第十五章免疫學應用

Immuneapplications授課人：葉麗林

職稱：教授TEL:62871922E-mail:yelilinlcmv@163.com基礎部全軍免疫學研究所教學目標了解：免疫學診斷的原理、常用的免疫功能檢測指標免疫治療制劑的類型和作用機制理解：抗原-抗體結合反應的特點及影響因素

免疫細胞的檢測方法及原理免疫分子的檢測方法及原理以抗體、細胞和細胞因子為基礎的免疫治療掌握：基于抗原–抗體反應的檢測方法及其原理人工（自然）主動免疫的概念人工（自然）被動免疫的概念教學重點與難點：重點：基于抗原–抗體反應的檢測方法人工（自然）主動免疫的概念人工（自然）被動免疫的概念難點：抗原-抗體結合反應的特點及影響因素免疫分子的檢測原理

教學對象：臨床醫(yī)學五年制本科使用教材：《醫(yī)學免疫學》（第二版），龔非力主編，

科學出版社，2007年。參考教材：《醫(yī)學免疫學》（第五版），金伯泉主編，

人民衛(wèi)生出版社，2008年；

《基礎免疫學》，W.E.保羅編著，吳玉章等譯，

科學出版社，2003年。推薦網站：免疫教研室網絡教學:1/mta/personalpage.htm；

中國免疫學信息網：/“三基”問題導入式教學法教學設計理念作用機制前沿熱點臨床案例乙肝三對檢查及其臨床意義主要內容基于抗原-抗體反應的檢測方法免疫細胞的檢測免疫分子的檢測免疫學診斷與監(jiān)測免疫學預防第一節(jié)基于抗原-抗體反應的檢測方法

抗原抗體反應:

指抗原與相應抗體之間所發(fā)生的特異性結合反應

物質基礎:

抗原表位與抗體高變區(qū)間的互補結合抗原表位與抗體高變區(qū)的溝槽分子表面的結合抗原抗體之間的結合力

一、抗原抗體反應的原理靜電引力（electrostaticforces）范德華引力:作用最?。╲anderWaalsinteractions）氫鍵:最具特異性（hydrogenbond）疏水作用力:作用最大（hydrophobicinteractions）

抗原抗體結合力示意圖1、抗原抗體結合力抗體分子上一個抗原結合點與對應的抗原決定簇之間相適應而存在著的引力，是抗原抗體間固有的結合力親和力(affinity)抗原抗體親和力示意圖2、抗原抗體的親和力和親合力抗體結合部位與抗原表位之間結合的強度親合力(avidity)抗原抗體親合力示意圖二、抗原抗體反應的特點特異性可逆性比例性階段性難點內容特異性：抗原與抗體結合反應的專一性抗原抗體反應特異性示意圖分子基礎:抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間空間構型的互補性1、特異性兩種不同的抗原分子具有部分相同或類似結構的抗原表位，可與彼此相應的抗血清發(fā)生反應交叉反應（crossreactions）抗原抗體交叉反應示意圖2、可逆性抗原與相應抗體結合成復合物后，在一定條件下又可解離為游離抗原與抗體的特性影響因素：

