1專題2微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用課題1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)1專題2微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用課題1微生物的實(shí)2

了解有關(guān)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)知識，進(jìn)行無菌技術(shù)的操作，進(jìn)行微生物的培養(yǎng)。

一、課題目標(biāo)：

掌握培養(yǎng)基的制備、高壓蒸氣滅菌和平板劃線法等基本操作技術(shù)，熟練、規(guī)范地進(jìn)行無菌操作，成功地培養(yǎng)微生物。無菌技術(shù)的操作。二、課題重點(diǎn)和難點(diǎn)：三、技能目標(biāo)：2了解有關(guān)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)知識，進(jìn)行無菌技術(shù)的操作，進(jìn)3課題背景微生物研究和應(yīng)用的前提：如何獲得純凈培養(yǎng)物？防止雜菌入侵，獲得純凈的培養(yǎng)物①合適的營養(yǎng)和環(huán)境條件②確保其他微生物無法混入3課題背景微生物研究和應(yīng)用的前提：如何獲得純凈培養(yǎng)物？防止雜4復(fù)習(xí)：微生物的類群微生物原核類:真核類非細(xì)胞類：細(xì)菌、支原體、放線菌、藍(lán)藻個(gè)體微小、結(jié)構(gòu)簡單酵母菌、霉菌、食用菌真菌：原生生物：顯微藻類、原生生物（如：草履蟲、變形蟲等）病毒、類病毒、朊病毒◆微生物的共同特點(diǎn)：一、微生物基礎(chǔ)知識4復(fù)習(xí)：微生物的類群微生物原核類:真核類非細(xì)胞類：細(xì)菌、支原5舉例1：細(xì)菌1】、細(xì)菌的形態(tài)、細(xì)菌：單細(xì)胞不分枝

