第二章工具酶第三章載體第1頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月第二章用于核酸操作的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修飾酶第2頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及其生物功能識別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈主要存在于原核細菌中，幫助細菌限制外來DNA的入侵細菌的限制與修飾作用hsdR：編碼限制性核酸內(nèi)切酶hsdM：編碼限制性甲基化酶hsdS：編碼限制性酶和甲基化酶的協(xié)同表達1968年，Smith等人首先從流感嗜血桿菌d株中分離出

HindII和HindIII

第3頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的類型主要特性I型II型III型限制修飾多功能單功能雙功能蛋白結(jié)構(gòu)異源三聚體同源二聚體異源二聚體輔助因子ATPMg2+SAMATPMg2+SAMMg2+識別序列TGAN8TGCT旋轉(zhuǎn)對稱序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG切割位點距識別序列1kb處識別序列內(nèi)或附近距識別序列下游隨機性切割特異性切割24-26bp處第4頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的命名屬名種名株名HindIII

HindIIIHaemophilusinfluenzae

d嗜血流感桿菌d株同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內(nèi)切酶第5頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月限制性核酸內(nèi)切酶II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性識別雙鏈DNA分子中4-8對堿基的特定序列大部分酶的切割位點在識別序列內(nèi)部或兩側(cè)識別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對稱型回文結(jié)構(gòu)5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的識別序列EcoRI的切割位點第6頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月EcoRI等產(chǎn)生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A

G-C-T-C…5’OHPOHP第7頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月PstI等產(chǎn)生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP第8頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月PvuII等產(chǎn)生的平頭末端5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’第9頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月限制性核酸內(nèi)切酶II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的操作大部分II型核酸內(nèi)切酶需要相似的反應(yīng)條件：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mM0-50mM低鹽酶100mM中鹽酶150mM高鹽酶Volume20-100mlTT37℃1-1.5hr1U核酸內(nèi)切酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)1小時，完全水解1mg標準DNA所需的酶量第10頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月限制性核酸內(nèi)切酶II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的操作II型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：對鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時酶切，但應(yīng)注意：5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’BamHISmaI5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’第11頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月限制性核酸內(nèi)切酶II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的操作II型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：對鹽濃度要求不同的酶，可采取下列方法：使用較貴的酶的鹽濃度，加大便宜酶的用量，同時酶解低鹽酶先切，然后補加鹽，高鹽酶再切一種酶先切，然后更換緩沖液，另一種酶再切0.1倍體積的5MNaAcpH5.42.5倍體積的冰冷乙醇冰浴5分鐘、高速冷凍離心10分鐘、干燥第12頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月限制性核酸內(nèi)切酶影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素DNA樣品的純度：蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1mgDNA用10U酶加大反應(yīng)總體積延長反應(yīng)時間第13頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月限制性核酸內(nèi)切酶影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素DNA樣品的甲基化程度：大腸桿菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影響

大腸桿菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響的酶有EcoRII等哺乳動物中的甲基化酶在5‘CG3’序列中的C5位上引入甲基第14頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月限制性核酸內(nèi)切酶影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素核酸內(nèi)切酶的緩沖液性質(zhì)：高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強度、極端pH值等，會使一些核酸內(nèi)切酶的識別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的Staractivity現(xiàn)象

EcoRI在正常條件下識別并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油濃度超過5%（v/v）時，也可切割5‘PuPuATPyPy3’或者5‘AATT3’第15頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）DNA連接酶DNA連接酶的基本性質(zhì)修復(fù)雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵DNA連接酶5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’nicknick第16頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA連接酶DNA連接酶的基本性質(zhì)修復(fù)與RNA鏈結(jié)合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵T4-DNA連接酶5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-G-C-C-T-C…5’OHPnick5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C…5’第17頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA連接酶DNA連接酶的基本性質(zhì)連接多個平頭雙鏈DNA分子：5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C

…5’5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C

…5’T4-DNA連接酶第18頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA連接酶DNA連接酶的反應(yīng)條件Tris-HCl50-100mMpH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20mlTT4-15℃4-16hr1UDNA連接酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下15℃反應(yīng)1小時，完全連接1mgl-DNA（HindIII片段）所需的酶量第19頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA連接酶平頭雙鏈DNA片段的連接操作從分子動力學(xué)的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應(yīng)速度要慢得多提高平頭末端連接效率的方法包括：加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接）

