高效液相色譜高效液相色譜11概述高效液相色譜法（HPLC，highperformanceliquidchromatography）發(fā)展于20世紀(jì)60年代末；它不受樣品揮發(fā)性的限制，可完成氣相色譜法不易完成的分析任務(wù)；適于分析沸點(diǎn)高、難氣化、分子量大、受熱不穩(wěn)定的有機(jī)化合物、生物活性樣品，這些化合物約占有機(jī)化合物的80％。目前，在食品、化工、醫(yī)藥等諸多行業(yè)被廣泛地應(yīng)用。1概述高效液相色譜法（HPLC，highperform2分析型HPLC,400bar制備型HPLC，大于20大氣壓LPLC低壓柱色譜，低于5個(gè)大氣壓快速柱色譜（flashchromatography)2個(gè)大氣壓MPLC,中壓柱色譜，5-20大氣壓1mg10mg100mg1gug各種加壓液相色譜大體分離規(guī)模分析型HPLC,400bar制備型HPLC，大于20大氣壓3高效液相色譜與經(jīng)典液相色譜比較

與經(jīng)典液相色譜的工作原理相同，但使用效能卻遠(yuǎn)大于經(jīng)典的液相色譜；高效液相色譜又被稱為現(xiàn)代液相色譜。高效液相色譜與經(jīng)典液相色譜比較與經(jīng)典液相色譜的工作原理相同4（1）高柱效：由于新型高效微粒固定相填料的使用，柱效可達(dá)30000塊/m理論塔板數(shù)；（2）高靈敏度：在高效液相色譜中常使用的紫外吸收檢測器的最小檢測量可達(dá)10-9g，而熒光檢測器的靈敏度可達(dá)10-11g，非破壞性；（3）分析速度快：由于使用了高壓輸液泵，輸液壓力可達(dá)40MPa，流動(dòng)相流速大大加快，完成一個(gè)樣品分析，僅需幾分鐘至幾十分鐘，與經(jīng)典的液相色譜相比，分析時(shí)間大大縮短；（4）高選擇性：不僅可分析有機(jī)化合物的同分異構(gòu)體，使用手性固定相還可分析性質(zhì)上極為相似的光學(xué)異構(gòu)體。（1）高柱效：由于新型高效微粒固定相填料的使用，柱效可達(dá)305例如：分離苯的羥基化合物，7個(gè)組分只需1min就可完成。氨基酸分離：經(jīng)典色譜法：20h分離出20種氨基酸（柱長約170cm，柱徑0.9cm，流動(dòng)相速度30cm3/h）。高效液相色譜法：lh。用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ)的柱，梯度洗脫，0.5h內(nèi)分離出尿中104個(gè)組分。例如：6與氣相色譜比較（1）缺少像氣相色譜法中使用的熱導(dǎo)檢測器、氫火焰離子化檢測器那樣的通用型檢測器；（2）使用多種溶劑，成本比氣相色譜法高，而且易引起環(huán)境污染；當(dāng)進(jìn)行梯度洗脫操作時(shí)，比氣相色譜的程序升溫操作復(fù)雜；（3）不能完成柱效在10萬塊理論塔板數(shù)以上的、組成復(fù)雜的樣品分析，也不能代替中低壓柱色譜去分析受壓易分解，變性的樣品。與氣相色譜比較（1）缺少像氣相色譜法中使用的熱導(dǎo)檢測器、氫火7儲液器真空脫液器高壓泵自動(dòng)進(jìn)樣器柱溫箱餾分收集器檢測器2高效液相色譜儀儲液器真空脫液器高壓泵自動(dòng)進(jìn)樣器柱溫箱餾分收集器檢測器2高8由輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。圖1高效液相色譜儀示意圖由輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。9圖2高效液相色譜儀示意圖高壓輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)圖2高效液相色譜儀示意圖高壓輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測10

HPLC組成主要部分：高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。輔助裝置：自動(dòng)進(jìn)樣、餾分收集、數(shù)據(jù)處理等。

HPLC組成11HPLC工作過程：高壓泵將貯液器中流動(dòng)相經(jīng)進(jìn)樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。注入欲分離樣品時(shí)，流經(jīng)進(jìn)樣器貯液器的流動(dòng)相將樣品帶入色譜柱進(jìn)行分離，依先后順序進(jìn)入檢測器。記錄儀記錄檢測器送出的信號，得到液相色譜圖。HPLC工作過程：12