微小而透明，染料染色后顯微鏡可見5舉例1：細(xì)菌細(xì)菌：單細(xì)胞不分枝6細(xì)胞壁：成分肽聚糖；細(xì)胞膜；擬核：無染色體、無核膜、無核仁質(zhì)粒：小型環(huán)狀DNA細(xì)胞器：只有核糖體2】、細(xì)菌的構(gòu)造圖1-3細(xì)菌的結(jié)構(gòu)6細(xì)胞壁：成分肽聚糖；細(xì)胞膜；2】、細(xì)菌的構(gòu)造圖1-7細(xì)菌主要是以二分裂的方式進(jìn)行增殖（如右圖）3】、細(xì)菌的繁殖4】、細(xì)菌的菌落*⑴定義：單個(gè)或者少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時(shí)，會形成一個(gè)肉眼可見的、具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫做菌落。⑵特征：大小、形狀、光澤度、顏色、硬度、透明度等?？梢宰鳛榫N鑒定的重要依據(jù)。7細(xì)菌主要是以二分裂的方式進(jìn)行增殖（如右圖）3】、細(xì)菌的繁殖8幾種菌落及其形態(tài)8幾種菌落及其形態(tài)9舉例2：病毒1】、結(jié)構(gòu):由核酸和蛋白質(zhì)構(gòu)成。SARS病毒、禽流感病毒朊病毒（蛋白質(zhì)病毒）9舉例2：病毒:由核酸和蛋白質(zhì)構(gòu)成。SARS病毒、10吸附注入合成釋放組裝2】、病毒的繁殖病毒的增殖一般可分五個(gè)階段，即：吸附→注入核酸→合成核酸和蛋白質(zhì)→組裝→釋放3】、病毒的營養(yǎng)方式：寄生10吸附注入合成釋放組裝2】、病毒的繁殖病毒的增殖一般可分五11舉例3：真菌酵母菌青霉菌——青霉素11舉例3：真菌酵母菌青霉菌——青霉素12一基礎(chǔ)知識1.概念：人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。2.類型：按物理性質(zhì)劃分：按化學(xué)成分劃分：按用途劃分：（一）培養(yǎng)基12一基礎(chǔ)知識1.概念：人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需13固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基有無凝固劑瓊脂分離鑒定工業(yè)生產(chǎn)（1）按物理性質(zhì)劃分：13固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基有無14單個(gè)或少數(shù)菌體2.特征：大小、形狀、光澤度、顏色、透明度等。3.意義：1.定義：鑒定菌種的重要依據(jù)固體培養(yǎng)基上大量繁殖子細(xì)胞群體※菌落14單個(gè)2.特征：大小、形狀、光澤度、顏色、透明度等。3.意15天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基化學(xué)成分不恒定的天然有機(jī)物如：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基化學(xué)成分完全了解的物質(zhì)配制而成的培養(yǎng)基如：高氏1號培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基。用于分類和鑒定（2）按化學(xué)成分劃分：15天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基化學(xué)成分不恒定的天然有機(jī)物如：牛肉膏16基礎(chǔ)培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基含有一般微生物生長繁殖所需的基本營養(yǎng)物質(zhì)將某種類微生物從混雜的微生物群體中分離出來用于鑒別不同類型微生物的培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基（3）按用途劃分：16基礎(chǔ)培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基含有一般微生物生長繁殖所需的基本營養(yǎng)17※幾種選擇培養(yǎng)基①加入青霉素的培養(yǎng)基分離酵母菌、霉菌等真菌②不加氮源的無氮培養(yǎng)基分離固氮菌③不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基分離自養(yǎng)型微生物17※幾種選擇培養(yǎng)基①加入青霉素的培養(yǎng)基分離酵母菌、霉菌等真183.基本成分：碳源、氮源、水、無機(jī)鹽⑴碳源無機(jī)碳源：有機(jī)碳源：CO2、CO32-、HCO3-牛肉膏、蛋白胨等自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物⑵氮源無機(jī)氮源：有機(jī)氮源：NH4＋、NO3-牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等注：含C、H、O、N的有機(jī)物是異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源183.基本成分：碳源、氮源、水、無機(jī)鹽⑴碳源無機(jī)碳源：有機(jī)194.配制原則(1)目的明確：(2)營養(yǎng)全面、濃度適宜、比例恰當(dāng)(3)適宜的pH值：有機(jī)碳源異養(yǎng)型：根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的選擇原料自養(yǎng)型：不加碳源加入緩沖劑細(xì)菌偏堿，真菌偏酸（CO2碳源）生產(chǎn)科研微生物生長不可缺少的微量有機(jī)物如：維生素、氨基酸、堿基等(4)特殊營養(yǎng)：194.配制原則(1)目的明確：(2)營養(yǎng)全面、濃度適宜、20※蛋白胨:動物蛋白初步消化的產(chǎn)物，富含有機(jī)氮化合物，也含有一些維生素和糖類。主要提供氮源和維生素。※牛肉膏：新鮮牛肉經(jīng)過剔除脂肪、消化、過濾、濃縮而成，含有多肽類、氨基酸類、核苷酸類、有機(jī)酸類、礦物質(zhì)類及維生素類的水溶性物質(zhì)。提供碳源、氮源、能源、磷酸鹽和維生素。20※蛋白胨:動物蛋白初步消化的產(chǎn)物，富含有機(jī)氮化合物，也含21（二）無菌技術(shù)防止外來雜菌的污染1.