加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機會加入10%PEG8000，促進大分子之間的有效作用加入單價陽離子（NaCl），最終濃度150-200mM第20頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I（DNApolI）5‘→3‘的DNA聚合酶活性5‘→3‘的核酸外切酶活性3‘→5‘的核酸外切酶活性大腸桿菌DNA聚合酶I的基本性質(zhì)：3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…C-G-A-G-T-OH5‘pppdNMg2+3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OHDNApolI第21頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I（DNApolI）缺口前移標記法大腸桿菌DNA聚合酶I的基本用途：5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘Mg2+5‘dNTP5‘pppdA（a-32P-dATP）5‘…G-C-T-CA-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘Nicktranslation制備32P標記的探針DNaseIDNApolI第22頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本性質(zhì)：大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分之二的大肽段，即為Klenow酶Klenow酶仍擁有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核核酸外切酶活性，但失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性第23頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本用途：補平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5‘粘性末端DNA片段的同位素末端標記cDNA第二鏈的合成雙脫氧末端終止法測定DNA序列第24頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本用途：補平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’KlenowdATPdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’第25頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本用途：DNA片段的同位素末端標記5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’Klenowa-32P-pppdAdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’第26頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA聚合酶T4-DNA聚合酶T4-DNA酶的基本特性：在無dNTP時，可以從任何3‘-OH端外切在只有一種dNTP時，外切至互補核苷酸暴露時停止在四種dNTP均存在時，聚合活性占主導(dǎo)地位5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性第27頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA聚合酶T4-DNA聚合酶T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的3’粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

HO-A-C-G-T-C-C-T-C…5’T4-DNA聚合酶5‘…G-C-T-C-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

HO-C-C-T-C…5’注意：該酶也能降解雙鏈DNA，只是其活性比單鏈降解活性低很多第28頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA聚合酶T4-DNA聚合酶T4-DNA聚合酶的基本用途：DNA片段的同位素末端標記5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘Mg2+5‘pppdN5‘pppdA（a-32P-dATP）5‘G-C-T-CA-G-C-T-G-OHHO-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘T4-DNApolT4-DNApol5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘第29頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA聚合酶依賴于RNA的DNA聚合酶（反轉(zhuǎn)錄酶）反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性：以RNA為模板聚合cDNA鏈3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA反轉(zhuǎn)錄酶Mg2+dNTP5’TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-183’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTTTT3’cDNA第30頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA聚合酶依賴于RNA的DNA聚合酶（反轉(zhuǎn)錄酶）反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性：雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈反轉(zhuǎn)錄酶3’RNA5’

DNA3’5’3’RNA5’

DNA3’5’反轉(zhuǎn)錄酶5’

DNA3’第31頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）核酸酶單鏈核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）大腸桿菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+ExoVII3’5’3’5’3’5’3’5’第32頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸酶雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII）ExoIII3’5’3’5’Mg2+3’5’3’5’大腸桿菌的核酸外切酶III特異性地從3‘端外切第33頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸酶雙鏈核酸外切酶：l核酸外切酶（lExo）lExo3’5’3’5’Mg2+l核酸外切酶特異性地從5‘端外切3’5’3’5’第34頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸酶單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本特性：來自稻谷曲霉菌（Aspergillusoryzae）Zn2+必需最適pH范圍為4.0-4.3需要NaCl10-300mM降解單鏈DNA的速度比降解雙鏈DNA快75000倍降解單鏈DNA的速度比降解單鏈RNA快7倍第35頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸酶單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本反應(yīng)：內(nèi)切單鏈DNA或RNA5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T…3’S1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-CT-T-G-A-G-G-A-G-T…3’5‘…G-C-T-CA-G-C-T-CT-T-G-A-GG-A-G-T…3’5‘dNMPs或5‘NMPs第36頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸酶單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本反應(yīng)：內(nèi)切帶缺口或缺刻的雙鏈DNA或RNA5‘…G-C-T-C-A-GC-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C