2.1高壓輸液系統(tǒng)

由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細(xì)，對流動(dòng)相阻力很大，為使流動(dòng)相較快流動(dòng)，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)。它是高效液相色譜儀最重要的部件，一般由儲液罐、高壓輸液泵、過濾器、壓力脈動(dòng)阻力器、梯度洗脫裝置和壓力表等組成。（1）儲液罐由玻璃、不銹鋼或氟塑料制成，容量為1到2L。2.1高壓輸液系統(tǒng)13關(guān)鍵部件之一。將儲液罐中的流動(dòng)相以高壓形式連續(xù)不斷地送入液路系統(tǒng)，使樣品在色譜柱中完成分離過程。分類：恒流泵和恒壓泵。恒流泵：輸出流量保持恒定，與色譜柱引起阻力變化無關(guān)；恒壓泵：能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時(shí)間的重視性差。

高壓輸液泵關(guān)鍵部件之一。將儲液罐中的流動(dòng)相以高壓形式連續(xù)不斷地送入液路14往復(fù)泵示意圖

目前恒流泵正逐漸取代恒壓泵。恒流泵又稱機(jī)械泵，它又分機(jī)械注射泵和機(jī)械往復(fù)泵兩種，應(yīng)用最多的是機(jī)械往復(fù)泵。往復(fù)泵示意圖目前恒流泵正逐漸取代恒壓泵。恒流15過濾器設(shè)置在高壓輸液泵進(jìn)口和出口與進(jìn)樣閥之間，防止輸液泵柱塞和進(jìn)樣閥閥芯損壞，以及因柱頭阻塞引起柱壓升高。

溶劑過濾器、管道過濾器脈動(dòng)阻尼器設(shè)置在高壓輸液泵出口和色譜柱進(jìn)口之間，用于消除往復(fù)式柱塞泵輸出的壓力脈動(dòng)。過濾器16梯度洗脫裝置

梯度洗脫：在分離過程中使兩種或兩種以上不同極性的溶劑，按一定程序連續(xù)改變它們之間的比例，使流動(dòng)相的強(qiáng)度、極性、pH值或離子強(qiáng)度相應(yīng)地變化，提高分離效果，縮短分析時(shí)間。

梯度洗脫裝置17外梯度裝置（又稱低壓梯度），流動(dòng)相在常溫常壓下混合，用高壓泵壓至柱系統(tǒng)，僅需一臺泵即可。內(nèi)梯度裝置（又稱高壓梯度），將兩種溶劑分別用泵增壓后，按設(shè)置的程序，注入梯度混合室混合，再輸至柱系統(tǒng)。梯度洗脫裝置分為兩類：外梯度裝置（又稱低壓梯度），流動(dòng)相在常溫常壓下混合，用高壓泵182.2

進(jìn)樣系統(tǒng)

進(jìn)樣系統(tǒng)包括進(jìn)樣口、注射器和進(jìn)樣閥等，把分析試樣有效地送入色譜柱上進(jìn)行分離。2.2進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)包括進(jìn)樣口、注射器和進(jìn)樣閥19采樣進(jìn)樣定量管微量注射器六通閥進(jìn)樣器工作原理示意圖采樣進(jìn)樣定量管微量注射器六通閥進(jìn)樣器工作原理示意圖20手動(dòng)進(jìn)樣閥手動(dòng)進(jìn)樣閥21定量管接頭定量管接頭22

柱外展寬（柱外效應(yīng)）

：色譜柱外的因素所引起的峰展寬。主要包括進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道及檢測器中存在死體積?？煞种昂椭笳箤?。

高效液相色譜柱（柱長約5～30cm）比氣相色譜柱短得多，所以柱外展寬較突出。

進(jìn)樣系統(tǒng)是引起柱前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對進(jìn)樣技術(shù)要求較嚴(yán)。柱外效應(yīng)柱外展寬（柱外效應(yīng)）：色譜柱外的因素所引起232.3分離系統(tǒng)—色譜柱

色譜柱是液相色譜的核心部件，包括柱管與固定相。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其它金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。

一般色譜柱長5～30cm，內(nèi)徑為4～5mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑3～12mm，制備柱內(nèi)徑較大，可達(dá)25mm以上。2.3分離系統(tǒng)—色譜柱色譜柱是液相色譜的核心部件24