抗體對相應抗原的親合力－親合力越高，結合越牢固，越不易解離環(huán)境因素對復合物的影響－pH、離子強度

前帶(prezone)：抗體過量后帶(postzone)：抗原過量等帶(equivalencezone)：

抗原抗體比例合適

抗原抗體反應比例性示意圖抗原與抗體發(fā)生可見反應需遵循一定的量比關系3、比例性第一階段：特異性結合階段，反應快，不可見第二階段：反應可見階段，反應慢，出現(xiàn)凝集、沉淀和細胞溶解等現(xiàn)象4、階段性三、影響抗原抗體反應的因素1、反應物自身因素抗原:理化性狀、表位種類和數(shù)目抗體:來源、特異性、親和性、效價難點內容PH和Na+濃度曲線2、環(huán)境因素電解質:生理鹽水或緩沖液酸堿度:pH6～pH9溫度:15℃～40℃，37℃最適四、基于抗原抗體反應的檢測方法根據(jù)抗原與抗體特異性結合反應的特性，用肉眼觀察或借助儀器檢測抗原抗體反應的結果，由此對樣品中的抗原或抗體進行定性、定量或定位分析★免疫學檢測技術的核心基礎重點內容反應類型實驗技術結果判斷凝集反應直接凝集試驗觀察凝集現(xiàn)象間接凝集試驗同上抗球蛋白試驗同上沉淀反應液相沉淀試驗觀察沉淀，檢測濁度免疫電泳技術觀察掃描沉淀峰、沉淀弧補體參與的反應補體溶血試驗觀察測定溶血現(xiàn)象補體結合試驗同上反應類型實驗技術結果判斷中和反應病毒中和試驗檢測病毒感染性毒素中和試驗檢測外毒素毒性標記免疫反應熒光免疫技術檢測熒光現(xiàn)象放射免疫技術檢測放射性強度酶免疫技術檢測酶底物顯色發(fā)光免疫技術檢測發(fā)光強度金免疫技術檢測金顆粒沉淀

細菌、紅細胞等顆粒性抗原與相應抗體結合后，在一定條件下出現(xiàn)肉眼可見的凝集物。直接凝集間接凝集間接凝集抑制試驗1、凝集反應（Agglutination）細菌或紅細胞與相應抗體直接反應，可出現(xiàn)細菌或紅細胞凝集現(xiàn)象。直接凝集反應產生的抗原抗體復合物（1）直接凝集AutoimmuneHemolyticAnemia

直接凝集反應示意圖（2）間接凝集

將可溶性抗原或抗體包被在與免疫無關的載體顆粒表面，再與相應抗體或抗原進行特異性反應，出現(xiàn)顆粒物凝集反應。間接凝集反應產生的抗原抗體復合物：（3）間接凝集抑制試驗：將待測抗原（或抗體）與特異性抗體（或抗原）先行混合，再加入相應致敏載體懸液，若待測抗原抗體反應，則隨后加入的相應致敏載體顆粒不再被凝集。2、沉淀反應(precipitation)

可溶性抗原與相應抗體結合后，在一定條件下出現(xiàn)肉眼可見的沉淀，稱為沉淀反應。該反應多用半固體瓊脂凝膠作為介質進行瓊脂擴散或免疫擴散，即可溶性抗原與抗體在凝膠中擴散，在比例合適處相遇即形成可見的白色沉淀。（1）單向免疫擴散(singleimmunodiffusion)（2）雙向免疫擴散(doubleimmunodiffusion)雙向免疫擴散實驗結果（3）免疫電泳(immunoelectrophoresis)免疫電泳實驗過程動畫演示（4）免疫比濁(immunonephelometry)

在一定量抗體中分別加入遞增量的抗原，所形成的免疫復合物致液體混濁，濁度與復合物的量呈正相關，可用濁度計測量，通過繪制標準曲線二推算出樣品中抗原含量。補體結合試驗3、補體參與的反應（complementfixationtest,CFT）酶、熒光素、放射性核素或膠體金等標記抗體或抗原，進行抗原-抗體反應的檢測酶免疫測定(enzymeimmunoassay,EIA)免疫熒光法(immunofluorescence,IF)免疫組化技術（immunohitochemistrytechenique）放射免疫測定法(radioimmunoassay,RIA)化學發(fā)光免疫分析(chemiluminescenceimmunoassay)免疫印跡法(immunoblotting)4、免疫標記技術（Immunolabellingtechnique）（1）酶免疫測定(EIA)常用的方法如下：酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)酶聯(lián)免疫斑點試驗

(enzymelinkedimmunospotassay，ELISPOT)酶標抗體的工作原理酶標抗體工作原理示意圖①ELISAELISA反應過程動畫演示如何測定HBV的S抗原？ELISA原理示意圖乙肝五項及檢測試劑盒如何測定HBV的S抗原？ELISA法測定HBV的S抗原示意圖②酶聯(lián)免疫斑點試驗ELISpot試驗流程圖（1）ELISpot試驗流程圖（2）ELISpot試驗流程圖（3）典型ElispotPlateLayoutElispot實驗結果知識拓展（2）免疫熒光法(immunofluorescence,IF)免疫熒光法試驗原理示意圖免疫熒光法示意圖熒光素與抗體連接成熒光抗體