A-C-C-T-C-A…5‘nickgapS1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G3‘…C-G-A-G-T-CT-G-G-A-G-T…3’A-C-C-T-C-A…5‘第37頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸酶單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶S1核酸酶的重要用途：在DNA上定位RNA（S1mapping）DNAmRNA雜交S1EcoRI第38頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸酶單鏈內(nèi)切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶Bal31核酸酶的基本特性:來自艾氏交替單胞菌（A.espejiana）Ca2+5‘dNMPs或5‘NMPsssDNAorRNACa2+Ca2+第39頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸酶單鏈內(nèi)切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶Bal31核酸酶的基本用途：誘發(fā)DNA突變EcoRIABCEcoRIEcoRIBCABal31BCA環(huán)化AC第40頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月（五）核酸修飾酶末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（TdT）TdT的基本特性：來自小牛胸腺不需要模板的DNA聚合酶，隨機摻入dNTPs5‘p3‘HOOH3‘p5‘TdTMg2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAOH3‘p5‘第41頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月TdT的基本特性：5‘p3‘HOOH3‘

p5‘

TdTCo2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOH3‘

p5‘

5‘p3‘HOOH3‘

p5‘

TdTCo2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAAAOH3‘

p5‘

AAAAAAAAAAA第42頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸修飾酶堿性磷酸單酯酶來自小牛胸腺的堿性磷酸單酯酶（CIP）來自大腸桿菌的堿性磷酸單酯酶（BAP）5‘pOH3‘

DNAorRNA5‘pppdN5‘pppNBAP/CIPOH3‘

5‘HO5‘HOdN5‘HON第43頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸修飾酶T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）T4-PNP的基本特性：在DNA、RNA、dNR、NR的5‘-OH上加磷5‘HO3‘HOOH3‘OH5‘T4-PNPMg2+

pppATP（g-32P-ATP）5‘p3‘HOOH3‘p5‘用于探針的末端同位素標記：第44頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月第三章用于基因克隆的載體質(zhì)粒（plasmid）噬菌體或病毒DNA考斯質(zhì)粒（cosmid）與噬菌粒人造染色體載體載體的功能及特征第45頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月載體的功能及特征載體的功能運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因的擴增或表達提供必要的條件第46頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月載體的功能及特征載體應(yīng)具備的條件具有針對受體細胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）

具有合適的篩選標記具有較高的外源DNA的載裝能力具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識別切割位點具有與特定受體細胞相適應(yīng)的復(fù)制位點或整合位點第47頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒是生物細胞內(nèi)固有的、能獨立于寄主染色體而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子質(zhì)粒常見于原核細菌和真菌中絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒具有共價、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即cccDNA質(zhì)粒DNA的分子量范圍：1-300kb第48頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的自主復(fù)制性質(zhì)粒能利用寄主細胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進行自主復(fù)制質(zhì)粒DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對應(yīng)關(guān)系根據(jù)在每個細胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃閮纱髲?fù)制類型：嚴緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒1-3拷貝stringentplasmid松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒10-60拷貝stringentplasmid第49頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的自主復(fù)制性：拷貝數(shù)的控制機制–質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動控制控制復(fù)制引物與模板的結(jié)合oriE.coliColE1

plasmid復(fù)制方向rop（+）RopRNAIIRNAI3’5’5’3’第50頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的自主復(fù)制性：拷貝數(shù)的控制機制–質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動控制控制復(fù)制起始因子與復(fù)制起始位點（ori）的結(jié)合PcopcopP/OrepreporiCopRep第51頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的不相容性任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時存在于一個細胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性，不相容性的質(zhì)以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：ColE1、pMB1擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容pSC101、F、RP4擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容粒組成不相容性群第52頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的不相容性：分子機制兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，兩種含有不同復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時各受自己的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定，因此在經(jīng)過若干復(fù)制周期和細胞分裂周期后仍能共處于同一細胞內(nèi)其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細胞分裂周期中更具優(yōu)勢第53頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性革蘭氏陰性菌的質(zhì)粒可分成兩大類：接合型質(zhì)粒能在天然條件下自發(fā)地從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞（接合作用），如F、Col、R質(zhì)粒等如Col、R的其它成員非接合型質(zhì)粒不能在天然條件下獨立地發(fā)生接合作用值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個過程由bom和mob基因決定第54頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征攜帶特殊的遺傳標記野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，包括：物質(zhì)抗性抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機物物質(zhì)合成抗生素、細菌毒素、有機堿這些標記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義第55頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒質(zhì)粒的構(gòu)建天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點少、遺傳標記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進行人工構(gòu)建。目前實驗室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個野生型質(zhì)粒構(gòu)建的：pSC101

8.8kb拷貝數(shù)5四環(huán)素抗性標記基因TcrColE16.5kb拷貝數(shù)20-30大腸桿菌內(nèi)毒素標記基因E1RSF2124ColE1衍生質(zhì)粒氨芐青霉素抗性標記基因Apr第56頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒質(zhì)粒的分類人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類：高拷貝質(zhì)粒突變拷貝數(shù)控制基因拷貝數(shù)1000-3000擴增基因低拷貝質(zhì)粒來自pSC101拷貝數(shù)小于10