一般在分離柱前裝有一個(gè)預(yù)柱，柱內(nèi)填充物和分離柱完全一樣，可使淋洗溶劑經(jīng)過前置柱（預(yù)柱）時(shí)為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時(shí)不再洗脫其中固定相，保證分離柱性能不受影響。（減少不可逆吸附和固定相的流失）一般在分離柱前裝有一個(gè)預(yù)柱，柱內(nèi)填充物和分離柱完全一252.4檢測系統(tǒng)

檢測器是液相色譜儀的關(guān)鍵部件之一。對檢測器的要求是：靈敏度高、重復(fù)性好、線性范圍寬、死體積小以及對溫度和流量的變化不敏感等。

2.4檢測系統(tǒng)檢測器是液相色譜儀的關(guān)鍵部件之一26檢測器的基本類型：溶質(zhì)性檢測器：僅對被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD)等?？傮w檢測器：對試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有示差折光、電導(dǎo)檢測器等。

檢測器的基本類型：27高效液相色譜檢測器比較？高效液相色譜檢測器比較？282.5附屬系統(tǒng)

包括脫氣、恒溫、自動(dòng)進(jìn)樣、餾分收集以及數(shù)據(jù)處理等裝置。

脫氣：流動(dòng)相使用前必須脫氣，以除去其中溶解的氣體（如O2），防止在洗脫過程中流動(dòng)相由色譜柱流至檢測器時(shí)，因壓力降低產(chǎn)生氣泡，增加基線噪音，降低靈敏度；溶解的氧氣還會導(dǎo)致樣品中某些組份被氧化，柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。脫氣方法：氦氣脫氣法、加熱回流法、真空脫氣法、超聲脫氣法、在線真空脫氣法（膜滲透在線脫氣）。2.5附屬系統(tǒng)包括脫氣、恒溫、自動(dòng)進(jìn)樣、餾分收293高效液相色譜的固定相和流動(dòng)相

3.1固定相

以承受高壓能力，分為剛性固體和硬膠兩大類；

剛性固體以二氧化硅為基質(zhì)，可承受7.0×108～1.0×109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成?？沙惺軌毫ι舷逓?.5×108Pa。

3高效液相色譜的固定相和流動(dòng)相3.1固定相30

按孔隙深度，分為表面多孔型和全多孔型兩類：表面多孔型固定相在實(shí)心玻璃球基體外面覆蓋一層多孔活性材料，如硅膠、氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酰胺等。這類固定相的多孔層厚度小、孔淺，相對死體積小，出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時(shí)能迅速達(dá)平衡，適合做一般性樣品分析。由于多孔層厚度薄，最大允許量受限制。按孔隙深度，分為表面多孔型和全多孔型兩類：31全多孔型固定相

由直徑為10nm的硅膠微粒凝聚而成，也可由氧化鋁微粒凝聚成全多孔型固定相。這類固定相顆粒很細(xì)（5～10μm），孔較淺，傳質(zhì)速率快，高效、高速。特別適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析。全多孔型固定相由直徑為10nm的硅膠微粒凝聚而成，也32

333.2流動(dòng)相對流動(dòng)相的基本要求：

(1)溶劑對于待測樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。

(2)溶劑要與檢測器匹配。紫外吸收檢測器，應(yīng)注意選用檢測器波長比溶劑的紫外截止波長要長。

(3)折光率檢測器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動(dòng)相，以達(dá)最高靈敏度。（4）價(jià)廉易得，無毒、環(huán)境污染小。3.2流動(dòng)相對流動(dòng)相的基本要求：34當(dāng)小于截止波長的紫外光通過溶劑時(shí)，溶劑產(chǎn)生強(qiáng)烈吸收，此時(shí)溶劑是光學(xué)不透明的，嚴(yán)重干擾組分的吸收測量。溶劑的紫外截止波長當(dāng)小于截止波長的紫外光通過溶劑時(shí)，溶劑產(chǎn)生強(qiáng)烈吸收，此時(shí)溶劑35（5）高純度。由于高效液相靈敏度高，對流動(dòng)相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。痕量雜質(zhì)的存在，將使截止波長值增加50～100nm。（6）化學(xué)穩(wěn)定性好。不能選與樣品發(fā)生反應(yīng)的溶劑。

