遺傳育種中的基因原位雜交技術(shù)

20世紀(jì)80年代末，這是一種重要的原位異合技術(shù)，由染色原位異合組織（cih）產(chǎn)生，具有一定的原位異合技術(shù)。這是一個(gè)精確、安全的研究工具，在分子遺傳領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。它將供體總基因組DNA切割成合適片段,標(biāo)記后作為探針,用受體總基因組DNA以適當(dāng)?shù)臐舛冗M(jìn)行封阻,在雜種細(xì)胞染色體上進(jìn)行原位雜交。在封阻DNA和標(biāo)記DNA探針之間,封阻DNA優(yōu)先與一般序列雜交,剩下的特異性序列主要被標(biāo)記探針?biāo)s交,最后檢測(cè)出不同來(lái)源的染色體組、染色體或染色體片段。GISH最初應(yīng)用于動(dòng)物、醫(yī)學(xué)等方面的研究。1989年,Le等利用黑麥總基因組DNA直接鑒別面包小麥品種中的黑麥染色體片段,這是該技術(shù)首次在植物中應(yīng)用。之后得到迅速推廣,在麥類、玉米、棉花、水稻等主要作物有大量報(bào)道,在油菜、大豆、柑橘、煙草、百合、番茄等植物中亦見應(yīng)用。目前,已成為植物分子細(xì)胞遺傳學(xué)的重要研究手段。GISH技術(shù)用來(lái)分析雜種染色體,可以直觀有效地顯示出雜種細(xì)胞中來(lái)自雙親的基因組,能夠在細(xì)胞分裂的各個(gè)時(shí)期檢測(cè)到外源染色質(zhì)并將其定位,而對(duì)于具有特殊育種價(jià)值的易位系、代換系和附加系的準(zhǔn)確識(shí)別更顯示出了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。利用GISH技術(shù)比較基因的同源性,可以為探討物種的起源、進(jìn)化和分類提供分子細(xì)胞遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。在考察染色體行為方面,利用花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期Ⅰ、后期Ⅰ的制片進(jìn)行原位雜交,就能獲得外源染色體的配對(duì)、分離等遺傳信息。1重組原植物區(qū)系的應(yīng)用1.1種子外源的滲透多數(shù)野生植物直接栽培利用價(jià)值有限,但由于具有許多優(yōu)良性狀,是栽培種進(jìn)行遺傳改良的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。育種工作者可以通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交、細(xì)胞工程等手段,將野生植物的染色體組、染色體或染色體片段轉(zhuǎn)入栽培種,來(lái)選育目的品種。而如何快速、準(zhǔn)確鑒定外源遺傳物質(zhì)的滲入,就成為一個(gè)新的課題。實(shí)踐證明,GISH是有效的鑒定技術(shù)之一。1.1.1減數(shù)分裂時(shí)期的染色體畸變基因組原位雜交能夠直接地、可見地辨別屬間或種間雜種中親本基因組的構(gòu)成。1989年,Schwarzacher等首次將非洲黑麥(Secaleafricanum)的基因組DNA用熒光素標(biāo)記制成探針,與雜種(Secaleafricanum×Hordeumchilense)根尖細(xì)胞染色體雜交,觀察細(xì)胞周期的每個(gè)階段,都發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)呈紅、黃2種不同顏色的熒光,雜交上的染色質(zhì)發(fā)黃色熒光,未雜交上的發(fā)紅色熒光。在細(xì)胞分裂中期,有7條大的發(fā)黃色熒光的染色體和7條小的發(fā)紅色熒光的染色體,長(zhǎng)度測(cè)量表明,前者來(lái)自非洲黑麥,后者來(lái)自H.chilense?；蚪M原位雜交技術(shù)也可以對(duì)減數(shù)分裂時(shí)期的染色體制片進(jìn)行分析。雜種Festulpiahubbardii(Festucarubra×Vulpiafasciculata),有21條染色體來(lái)自F.rubra,14條來(lái)自V.fasciculata。由于F.rubra和V.fasciculata的所有染色體大小、著絲點(diǎn)位置都相似,所以用常規(guī)染色技術(shù)很難區(qū)分減數(shù)分裂時(shí)同源和異源染色體的配對(duì),而利用GISH,通過(guò)不同顏色熒光顯示,則可準(zhǔn)確地加以區(qū)別。對(duì)于植物體細(xì)胞雜種,由于雙親核基因組互作,雙親染色體在雜種的有性過(guò)程中往往存在有丟失、優(yōu)先傳遞等現(xiàn)象。