表達某些毒性基因溫敏質(zhì)粒在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)測序質(zhì)粒含有測序通用引物互補序列和多酶接頭polylinker整合質(zhì)粒裝有整合促進基因及位點便于外源基因的整合穿梭質(zhì)粒裝有針對兩種不同受體的復(fù)制子便于基因克隆表達質(zhì)粒裝有強化外源基因表達的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件探針質(zhì)粒裝有報告基因便于啟動子等元件的克隆篩選第57頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體松弛型復(fù)制pBR322：氯霉素可擴增拷貝數(shù)50-100/cell用于基因克隆第58頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC18/19：拷貝數(shù)2000-3000/cell用于基因克隆和測序裝有多克隆位點（MCS）正選擇顏色標記lacZ’第59頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC18/19：正選擇標記lacZ’的顯色原理pUC18/19PlaclacZ’MCSb-半乳糖苷酶的a-肽段ab5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal第60頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pGEM-3Z：多拷貝裝有兩個噬菌體的強啟動子裝有多克隆位點（MCS）正選擇顏色標記lacZ’用于外源基因的高效表達注意：T7和SP6啟動子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合2743bpMCSlacZ’PT7oriAprpGEM-3EPSP6酶所識別，因此相應(yīng)的受體菌必須表達噬菌體RNA聚合酶，如：E.coliBL21（DE3）等第61頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純化實驗室一般使用下列三種方法制備質(zhì)粒DNA：氯化銫密度梯度離心法

質(zhì)粒DNA純度高、周期長、設(shè)備要求高、溴乙錠污染堿溶法

質(zhì)粒DNA純度底、快速、操作簡便沸水浴法

質(zhì)粒DNA純度、操作周期介于氯化銫法和堿溶法之間第62頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純化氯化銫密度梯度離心法：

用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體加溶菌酶裂解細菌細胞壁加CsCl和溴乙錠超速離心過夜在紫外燈下吸取cccDNA稀釋沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs第63頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純化堿溶法：

用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體加溶菌酶裂解細菌細胞壁加NaOH和SDS的混合溶液，去膜釋放內(nèi)含物

加高濃度的醋酸鉀溶液，沉淀染色體，去除染色體DNA及大部分蛋白質(zhì)離心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白質(zhì)乙醇或異丙醇沉淀水相質(zhì)粒DNA用無DNase的RNase去除殘余的RNA

cccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA第64頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純化沸水浴法：

用含有EDTA和TritonX-100的緩沖液懸浮菌體加溶菌酶裂解細菌細胞壁沸水浴40秒鐘離心，用無菌牙簽挑去沉淀物乙醇或異丙醇沉淀質(zhì)粒DNA第65頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月噬菌體或病毒DNA噬菌體或病毒是一類非細胞微生物，能高效率高特異性地侵染宿主細胞，然后或自主復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會相互轉(zhuǎn)化。噬菌體或病毒的上述特性使得它們的DNA能被開發(fā)成為基因工程的有用載體，因為：高效率的感染性能使外源基因高效導(dǎo)入受體細胞自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細胞中高效擴增第66頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體的生物學(xué)特性：

生物結(jié)構(gòu)l噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體l噬菌體由外殼包裝蛋白和l-DNA組成

l-DNA全長48502個核苷酸l-DNA上至少有61個基因第67頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月l噬菌體生物學(xué)特性：

生物結(jié)構(gòu)5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOScos頭部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重組基因刪除與整合基因l-DNA第68頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體生物學(xué)特性：

感染周期E.coli吸附LamB受體注入復(fù)制包裝裂解第69頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體生物學(xué)特性：

感染周期體內(nèi)包裝100個左右的拷貝包裝范圍為原DNA的75-105%即36-51kbDA第70頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體生物學(xué)特性：