(7)適宜的沸點(diǎn)及粘度。溶劑沸點(diǎn)過高，粘度大，柱效降低；常用溶劑有丙酮、乙醇、乙腈等。但粘度過于低也不宜采用，如戊烷、乙醚等，易在色譜柱或檢測器內(nèi)形成氣泡，影響分離。

（5）高純度。由于高效液相靈敏度高，對流動(dòng)相溶劑的純度也要求36

高效液相色譜中常用溶劑及物理常數(shù)溶劑紫外截止波長nm沸點(diǎn)/oC黏度/mPa.s(25oC)溶劑強(qiáng)度εo正庚烷195980.400.01正己烷190690.300.01環(huán)戊烷200490.420.05四氫呋喃212660.460.57乙酸乙酯256770.430.53氯仿245610.530.40丙酮330560.300.56乙腈190820.340.65甲醇205650.540.95水1000.89高效液相色譜中常用溶劑及物理常數(shù)紫外截止波長n374高效液相色譜法的類型按照分離機(jī)理，高效液相色譜法可分為液-固吸附色譜、液-液分配色譜、離子交換色譜、離子排斥色譜、離子對色譜、離子抑制色譜、凝膠色譜和親和色譜等。主要對液-固吸附色譜、液-液分配色譜、離子交換色譜和凝膠色譜進(jìn)行介紹。應(yīng)用最多的是液-液分配色譜。4高效液相色譜法的類型按照分離機(jī)理，高效液相色譜法可分為液384.1液-固吸附色譜(LSAC)

流動(dòng)相為液體，固定相是固體吸附劑的色譜法，簡稱為液-固吸附色譜法。液-固吸附色譜法是最早使用的液相色譜法，是液相色譜法的基礎(chǔ)。存在著重復(fù)性差、耗費(fèi)溶劑、色譜柱再生時(shí)間長等缺點(diǎn)，目前的使用范圍小于液-液分配色譜。4.1液-固吸附色譜(LSAC)流動(dòng)相為液體，固定相是固39液-固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相，吸附劑通常是些多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它們的表面存在吸附中心。液-固色譜是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來進(jìn)行分離的。液-固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相，吸附劑通常是些多孔的40吸附色譜中，在一定的條件（溫度、壓力）下，達(dá)到吸附平衡時(shí)，吸附在吸附劑表面單位面積上的溶質(zhì)分子的量與該組分分布在單位體積流動(dòng)相中的分子的量的比值稱為吸附系數(shù)(Ka)，它相當(dāng)于液-液分配色譜中的分配系數(shù)（K）。Vm代表流動(dòng)相的體積；Sa

代表固定相的表面積；Xm、Xa分別代表溶質(zhì)分子在流動(dòng)相和固定相中的量（物質(zhì)的量或質(zhì)量）。4.1.1吸附系數(shù)吸附色譜中，在一定的條件（溫度、壓力）下，達(dá)到吸附平衡時(shí)，吸41基于不同的組分與流動(dòng)相分子爭奪吸附劑表面的活性中心時(shí)，因吸附系數(shù)的大小不同進(jìn)行分離的，吸附系數(shù)越大，越晚流出色譜柱，保留時(shí)間越長。為了實(shí)現(xiàn)較好的分離，應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)臈l件使各組分之間的吸附系數(shù)存在較大的差異。4.1.2液-固吸附色譜的分離原理基于不同的組分與流動(dòng)相分子爭奪吸附劑表面的活性中心時(shí)，因吸附424.1.3固定相

吸附色譜所用固定相多是硅膠、氧化鋁等。由于硅膠的優(yōu)點(diǎn)較多，如線性容量較高，機(jī)械性能好，不溶脹，與大多數(shù)試樣不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)等，因此，以硅膠用得最多。表面多孔型和全多孔型都可作吸附色譜中的固定相，但表面多孔型由于試樣容量較小，目前最廣泛使用的還是全多孔型微粒填料。4.1.3固定相吸附色譜所用固定相多是硅膠、氧化鋁等。由434.1.4流動(dòng)相