Jacobsen等對(duì)馬鈴薯(4x)+番茄(2x)的六倍體體細(xì)胞雜種與馬鈴薯(4x)的回交F1代和F2代進(jìn)行GISH分析表明,F1代不是預(yù)期的五倍體(2n=5x=60),而少了番茄的3條染色體;F1代中來(lái)自番茄的9條染色體,在F2代中只轉(zhuǎn)移了1~6條不等。1.1.2小麥染色體dna的分布形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記和生化標(biāo)記通常被用于異源染色質(zhì)的鑒別,基因組原位雜交與以上方法相比,有更準(zhǔn)確、直觀、信息豐富的特點(diǎn)。ChenSuiyun等人熒光標(biāo)記Thinopyrumponticum的基因組DNA,利用原位雜交技術(shù),對(duì)普通小麥與Th.ponticum的體細(xì)胞雜種后代進(jìn)行染色體組成分析,雜交信號(hào)清楚地顯示了Th.ponticum染色體上耐鹽基因向普通小麥的滲入。目前,利用GISH已成功檢測(cè)到小麥背景下,大麥、黑麥、偃麥草、新麥草、大賴草、簇毛麥等多種來(lái)源的染色體或染色體片段,其范圍幾乎涵蓋了小麥族的所有屬。而無(wú)需經(jīng)過(guò)基因表達(dá)產(chǎn)物來(lái)推斷基因轉(zhuǎn)移與否,大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期。在原位雜交后的熒光觀察中,熒光DAPI帶能夠反映出染色體上AT含量較高的區(qū)域。周樹軍利用東方百合基因組DNA作探針,用鯡魚精子DNA或亞洲百合基因組DNA作封阻,對(duì)東方百合和亞洲百合雜種的回交一代的中期染色體進(jìn)行了熒光染色。不僅將親本的基因組在其回交一代中清楚地區(qū)分開來(lái),而且發(fā)現(xiàn)二者的熒光DAPI帶在染色體上有明顯不同的分布區(qū)域,即二者基因組染色體上高AT區(qū)域位置不同,兩基因組間的確存在較大的差異。不僅如此,GISH技術(shù)還可以進(jìn)一步將小片段的DNA序列定位于染色體上。1995年,Kenton等將雙粒病毒的DNA序列定位于煙草T基因組一個(gè)小染色體上,這是第1次觀察到病毒DNA序列整合到植物基因組,對(duì)植物的系統(tǒng)發(fā)育、進(jìn)化研究以及基因工程、基因組計(jì)劃都具有重大意義。事實(shí)上,對(duì)于某些植物,例如棉花、水稻等,它們的染色體很小,通過(guò)傳統(tǒng)的核型或帶型分析鑒別遠(yuǎn)緣雜種中攜帶的外源染色體或染色體片段很困難,因而在這一領(lǐng)域,基因組原位雜交技術(shù)的應(yīng)用具有更突出的優(yōu)勢(shì)。1.1.3染色體原位雜交技術(shù)鑒別染色體易位,傳統(tǒng)上主要用2種細(xì)胞學(xué)技術(shù),銀染聯(lián)會(huì)復(fù)合體(Ag-SC)的電鏡觀察和C-帶分帶技術(shù),前者可以準(zhǔn)確定位易位斷點(diǎn),卻很難識(shí)別易位的染色體;后者可以較準(zhǔn)確的識(shí)別易位染色體,但難以準(zhǔn)確確定易位的斷點(diǎn)。染色體原位雜交技術(shù)的應(yīng)用,有效克服了上述2種方法的不足。Mukai等人以黑麥基因組總DNA和高度重復(fù)的DNA序列為探針,準(zhǔn)確識(shí)別出含抗Hessian蠅基因的黑麥6RL中間易位小片段,而這種用射線誘導(dǎo)產(chǎn)生的位于臂中部的易位片段用其他方法幾乎是無(wú)法檢測(cè)到的。顏輝煌等人以地高辛標(biāo)記的藥用野生稻(Oryzaofficinalis)總DNA作探針,未標(biāo)記的栽培稻(Oryzasativa)總DNA封阻,對(duì)栽培稻—藥用野生稻F1及回交后代材料根尖體細(xì)胞染色體制片進(jìn)行基因組原位雜交,鑒定出3個(gè)雙單體異源附加系和4個(gè)單體異源附加系。1.2倍體的出現(xiàn)和起源在植物界,多倍體現(xiàn)象普遍存在,不同基因組之間染色體相似,分類親和力緊密,這就很容易造成對(duì)物種間親緣關(guān)系、進(jìn)化距離的錯(cuò)誤估計(jì)。隨著GISH技術(shù)朝多色方向發(fā)展,使多倍體物種基因組的同時(shí)鑒定成為可能,為準(zhǔn)確評(píng)價(jià)各基因組的親緣關(guān)系,快速而可靠地研究各基因組的起源與進(jìn)化提供保證。研究人員通過(guò)細(xì)胞遺傳學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、生物化學(xué)等手段,甚至分子水平的研究,對(duì)于栽培種花生(Arachishypogaea,2n=4x=40)二倍體祖先問(wèn)題,仍不能得出明確的結(jié)論。