免疫熒光法分類免疫熒光法示意圖1、Laminin-green-fluorescentQdot?565IgG

2、CD31-red-fluorescentQdot?655IgG

3、Nuclei-blue-fluorescentHoechst33342Mousekidneysection（3）免疫組化技術

應用標記的抗體與組織或細胞抗原發(fā)生反應，結合形態(tài)學觀察，對組織或細胞表面抗原進行定性、定量、定位。常用技術包括酶免疫組化（辣根過氧化物酶標記）、免疫金組化（膠體金顆粒標記）、免疫電鏡技術（鐵蛋白、膠體金、過氧化物酶標記）等。H&Estaining1、11周HBx轉基因小鼠和野生型小鼠肝臟組織的HE染色2、HBx轉基因小鼠肝臟內有中性脂類聚集

用放射性核素標記抗原或抗體進行免疫學檢測。該法兼有放射性核素的高靈敏度和抗原-抗體反應的特異性，檢測靈敏度達pg水平。常用于標記的放射性核素為125I和131I，分為液相和固相兩種方法。該法常用于測定微量物質，如胰島素、生長激素、甲狀腺素、孕酮等激素，嗎啡、地高辛、IgE等。（4）放射免疫測定法

(radioimmunoassay,RIA)

將發(fā)光物質（如吖啶酯、魯米諾等）標記抗原或抗體，發(fā)光物質在反應劑（如過氧化陰離子）激發(fā)下發(fā)射光子，通過自動發(fā)光分析儀測定光子產量，可反映待檢樣品中抗體或抗原含量。該法靈敏度高，常用于檢測血清超微量活性物質（甲狀腺素等激素）。（5）化學發(fā)光免疫分析（6）免疫印跡法第二節(jié)免疫細胞檢測免疫細胞分離免疫細胞亞群分析免疫細胞功能分析一、免疫細胞分離免疫細胞分類示意圖1、葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法BloodPlasmaMononulearcellsRedcells400gCentrifuge30MinutesLymphoprep1.071密度梯度法分離淋巴細胞示意圖2、流式細胞儀分選細胞分選示意圖BDAria流式細胞儀3、磁珠分選磁珠陰性分選原理示意圖二、免疫細胞及其亞類分析流式細胞儀工作原理示意圖知識拓展流式細胞儀工作原理示意圖流式細胞儀結果圖淋巴細胞中CD8+細胞頻率知識拓展流式細胞儀熒光標記與波長對照圖知識拓展三、淋巴細胞功能的測定

1、淋巴細胞增殖實驗淋巴細胞增殖實驗

2、T細胞介導的細胞毒試驗：51Cr釋放法51Cr釋放法細胞毒試驗第三節(jié)免疫分子檢測免疫球蛋白的測定補體測定細胞因子檢測CD分子、表面受體和黏附分子的檢測HLA型別分析難點內容在體外用已知抗原檢測相應抗體用已知抗體對各類免疫球蛋白作定性、定量測定檢測血清含量高的IgG、IgA、IgM時，可用免疫比濁法；檢測IgD、IgE選用ELISA、RIA等靈敏度高的方法；診斷免疫球蛋白異常性疾?。ㄈ绻撬枇觯?，可用免疫電泳等方法。一、免疫球蛋白的測定了解體內補體激活狀況，輔助有關疾病的診斷血清含量高的C3、C4、B因子等，可用免疫比濁法其他含量低的成分則借助ELISA、RIA等方法血清總補體活性測定常采用50%補體溶血法（50%complementhaemolyticactivity,CH50）二、補體測定CH50原理是：用SRBC和兔抗SRBC作為抗原抗體復合物，通過經典途徑激活補體而溶解SRBC。通常以50%溶血所需的最小補體