一般把吸附色譜中流動(dòng)相稱作洗脫劑。

在吸附色譜（硅膠）中對極性大的試樣往往采用極性強(qiáng)的洗脫劑；對極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。洗脫劑的極性強(qiáng)弱可用溶劑強(qiáng)度參數(shù)（ε0）來衡量。ε0越大，表示洗脫劑的極性越強(qiáng)。4.1.4流動(dòng)相一般把吸附色譜中流動(dòng)相稱作洗脫劑44溶劑ε0溶劑ε0溶劑ε0氟烷-0.25苯0.32乙腈0.65正戊烷0.00氯仿0.40吡啶0.71石油醚0.01甲乙酮0.51正丙醇0.82環(huán)己烷0.04丙酮0.56乙醇0.88四氯化碳0.18二乙胺0.63甲醇0.95常用溶劑在氧化鋁吸附劑中的ε0

在硅膠吸附劑中ε0值的順序相同。（ε0硅膠=0.77×ε0氧化鋁）溶劑ε0溶劑ε0溶劑ε0氟烷-0.25苯0.32乙腈0.6545液-液分配色譜是固定相與流動(dòng)相均為液體的色譜法。在一定（溫度、壓力）條件下，化合物在兩相（固定相和流動(dòng)相）間達(dá)到分配平衡時(shí)，其在固定相與流動(dòng)相中的濃度的比值稱為分配系數(shù)(distributioncoefficient，K)。4.2液-液分配色譜法（LLPC）式中，Vm

和Vs代表流動(dòng)相和固定相的體積；Xs、Xm代表溶質(zhì)分子在流動(dòng)相和固定相中的量（物質(zhì)的量或質(zhì)量）,Cm和Cs溶質(zhì)分子在流動(dòng)相和固定相中的濃度。液-液分配色譜是固定相與流動(dòng)相均為液體的色譜法。在一定（溫度46分配系數(shù)與分析物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、所用流動(dòng)相和固定相的性質(zhì)有關(guān)，也與溫度、壓力有關(guān)。在流動(dòng)相、固定相、溫度和壓力等條件一定時(shí)，若樣品濃度很低（Cs、Cm很?。r(shí)，K只取決于組分的性質(zhì)，而與濃度無關(guān)，在這種條件下，得到的色譜峰為正常峰；在許多情況下，隨著濃度的增大，K減小，這時(shí)色譜峰為拖尾峰；而有時(shí)隨著溶質(zhì)濃度的增大，K也增大，這時(shí)色譜峰為前延峰。只有盡可能減少進(jìn)樣量，使組分在柱內(nèi)濃度降低，K恒定時(shí)，才能獲得正常峰。分配系數(shù)與分析物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、所用流動(dòng)相和固定相的性質(zhì)有關(guān)，也474.2.1分離原理液-液分配色譜是基于各組分在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)（K）的大小來分離的。在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分在固定相中的滯留時(shí)間長，后流出色譜柱；K值小的組分則滯留時(shí)間短，先流出色譜柱?；旌衔镏懈鹘M分的分配系數(shù)不同是色譜分離的前提，各組分間的分配系數(shù)相差越大，越容易分離。實(shí)際分析中,當(dāng)固定相確定后，主要靠調(diào)整流動(dòng)相的組成配比及pH值，以獲得組分間的分配系數(shù)差異及適宜的保留時(shí)間，達(dá)到分離的目的。4.2.1分離原理液-液分配色譜是基于各組分在固定相和流動(dòng)48

4.2.2固定相

由于液-液色譜中流動(dòng)相參與選擇競爭，因此，對固定相選擇較簡單。只需使用幾種極性不同的固定液即可解決分離問題。例如，最常用的強(qiáng)極性固定液β,β′-氧二丙腈，中等極性的聚乙二醇，非極性的角鯊?fù)榈取?/p>

4.2.2固定相49

為解決固定液在載體上流失問題，產(chǎn)生了化學(xué)鍵合固定相，將各種不同有機(jī)基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到載體表面。它代替了固定液的機(jī)械涂漬，對液相色譜法迅速發(fā)展起著重大作用，是液相色譜法的一個(gè)重大突破。

化學(xué)鍵合固定相是目前應(yīng)用最廣泛的一種固定相。約有3/4以上的分離問題是在化學(xué)鍵合固定相上進(jìn)行的。為解決固定液在載體上流失問題，產(chǎn)生了化學(xué)鍵合固定相，將各50按照固定相與流動(dòng)相的極性差別，液-液色譜法可分為正相色譜和反相色譜兩類。4.2.3正相色譜和反相色譜按照固定相與流動(dòng)相的極性差別，液-液色譜法可分為正相色譜和反51正相色譜