哪里需要無菌？2.如何控制無菌？無菌的意義：21（二）無菌技術(shù)防止外來雜菌的污染1.哪里需要無菌？2.如22（1）實(shí)驗(yàn)操作的空間、操作者的衣著和手，進(jìn)行清潔和消毒。（2）培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌。（3）為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行。（4）實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。1.無菌的范圍22（1）實(shí)驗(yàn)操作的空間、操作者的衣著和手，進(jìn)行清潔和消毒。23（1）消毒（2）滅菌概念較為溫和理化方法殺死部分有害微生物(不包括芽孢和孢子)強(qiáng)烈的理化因素殺死所有的微生物包括芽孢和孢子常用方法①煮沸消毒法②巴氏消毒法③化學(xué)藥劑消毒法④紫外線消毒法①灼燒滅菌法②干熱滅菌③高壓蒸汽滅菌適用對象操作空間、液體、雙手等接種環(huán)、接種針、玻璃器皿，培養(yǎng)基等2.無菌的方法23（1）消毒（2）滅菌概念較為溫和理化方法強(qiáng)烈的理化因素常24※芽孢：在某些細(xì)菌生長的一定階段，細(xì)胞內(nèi)形成一個(gè)圓形、橢圓形或柱形的，抗逆性強(qiáng)的休眠體?！咦樱赫婢a(chǎn)生的一種有繁殖或休眠作用的細(xì)胞，能直接發(fā)育成新個(gè)體。24※芽孢：在某些細(xì)菌生長的一定階段，細(xì)胞內(nèi)形成一個(gè)圓形、橢25接種室內(nèi)空氣、接種箱、超凈工作臺用紫外線照射30min紫外線消毒實(shí)驗(yàn)者的手臂、實(shí)驗(yàn)臺等酒精、氯氣、石炭酸、煤酚皂溶液化學(xué)藥劑消毒牛奶等不宜高溫消毒滅菌的70～75℃,30min；80℃,15min巴氏消毒日常食物、罐裝食品100℃,5～6min煮沸消毒法適用范圍條件方法（1）消毒25接種室內(nèi)空氣、接種箱、超凈工作臺用紫外線照射30min紫2615～30min100kPa，121℃培養(yǎng)基、實(shí)驗(yàn)器材高壓蒸汽滅菌1～2h干熱滅菌箱（160℃～170℃）耐高溫需干燥的物品（玻璃器皿等）干熱滅菌燒紅酒精燈火焰充分燃燒層灼燒接種的工具、試管口、瓶口灼燒滅菌滅菌時(shí)間所需條件適用對象滅菌方法灼燒滅菌干熱滅菌箱高壓蒸汽滅菌鍋（2）滅菌2615～30min100kPa，121℃培養(yǎng)基、實(shí)驗(yàn)器材27請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實(shí)驗(yàn)操作者的雙手思考27請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選28微生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的基本操作程序1.器具的滅菌2.培養(yǎng)基的配制3.培養(yǎng)基的滅菌4.倒平板5.微生物接種6.恒溫箱中培養(yǎng)7.菌種的保存28微生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的基本操作程序1.器具的滅菌291.概念：人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。2.類型：按物理性質(zhì)劃分：（一）培養(yǎng)基291.概念：人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其30固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基有無凝固劑瓊脂分離鑒定工業(yè)生產(chǎn)（1）按物理性質(zhì)劃分：30固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基有無31接種室內(nèi)空氣、接種箱、超凈工作臺用紫外線照射30min紫外線消毒實(shí)驗(yàn)者的手臂、實(shí)驗(yàn)臺等酒精、氯氣、石炭酸、煤酚皂溶液化學(xué)藥劑消毒牛奶等不宜高溫消毒滅菌的70～75℃,30min；80℃,15min巴氏消毒日常食物、罐裝食品100℃,5～6min煮沸消毒法適用范圍條件方法（1）消毒31接種室內(nèi)空氣、接種箱、超凈工作臺用紫外線照射30min紫3215～30min100kPa，121℃培養(yǎng)基、實(shí)驗(yàn)器材高壓蒸汽滅菌1～2h干熱滅菌箱（160℃～170℃）耐高溫需干燥的物品（玻璃器皿等）干熱滅菌燒紅酒精燈火焰充分燃燒層灼燒接種的工具、試管口、瓶口灼燒滅菌滅菌時(shí)間所需條件適用對象滅菌方法灼燒滅菌干熱滅菌箱高壓蒸汽滅菌鍋（2）滅菌3215～30min100kPa，121℃培養(yǎng)基、實(shí)驗(yàn)器材33大腸桿菌的純化培養(yǎng)：（一）制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基二實(shí)驗(yàn)操作（二）純化大腸桿菌33大腸桿菌的純化培養(yǎng)：（一）制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基二341000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方H2O定容至1000mlNacl5g蛋白胨10g牛肉膏5g瓊脂20.0g1.計(jì)算：培養(yǎng)基用量依配方計(jì)算各成分的用量2.稱量：3.溶化：牛肉膏黏稠，用稱量紙稱取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加蓋牛肉膏、稱量紙、少量水加熱溶解→取紙→蛋白胨、NaCl→瓊脂、攪拌→補(bǔ)水定容4.調(diào)pH、分裝、封口：5.滅菌：6.倒平板：加棉塞、包牛皮紙、橡皮筋勒緊（一）制備培養(yǎng)基培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌，培養(yǎng)皿干熱滅菌341000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方H2O定容至35計(jì)算