溶原狀態(tài)l噬菌體感染大腸桿菌后，除能裂解細胞外，也可能將其DNA直接整合到宿主細胞的染色體DNA上，并不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒，這種情況為溶原狀態(tài)。整合主要由l-DNA上的cI和int兩基因的產(chǎn)物所激活，而這兩個基因的開放與關(guān)閉又取決于宿主細胞本身的性質(zhì)。人們可以根據(jù)需要改變l-DNA或宿主細胞的性質(zhì)，使噬菌體或處于溶菌狀態(tài)，或處于溶菌狀態(tài)DNA重組技術(shù)一般需要l噬菌體進入溶菌狀態(tài)第71頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：縮短長度野生型l-DNA包裝的上限為51kb，本身長度為48.5kb，只有當(dāng)插入的外源DNA片段不大于2.5kb時，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型l-DNA的長度，可以提高裝載量。其實野生型l-DNA上約有40-50%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的。根據(jù)切除的多少，可將l-DNA分成兩大類載體：插入型載體取代型載體第72頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：縮短長度插入型載體體外包裝插入位點體外包裝插入片段載體長度37kb插入片段大小：0-14kb（51–37）第73頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：縮短長度取代型載體體外包裝體外包裝插入片段最小裝載長度10kb（51–26）載體長度26kb插入片段最大裝載長度25kb（36–26）第74頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：刪除重復(fù)的酶切位點野生型的l-DNA鏈上有5個EcoRI位點和7個HindIII位點，不利于重組操作，必須刪除至1-2個同時，為了便于各種來源的DNA片段的克隆，還需要增加一些單一的酶切位點除了簡單的切割外，還需要采用定點突變技術(shù)去除或增添酶位點第75頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標記與質(zhì)粒不同，野生型l-DNA上缺少合適的選擇標記，因此加裝選擇標記是l-DNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容l-DNA克隆載體上的選擇標記主要有下列兩類：免疫功能類標記顏色反應(yīng)類標記第76頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標記imm434imm434基因編碼一種阻止l-噬菌體進入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標記基因的l-載體進入受體細胞后，建立溶原狀態(tài)，細菌生長緩慢，形成渾濁斑；當(dāng)外源DNA插入到標記基因中，基因滅活，l-重組分子便進入溶菌循環(huán)，形成透明斑第77頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標記lacZlacZ基因編碼b-半乳糖苷酶，能催化無色的X-gal生成藍色化合物。當(dāng)外源基因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能合成藍色化合物；而空載體l-DNA則產(chǎn)生藍色透明斑第78頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：構(gòu)建琥珀密碼子的突變體

琥珀型突變（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突變。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產(chǎn)物校正tRNA能專一性地糾正這一突變。將野生型l-DNA上D和E兩個頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變成UAG。當(dāng)這種l-DNA進入一般的大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細菌，這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴散，而基因工程實驗中使用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株第79頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的主要類型：插入滅活型載體Charon2、Charon6、lgt11取代型載體lEMBL4、lgtlc、lNM762、Charon40正選擇型載體lEMBL1、lL47、l1059野生型的l噬菌體不能在P2噬菌體溶源性的細菌中繁殖（Spi+），這種生長抑制表型受l-DNA上的red和gam兩個基因控制。若將外源DNA取代red和gam，重組噬菌體便擁有Spi-表型，能在P2噬菌體溶源性的大腸桿菌受體菌中繁殖，并形成透明斑第80頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA重組分子的體外包裝：l-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導(dǎo)入受體細胞用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了l噬菌體的大腸桿菌中提取，現(xiàn)已商品化。這些包裝蛋白通常分為相互互補的兩部分：一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。包裝時，當(dāng)且僅當(dāng)這兩部分包裝蛋白與重組l-DNA分子混合后，包裝才能有效進行，任何一種蛋白包裝液被重組l-DNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設(shè)計的第81頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA及其重組分子的分離純化：將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期

加入l噬菌體或重組l噬菌體的懸浮液，37℃培養(yǎng)1小時

用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4-12小時。這時噬菌體顆粒

密度已達1013-1014/L，大腸桿菌細胞已完全裂解

超速離心，沉淀噬菌體苯酚抽提，釋放l-DNA

乙醇或異丙醇沉淀l-DNA

第82頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA作為載體的優(yōu)點：l-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌

l-DNA載體的裝載能力為25kb，遠遠大于質(zhì)粒的裝載量

重組l-DNA分子的篩選較為方便

重組l-DNA分子的提取較為簡便

l-DNA載體適合克隆和擴增外源DNA片段，但不適合表達

外源基因第83頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的M13單鏈噬菌體DNAM13噬菌體的生物學(xué)特性：

生物結(jié)構(gòu)M13噬菌體的外型呈絲狀M13

噬菌體由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成

M13

DNA全長6407個核苷酸M13DNA上至少有10個基因2700個外殼蛋白分子M13

噬菌體不裂解宿主細胞，但抑制其生長

第84頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的M13單鏈噬菌體DNAM13噬菌體的生物學(xué)特性：