流動(dòng)相的極性小于固定相的極性的液-液分配色譜，也稱為正相洗脫。正相洗脫中，樣品中極性小的化合物在固定相中溶解度小，分配系數(shù)小，先流出色譜柱，而極性大的化合物后流出色譜柱。正相色譜流動(dòng)相的極性小于固定相的極性的液-液分配色譜，也稱52反相色譜（reversephase,RP）流動(dòng)相的極性大于固定相的極性的液-液分配色譜，也稱為反（逆）相洗脫。反相洗脫與正相色譜法相反，樣品中極性大的化合物先流出色譜柱，而極性小的化合物在固定相中溶解度大，分配系數(shù)大，后流出色譜柱。因?yàn)榉聪嗌V中固定液更易流失、重復(fù)性差，目前也已被反相化學(xué)鍵合相色譜法代替。反相色譜（reversephase,RP）流動(dòng)相的極性大534.2.4化學(xué)鍵合相色譜法（CBPC）

采用化學(xué)鍵合相的液相色譜稱為化學(xué)鍵合相色譜法，簡稱鍵合相色譜。

4.2.4化學(xué)鍵合相色譜法（CBPC）采用化學(xué)鍵合相54(1)鍵合相色譜的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：通過改變流動(dòng)相的組成和種類，可有效地分離各種類型化合物（非極性、極性和離子型）。此外，由于鍵合到載體上的基團(tuán)不易流失，特別適用于梯度淋洗。在高效液相色譜法中，約有8O％的分離問題是用鍵合相色譜法解決。缺點(diǎn)：不能用于酸、堿度過大或存在氧化劑的緩沖溶液作流動(dòng)相的體系。

(1)鍵合相色譜的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：通過改變流動(dòng)相的組成和種類，可55(2)鍵合固定相類型：

用來制備鍵合固定相的載體，幾乎都用硅膠。利用硅膠表面的硅醇基(Si一OH)與有機(jī)分子成鍵,即可得到各種性能的固定相。一般可分三類：（1）疏水基團(tuán)

(非極性鍵合相),如不同鏈長的烷烴（C8和C18）和苯基等。（2）極性基團(tuán)如氨丙基、氰乙基、醚和醇等。

(3)中等極性鍵合相,如醚基鍵合相，可用于正相色譜，也可用于反相色譜，具體情況要依流動(dòng)相的極性而定。（4）離子交換基團(tuán)如作為陰離子交換基團(tuán)的胺基，季銨鹽；作為陽離子交換基團(tuán)的磺酸等。(2)鍵合固定相類型：56反相鍵合色譜法

固定相采用極性較小的鍵合固定相，如硅膠-C18H37、硅膠-苯基等，流動(dòng)相采用極性較強(qiáng)的溶劑，如甲醇-水、乙腈-水、水和無機(jī)鹽的緩沖溶液等；多用于分離多環(huán)芳烴等低極性化合物。鍵合不同長度的烴基的固定相親脂性強(qiáng)弱順序：RP-18(C18H37)>RP-8(C8H17)>RP-2(C2H5)。

RP:reversephase反相鍵合色譜法固定相采用極性較小的鍵合固定相，如硅57親水性表面親油性表面化學(xué)修飾RP-2RP-8RP-18硅膠親水性表面親油性表面化學(xué)修飾RP-2RP-8RP-18硅膠58

采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液為流動(dòng)相，可用于分離極性化合物；若采用水和無機(jī)鹽的緩沖液為流動(dòng)相，可分離易離解的樣品，如有機(jī)酸、有機(jī)堿、酚類等。反相鍵合相色譜法具有柱效高，能獲得無拖尾色譜峰的優(yōu)點(diǎn)。采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液為流動(dòng)相，可用于分離59反相鍵合相色譜的分離機(jī)理

疏溶劑作用：鍵合在硅膠表面上的非極性烷基鍵合相具有較強(qiáng)的疏水特性。當(dāng)用極性溶劑為流動(dòng)相來分離含有極性官能團(tuán)的有機(jī)化合物時(shí)，一方面，分子中的非極性部分與固定相表面上的疏水烷基產(chǎn)生締合作用，使它保留在固定相中；另一方面，被分離物的極性部分受到極性流動(dòng)相的作用，促使它離開固定相，并減小其保留作用。兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。反相鍵合相色譜的分離機(jī)理疏溶劑作用：鍵合在硅膠表面上的非極60反相色譜中固定相表面上