稱量

溶化

調(diào)節(jié)pH

滅菌

倒平板（一）制備培養(yǎng)基1.將培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手撥出棉塞。12342.右手拿錐形瓶，使瓶口迅速通過火焰。3.用左手將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，右手將錐形瓶中的培養(yǎng)基(約10～20mL)倒入培養(yǎng)皿，左手立即蓋上皿蓋。4.等待平板冷卻凝固（約需5～

10min）。然后，將平板倒過來放置，使皿蓋在下，皿底在上。35計(jì)算稱量溶化調(diào)節(jié)pH滅菌倒平板（一）制備培養(yǎng)基361.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時(shí)，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？問題討論答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺溫度下降到剛剛不燙手即可。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。361.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時(shí)，才能用來倒平板373.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？答：①防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基造成污染

②避免培養(yǎng)基中水分過快蒸發(fā)。答：最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。防止空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生。373.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.在倒平板的過程中38無菌檢查：將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24～48小時(shí)，觀察是否有菌落存在以確定是否被污染或滅菌是否徹底。5.怎么確定所倒平板未被雜菌污染？38無菌檢查：將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24～4839單個(gè)或少數(shù)菌體1.定義：固體培養(yǎng)基上大量繁殖子細(xì)胞群體（肉眼可見）※菌落2.特征：大小、形狀、光澤度、顏色、透明度等。（二）純化大腸桿菌39單個(gè)1.定義：固體培養(yǎng)基上大量繁殖子細(xì)胞群體※菌落2.特40單個(gè)細(xì)胞單個(gè)菌落（二）純化大腸桿菌從混雜的微生物群體中獲得只含某一種微生物的過程。何為分離純化？如何純化？接種常見方法平板劃線法操作核心防止雜菌污染，保持培養(yǎng)物純度如何分散成單個(gè)細(xì)胞？稀釋涂布平板法斜面接種穿刺接種微生物群分散40單個(gè)細(xì)胞單個(gè)菌落（二）純化大腸桿菌從混雜的微生物群體中獲411.平板劃線法：分區(qū)劃線法連續(xù)劃線法（1）概念與原理：聚集的菌群連續(xù)劃線稀釋分散單個(gè)細(xì)胞菌落生長繁殖411.平板劃線法：分區(qū)劃線法連續(xù)劃線法（1）概念與原理：聚42(2)“平板劃線”實(shí)驗(yàn)操作42(2)“平板劃線”實(shí)驗(yàn)操作43第一區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第二區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第三區(qū)劃線滅菌接種環(huán)滅菌接種環(huán)43第一區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第二區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第三區(qū)劃線滅菌接44（1）為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí),仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？問題討論殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者接種結(jié)束后殺死上次劃線時(shí)殘留菌種，使下一次劃線的菌種直接來源上次劃線的末端，從而使每次劃線時(shí)菌種數(shù)目逐漸減少，直至得到單個(gè)細(xì)胞每次劃線前殺死接種環(huán)上原有微生物取菌種前目的灼燒時(shí)期44（1）為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)45（2）在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？

答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。（3）在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？答：線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來的菌落。45（2）在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？463個(gè)劃線平板1個(gè)不劃線平板（重復(fù)實(shí)驗(yàn)）（空白對照）（3）培養(yǎng)放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h463個(gè)劃線平板1個(gè)不劃線平板（重復(fù)實(shí)驗(yàn)）（空白對照）（3）472.稀釋涂布平板法①菌液的梯度稀釋：②涂布平板操作：(1)概念與原理：聚集的微生物單個(gè)細(xì)胞菌液梯度稀釋菌落涂布平板(2)操作：生長繁殖472.稀釋涂布平板法①菌液的梯度稀釋：②涂布平板操作：(148①系列梯度稀釋操作9mL無菌水9mL無菌水9mL無菌水9mL無菌水9mL無菌水9mL無菌水注意：移液管需要經(jīng)過滅菌；試管口和移液管離火焰1～2cm處。48①系列梯度稀釋操作9mL無菌水9mL無菌水9mL無菌水949②涂布平板操作：49②涂布平板操作：50(1)涂布平