感染周期+DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA-DNAIIV第85頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的M13單鏈噬菌體DNAM13DNA載體的構(gòu)建：IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列載體lacZ‘polylinker第86頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的M13單鏈噬菌體DNAM13DNA載體的特點：使克隆的DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細胞外這在DNA定向突變中非常有用M13重組分子篩選簡便被M13噬菌體感染的受體細胞生長緩慢，形成混濁斑，易于辨認挑選。而且重組分子越大，混濁斑的混濁度亦越大

但M13-DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有1.5kb第87頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月噬菌體或病毒DNA與動植物受體細胞相適應(yīng)的載體一般選擇相應(yīng)動植物的病

毒基因組DNA。動植物病毒種類繁多，每一種動植物都有多種特異性的病毒。按照基因組的結(jié)構(gòu)，可將動植物病毒分成四大類：單鏈DNA病毒雙鏈DNA病毒單鏈RNA病毒雙鏈RNA病毒RNA病毒在自我復(fù)制時大多存在相應(yīng)的DNA中間反應(yīng)物，這些中間體可作為載體進行常規(guī)的DNA重組。第88頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月考斯質(zhì)粒與噬菌粒

l-DNA載體和M13-DNA載體的裝載量最大分別為25kb和1.5

kb，但在很多情況下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，

考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的構(gòu)建就是為了進一步提高噬菌體DNA的裝載量。在包裝上限固定的條件下，大幅度縮短噬菌體DNA的長度，就能同步增加載體的裝載能力。將噬菌體DNA與包裝有關(guān)的序列與質(zhì)粒組裝在一起，既能最大限度地縮短載體的長度，同時又能保證重組DNA分子在體外仍被包裝成有感染力的顆粒，這便是構(gòu)建考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的思路。當(dāng)然，由于考斯質(zhì)粒和噬菌粒不再攜帶包裝蛋白基因，因此重組DNA分子在細胞內(nèi)不能形成噬菌體顆粒。第89頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月考斯質(zhì)粒與噬菌?？妓官|(zhì)粒（cosmid）考斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建：考斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有1978年Collins和Hohn發(fā)明構(gòu)建pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalIl-DNAcos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的載體cossite-carryingplasmid1.8kb的l-DNA片段+pBR322片段裝載范圍為31-45kb第90頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月考斯質(zhì)粒與噬菌粒考斯質(zhì)粒（cosmid）考斯質(zhì)粒載體的特點：能像l-DNA那樣進行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細胞

裝載量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范圍能像質(zhì)粒那樣在受體細胞中自主復(fù)制重組操作簡便，篩選容易不能體內(nèi)包裝，不裂解受體細胞第91頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月考斯質(zhì)粒與噬菌粒噬菌粒（phagemidorphasmid）噬菌粒載體的特點：噬菌粒是一類人工構(gòu)建的含有單鏈噬菌體包裝序列、復(fù)制子以及質(zhì)粒復(fù)制子、克隆位點、標記基因的特殊類型的載體能像M13-DNA那樣體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細胞

裝載量比常規(guī)的M13mp系列要大很多（10kb）能像質(zhì)粒那樣在受體細胞中自主復(fù)制重組操作簡便，篩選容易通過克隆雙鏈DNA能獲得同等長度的單一單鏈DNA第92頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月考斯質(zhì)粒與噬菌粒噬菌粒（phagemidorphasmid）重要的噬菌粒載體：pUC118/119pUC118pUC18+M13間隔區(qū)IGpUC119pUC19+M13間隔區(qū)IG500個拷貝3200bpMCSlacZ’lacIoriAprM13-MGpUC118/119表示M13輔助噬菌體DNA第93頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月考斯質(zhì)粒與噬菌粒噬菌粒（phagemidorphasmid）重要的噬菌粒載體：pBluescript體外轉(zhuǎn)錄載體pBluescript=pUC+f1-ori+PT3

+PT72958bpMCSlacZ’PT7oriAprf1-oripBluescriptPT3噬菌體啟動子PT3和PT7強化外源基因的轉(zhuǎn)錄提取出來的單鏈DNA重組分子在噬菌體RNA聚合酶的存在下，又可實現(xiàn)外源基因的體外轉(zhuǎn)錄第94頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月人造染色體載體

人類、動物、植物的全基因組序列分析往往需要克隆數(shù)百甚至上千kb的DNA片段，此時考斯質(zhì)粒和