溶質(zhì)分子與烷基鍵合相間的締合作用反相色譜中固定相表面上

溶質(zhì)分子與烷基鍵合相間的締合作用61氰基鍵合相及氨基鍵合相是常用極性鍵合相，其次還有雙羥基鍵合相及乙二醇鍵合相等。由于具有較強(qiáng)的極性，常作為正相色譜法使用，與硅膠吸附色譜法相似，常選擇烷烴（正己烷）加適量極性調(diào)節(jié)劑作流動(dòng)相。正相鍵合相色譜法

氰基鍵合相及氨基鍵合相是常用極性鍵合相，其次還有雙羥基鍵合相62氰基固定相氰基固定相是將氰乙烷基（CN-CH2CH2-Si-)鍵合在硅膠上制備而成。使用氰基鍵合相時(shí)，分離條件與硅膠相似，但氰基鍵合相的極性比硅膠弱，用相同流動(dòng)相時(shí)，保留值在氰基鍵合相上較小。氰基鍵合相對雙鍵異構(gòu)體分離的選擇性好于硅膠固定相。氰基固定相氰基固定相是將氰乙烷基（CN-CH2CH2-Si-63氨基鍵合相

氨基鍵合相是將氨丙烷基(NH2-CH2CH2CH2-Si-)鍵合在硅膠載體上，形成單分子層，鍵合量約為3.2μmol/m2。氨基鍵合相與硅膠性質(zhì)差別較大，前者為堿性后者為酸性。氨基鍵合相可用于正相色譜，也可用于反相色譜，視固定相與流動(dòng)相的相對極性而定。用于正相色譜時(shí)，常與硅膠柱具有不同的選擇性。氨基鍵合相是糖類分離的最重要色譜柱，又稱為碳水化合物柱，此時(shí)作為反相色譜使用，用乙腈-水為流動(dòng)相。氨基鍵合相

氨基鍵合相是將氨丙烷基(NH2-CH2CH2CH64離子性鍵合相色譜法

當(dāng)以薄殼型或全多孔微粒型硅膠為基質(zhì)，化學(xué)鍵合各種離子交換基團(tuán)，如－SO3H、－CH2NH2、－COOH、－CH2N(CH3）2等時(shí)，就形成了離子型鍵合相色譜的固定相；流動(dòng)相一般采用緩沖溶液。其分離原理與離子交換色譜類似。

離子性鍵合相色譜法當(dāng)以薄殼型或全多孔微粒型硅膠為基65

66

4.3離子交換色譜法（IEC）

離子交換色譜是以離子交換樹脂為固定相，用水作流動(dòng)相的一種高效液相色譜分離法。離子交換色譜適于分離在水溶液中能夠電離的物質(zhì)。離子交換色譜在20世紀(jì)60年代開始興起，但其發(fā)展比較緩慢，不如其它類型高效液相色譜應(yīng)用廣泛，有些應(yīng)用已被離子對色譜或離子色譜代替。4.3離子交換色譜法（IEC）離子交換色譜是以離子交換67（1）分離原理

在離子交換樹脂的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)骨架上，具有許多帶有正電荷或負(fù)電荷可與溶液中的離子進(jìn)行交換的活性基團(tuán)，樣品分子在水溶液中電離成的離子，可與離子交換樹脂上與其帶相同電荷的離子發(fā)生交換反應(yīng)：

當(dāng)交換反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，其平衡常數(shù)可用下式計(jì)算：

（1）分離原理

在離子交換樹脂的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)骨架上，具有許多帶有68離子交換色譜是基于各組分在離子交換樹脂上的結(jié)合能力差別進(jìn)行分離的。平衡常數(shù)大的組分，與離子交換樹脂的結(jié)合強(qiáng)，后流出色譜柱；反之，平衡常數(shù)小的組分，與離子交換樹脂的結(jié)合弱，先流出色譜柱。離子交換色譜是基于各組分在離子交換樹脂上的結(jié)合能力差別進(jìn)行分69（2）固定相