RainaSN等人運(yùn)用GISH技術(shù),將可能的二倍體祖先種基因組DNA制成探針,分別與A.hypogaea和野生種A.monticola(2n=4x=40)根尖細(xì)胞染色體雜交,鑒定A.hypogaea的二倍體祖先以及與A.monticola的親緣關(guān)系,結(jié)果顯示,二倍體野生種A.villosa和A.ipaensis是四倍體栽培種的祖先種,A.monticola與A.hypogaea有很近的親緣關(guān)系,且二者均為異源四倍體,同時(shí)指出,2個(gè)四倍體種的核仁組織區(qū)(NOR)僅起源于野生種A.villosa。在研究多倍體小麥4A染色體起源和進(jìn)化的問(wèn)題上,GISH分析表明,具有A、B和D基因組的祖先中,只有提供B基因組的2種植物染色體具備與4A相同的雜交位點(diǎn),表明4A屬于B基因組。植物遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn),禾本科植物種屬間基因序列高度同源,基因在染色體上的排列高度相似。由此認(rèn)為,禾本科植物起源于同一祖先。寧順斌分別以玉米和水稻的基因組DNA為探針,利用基因組原位雜交技術(shù)檢測(cè)了玉米和水稻基因組之間的同源性,結(jié)果表明,二者之間具有高度同源性,從而為證實(shí)兩者起源于同一祖先提供了分子細(xì)胞遺傳學(xué)依據(jù)。此試驗(yàn)不僅對(duì)研究其他禾本科植物基因組之間的親緣關(guān)系提供了一種共同模式,而且在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。1.3減數(shù)分裂原位雜交對(duì)于染色體行為的考察關(guān)系重大,因?yàn)樗cDNA復(fù)制、基因表達(dá)、基因組的進(jìn)化,甚至物種的形成都密切相關(guān)。GISH技術(shù)的應(yīng)用使細(xì)胞周期各個(gè)階段的染色體行為變的越發(fā)清晰。Schwarzacher的實(shí)驗(yàn)即證明,對(duì)于雜種細(xì)胞,來(lái)自雙親的基因組并非任意混合,而是呈傾向性分布,各自占據(jù)一定的空間區(qū)域。研究基因組之間的關(guān)系,以前主要通過(guò)觀察減數(shù)分裂時(shí)期同源染色體的配對(duì)情況來(lái)實(shí)現(xiàn),現(xiàn)在GISH已經(jīng)成為研究染色體行為的有效技術(shù)。減數(shù)分裂原位雜交研究不僅直接標(biāo)示出減數(shù)分裂不同構(gòu)型染色體的性質(zhì)、來(lái)源,而且還使減數(shù)分裂染色體構(gòu)型圖像更清晰,立體感更強(qiáng),便于減數(shù)分裂中期構(gòu)型統(tǒng)計(jì)。唐祈林等人利用多色基因組原位雜交技術(shù)分析了玉米×四倍體多年生玉米雜種F1減數(shù)分裂構(gòu)型及其不同構(gòu)型染色體來(lái)源。雜交結(jié)果顯示單價(jià)體、二價(jià)體和三價(jià)體分別為綠、紅和黃色熒光信號(hào),表明單價(jià)體來(lái)源于玉米,三價(jià)體構(gòu)型染色體來(lái)源于玉米和四倍體多年生玉米種同源染色體配對(duì),二價(jià)體的染色體僅來(lái)源于四倍體多年生玉米種。2gish的局限性和應(yīng)用前景2個(gè)物種之間的關(guān)系越近,其基因組間的相似性就越強(qiáng),在GISH上就出現(xiàn)越多的“雜交”位點(diǎn)。所以,根據(jù)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱可以推測(cè)2個(gè)基因組間相似程度的高低,這是GISH技術(shù)研究基因組間關(guān)系的基礎(chǔ)。其特點(diǎn)之一,就是用全部的基因組DNA參與雜交,從而能夠全面地反映探針和靶序列之間在基因組水平上的相似性,避免了將序列片段直接定位于靶目標(biāo),來(lái)探測(cè)整個(gè)基因組關(guān)系時(shí)所暴露出的局限性,具有較高的定性價(jià)值。當(dāng)然,GISH技術(shù)本身也有一定的局限性,僅靠GISH一項(xiàng)技術(shù),不能區(qū)分導(dǎo)入的具體是哪條染色體或片段。同時(shí),GISH還有一個(gè)在植物中的適用性問(wèn)題。有報(bào)道說(shuō)親本間親緣關(guān)系較近時(shí)或基因組同源性較高時(shí),應(yīng)用GISH方法難以區(qū)別開來(lái)。但有實(shí)驗(yàn)證明,GISH有時(shí)能分辨被認(rèn)為具有很近的親緣關(guān)系的種,而有時(shí)在屬水平上分辨卻相當(dāng)困難。因此,建立分子與分類學(xué)的親緣性之間的相關(guān)性是GISH的一個(gè)研究方向。在實(shí)際應(yīng)用中,人們根據(jù)需要先后發(fā)展了多色基因組原位雜交(McGISH)、比較基因組原位雜交(CGH)等技術(shù),使GISH技術(shù)本身得到了進(jìn)一步延伸和發(fā)展。染色體熒光原位雜交(FISH)技術(shù)