制，從而引起質(zhì)粒的不穩(wěn)定或脫質(zhì)?，F(xiàn)象。因此在外源基因的下游安置強(qiáng)終止子可以克服由質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄引起的質(zhì)粒不穩(wěn)定?！窘K止子：位于操縱子或基因編碼區(qū)末端的一段DNA序列，在原核生物中，在轉(zhuǎn)錄部分末端的終止子常有一個(gè)反向重復(fù)序列和緊接著一小段U?！?、載體的常見類型根據(jù)受體細(xì)胞不同，目前具備上述條件的載體有如下：

1）原核受體細(xì)胞入噬菌體松弛型細(xì)菌質(zhì)粒(E.colipBR322)

2)真核受體細(xì)胞在酵母方面，主要是2μ質(zhì)粒，在植物方面，主要是Ti質(zhì)粒，在動(dòng)物方面，主要有SV40病毒。（注：SV40病毒：猿猴病毒，為多瘤病毒屬的病毒，誘發(fā)成纖維瘤）

圖3.8典型克隆載體—E.coli的pBR322質(zhì)粒的構(gòu)造圖3.9Ti質(zhì)粒引發(fā)煙桿瘤的形成（三）目的基因與載體DNA的體外重組采用限制性核酸內(nèi)切酶的處理或人為地在DNA的3’端上接上polyA和polyT，就可使參與重組的兩個(gè)DNA分子產(chǎn)生“準(zhǔn)頭”和“卯眼”似的互補(bǔ)粘性末端。然后把兩者放在5-6℃下溫和地退火。由于每一種限制性核酸內(nèi)切酶所切斷的雙鏈DNA片段的粘性末端都有相同的核苷酸組分，所以當(dāng)兩者相混時(shí)，在外加連接酶的作用下，目的基因就與載體DNA進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，形成一個(gè)完整的、有復(fù)制能力的環(huán)狀重組載體或嵌合體。（四）重組載體導(dǎo)入受體細(xì)胞上述由體外操縱手續(xù)構(gòu)建的重組載體，只有將它導(dǎo)入受體細(xì)胞中，才能使其中的目的基因獲得擴(kuò)增和表達(dá)。受體細(xì)胞種類極多，最初以原核生物為主，如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌，后來發(fā)展到真核微生物如釀酒酵母以及各種高等動(dòng)植物的細(xì)胞株、組織。目前正在向各種大生物擴(kuò)展，如轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因植物等。（五）重組受體細(xì)胞表達(dá)、篩選和鑒定

對工業(yè)生產(chǎn)有重要意義的基因克隆反映在以下幾方面：基因的表達(dá)產(chǎn)量表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性產(chǎn)物的生物活性產(chǎn)物的分離純化因此進(jìn)行基因表達(dá)設(shè)計(jì)時(shí)，必須考慮各種影響因素，選擇最佳的基因表達(dá)系統(tǒng)。1、基因表達(dá)系統(tǒng)從育種的角度考慮，最為重要的是目的基因的高效表達(dá)。因?yàn)槟康幕虮徊迦肽撤N載體中，并不意味著這個(gè)基因就會表達(dá)或能高效表達(dá)。因此選擇一個(gè)適宜的表達(dá)系統(tǒng)，才能保證表達(dá)產(chǎn)物能夠高產(chǎn)并且具有功能?；虻谋磉_(dá)系統(tǒng)分兩大類：

*原核生物表達(dá)系統(tǒng)，目前常用的有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌等；*真核生物表達(dá)系統(tǒng)，有酵母、絲狀真菌等。1）原核表達(dá)系統(tǒng)如果能夠采取適當(dāng)?shù)幕虿僮骷夹g(shù)，原核基因和許多真核基因都能夠在原核生物中獲得表達(dá)。對于需要轉(zhuǎn)錄或翻譯后加工處理的真核基因，則不能用原核表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)。這是因?yàn)樵思?xì)胞缺乏像真核細(xì)胞那樣的轉(zhuǎn)錄和翻譯后加工系統(tǒng)：不能切除mRNA的內(nèi)含子不能對氨基酸進(jìn)行修飾不能進(jìn)行蛋白質(zhì)的糖基化【內(nèi)含子概念】真核生物的基因與原核生物的基因有許多不同。最明顯的是它們一般無操作子結(jié)構(gòu)，存在著大量不編碼序列和重復(fù)序列。轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)譯在細(xì)胞中有空間分隔，以及基因被許多無編碼功能的內(nèi)含子（intron）阻隔，從而使編碼序列變成不連續(xù)的外顯子（exon）狀態(tài)。大多數(shù)真核結(jié)構(gòu)基因中的間插序列（interveningsequence）或不編碼序列。它們可以轉(zhuǎn)錄，但在基因轉(zhuǎn)錄后，由這些間插序列轉(zhuǎn)錄的部分（也可用內(nèi)含子這個(gè)術(shù)語表示）經(jīng)加工被從初級轉(zhuǎn)錄本中準(zhǔn)確除去，才產(chǎn)生有功能的RNA。

基因的編碼部分稱外顯子。內(nèi)含子常比外顯子長，且占基因的更大比例。真核基因所含內(nèi)含子的數(shù)目、位置和長度不盡相同，如雞卵清蛋白基因的外顯子被7個(gè)內(nèi)含子隔開，雞卵伴清蛋白基因有17個(gè)內(nèi)含子，α-珠蛋白基因有2個(gè)內(nèi)含子，卵粘蛋白基因有6個(gè)內(nèi)含子等。需注意的是，在古細(xì)菌中也有內(nèi)含子。A、大腸桿菌由于大腸桿菌生產(chǎn)繁殖迅速，對其分子遺傳學(xué)的研究比較深入，所以目前它仍是基因工程中最常用的原核表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌因本身的特點(diǎn)，其基因工程表達(dá)產(chǎn)物的形式多種多樣:

細(xì)胞內(nèi)不溶性表達(dá)（包含體）胞內(nèi)可溶性表達(dá)細(xì)胞周質(zhì)表達(dá)可分泌到細(xì)胞外表達(dá)(極少數(shù)情況下)不同的表達(dá)形式具有不同的表達(dá)水平，也會帶來不同的雜質(zhì)。在大腸桿菌中的表達(dá)不存在翻譯后修飾作用在大腸桿菌中的表達(dá)不存在信號肽，故其產(chǎn)物多為胞內(nèi)產(chǎn)物，不能分泌至胞外。產(chǎn)物純化須破碎細(xì)胞，而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)其他蛋白質(zhì)也一起釋放出來，造成分離純化的困難。由于分泌能力不足，真核蛋白質(zhì)常形成不溶性包含體，必須經(jīng)過變性和復(fù)性處理才能恢復(fù)生物活性?！拘盘栯亩x：蛋白質(zhì)在合成的時(shí)候在N-末端融合有一段氨基酸殘基即為信號肽或信號序列或引導(dǎo)序列，它以前體（前蛋白）形式存在。信號肽對蛋白質(zhì)的跨膜和轉(zhuǎn)運(yùn)是必須的，但在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中一般被切除】但現(xiàn)已找到了一個(gè)解決的方法，如在堿性青霉素酶（penicillinase）的研究中，嗜堿芽孢桿菌sp.no.170的這個(gè)基因在大腸桿菌克隆后，胞內(nèi)外來目的基因表達(dá)產(chǎn)物可以分泌在培養(yǎng)基中。同時(shí)大腸桿菌中的原生質(zhì)蛋白質(zhì)也可分泌出來。這是由于嗜堿菌DNA的插入，激活了pMB9中的kil基因。kil基因是相應(yīng)于細(xì)胞水解中大腸桿菌素E1的釋放，但由于它缺乏啟動(dòng)子，在pMB9中并不表達(dá)。這種解決方法已被用于木聚糖酶、纖維素酶、人類生長激素和人類Fc蛋白的胞外生產(chǎn)。大約總產(chǎn)量的60%-70%可被分泌出來。補(bǔ)充相關(guān)概念：【pMB9：一種多拷貝質(zhì)粒，攜帶編碼大腸桿菌素E1、大腸桿菌相關(guān)免疫蛋白和EcoRI限制性內(nèi)切酶等的基因】【大腸桿菌素E1:在敏感細(xì)胞內(nèi)，EcolE1造成小孔，與胞內(nèi)產(chǎn)物釋放到胞外相關(guān)】B、鏈霉菌鏈霉菌是重要的工業(yè)微生物，作為外源基因表達(dá)系統(tǒng)有以下特點(diǎn)：不致病、使用安全分泌能力強(qiáng)，可將表達(dá)產(chǎn)物分泌到胞外具有糖基化能力例如，變鉛青鏈霉菌限制能力弱，是一個(gè)理想的受體菌。并且現(xiàn)在已構(gòu)建了一系列有效的載體，培養(yǎng)工藝也比較成熟。2)真核表達(dá)系統(tǒng)在細(xì)菌中表達(dá)真核基因產(chǎn)物，往往會因?yàn)榉g后加工過程的缺陷，導(dǎo)致產(chǎn)物失去原有的生物活性。為此人們構(gòu)建了真核表達(dá)系統(tǒng)，用于生產(chǎn)真核蛋白質(zhì)。在真核表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)的蛋白質(zhì)，就會與天然蛋白質(zhì)具有一致的生理生化和生物學(xué)功能。A、酵母酵母菌是研究基因表達(dá)調(diào)控最有效的單細(xì)胞真核微生物：基因組較小，僅為大腸桿菌的4倍世代周期短，酵母菌生長繁殖迅速，容易培育有單倍體、雙倍體兩種形式不產(chǎn)生有毒物質(zhì)基因工程操作方便（與原核生物相似）表達(dá)產(chǎn)物能正確進(jìn)行翻譯后加工（包括糖基化和肽剪切）能夠?qū)⒈磉_(dá)產(chǎn)物直接分泌至胞外在細(xì)菌系統(tǒng)中表達(dá)不良的真核基因，均能在酵母中良好表達(dá)

鑒于上述原因，酵母菌被認(rèn)為是表達(dá)外源蛋白質(zhì)，特別是真核生物蛋白質(zhì)的最適表達(dá)系統(tǒng)。在各種酵母中，以釀酒酵母的研究和應(yīng)用最為廣泛，目前已有不少真核基因在酵母中成功地表達(dá)，如干擾素、乙肝表面抗原基因等。B、絲狀真菌絲狀真菌也是重要的工業(yè)菌株，近年來已在30多種真菌中建立了DNA轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。其特點(diǎn)是：有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)分泌能力，能正確進(jìn)行翻譯后加工，包括肽剪切和糖基化等。糖基化方式與高等真核生物相似。絲狀真菌（如曲霉等）又確認(rèn)是安全菌株，并有成熟的發(fā)酵和后加工工藝。綜上所述，雖然各種微生物從理論上講，都可以用于基因的表達(dá)，但由于克隆載體DNA導(dǎo)入方法以及遺傳背景等方面的限制，所以目前最廣泛使用的宿主菌仍是大腸桿菌和釀酒酵母。2、影響目的基因在工程菌中表達(dá)的因素1）影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素外源基因的表達(dá)產(chǎn)量與細(xì)胞濃度和每一個(gè)細(xì)胞平均表達(dá)產(chǎn)量是正相關(guān)的，要想獲得最高產(chǎn)量，必須了解影響這兩者的各種因素，如外源基