離子交換色譜的固定相包括多孔型離子交換樹脂、薄殼型離子交換樹脂和化學(xué)鍵合型離子交換樹脂三種。多孔型離子交換樹脂是在苯乙烯和二乙烯基苯交聯(lián)共聚形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)基體上引入各種交換基團(tuán)制成的球形微粒。這種樹脂交換基團(tuán)多，柱容量大，對溫度穩(wěn)定性好，但由于基體中有孔，擴(kuò)散速度慢、在有機(jī)溶劑中或水中易于溶脹，柱效較低。（2）固定相

離子交換色譜的固定相包括多孔型離子交換樹脂、薄70高效液相色譜課件71薄膜型離子交換樹脂是以薄殼玻珠為擔(dān)體，在其表面上涂上約1%的離子交換樹脂。這種離子交換樹脂具有傳質(zhì)速度快、柱效高、不易溶脹的優(yōu)點(diǎn)，但因可交換層薄，載樣量小。化學(xué)鍵合型離子交換樹脂，又稱為離子交換劑，是把離子交換基團(tuán)如季胺基團(tuán)、磺丙基和羧基等直接鍵合在硅膠上制備而成。化學(xué)鍵合型離子交換樹脂膨脹性很小并可耐受較高的壓力。薄膜型離子交換樹脂是以薄殼玻珠為擔(dān)體，在其表面上涂上約1%的72（3）流動(dòng)相離子交換色譜一般用含鹽的緩沖液（如磷酸鹽、檸檬酸鹽等）作為流動(dòng)相,有時(shí)也加入能與水混溶的有機(jī)溶劑（如甲醇、乙腈等）。流動(dòng)相的離子強(qiáng)度、pH、鹽的種類及濃度、是否含有機(jī)溶劑及有機(jī)溶劑種類，均會對樣品的保留產(chǎn)生影響。（3）流動(dòng)相離子交換色譜一般用含鹽的緩沖液（如磷酸鹽、檸檬酸734.4離子色譜法（IC）

由離子交換色譜法派生出來的一種分離方法。由于離子交換色譜法在無機(jī)離子的分析和應(yīng)用受到限制。例如，對于那些不能采用紫外檢測器的被測離子，如采用電導(dǎo)檢測器，由于被測離子的電導(dǎo)信號被強(qiáng)電解質(zhì)流動(dòng)相的高背景電導(dǎo)信號掩沒而無法檢測。4.4離子色譜法（IC）由離子交換色譜法派生出來的一種分74

為了解決這一問題，1975年Small等人提出一種能同時(shí)測定多種無機(jī)和有機(jī)離子的新技術(shù)。他們在離子交換分離柱后加一根抑制柱，抑制柱中裝填與分離柱電荷相反的離子交換樹脂。通過分離柱后的樣品再經(jīng)過抑制柱，使具有高背景電導(dǎo)的流動(dòng)相轉(zhuǎn)變成低背景電導(dǎo)的流動(dòng)相，從而用電導(dǎo)檢測器可直接檢測各種離子的含量。這種色譜技術(shù)稱為離子色譜。為了解決這一問題，1975年Small等人提出一種能同時(shí)測75

4.5離子對色譜法（IPC）

離子對色譜法是分離分析強(qiáng)極性有機(jī)酸和有機(jī)堿的極好方法。它是離子對萃取技術(shù)與色譜法相結(jié)合的產(chǎn)物。在20世紀(jì)70年代中期，Schill等人首先提出離子對色譜法，后來，這種方法得到十分迅速的發(fā)展。4.5離子對色譜法（IPC）離子對色譜法是分離分析強(qiáng)76將一種（或數(shù)種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（稱對離子或反離子）加到流動(dòng)相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成離子對，從而控制溶質(zhì)離子保留行為的一種色譜法。離子對色譜法原理將一種（或數(shù)種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（稱對離子或反離子）77

4.6尺寸排阻色譜法（SEC）

尺寸排阻色譜法(Sizeexclusionchromatography)又稱凝膠色譜法，主要用于較大分子的分離。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機(jī)理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實(shí)現(xiàn)分離的。4.6尺寸排阻色譜法（SEC）尺寸排阻色譜法(S78

尺寸排阻色譜被廣泛應(yīng)用于分析大分子物質(zhì)相對分子質(zhì)量的分布。特點(diǎn)：（1）保留時(shí)間是分子尺寸的函數(shù)，有可能提供分子結(jié)構(gòu)的某些信息。（2）保留時(shí)間短，譜峰窄，易檢測，可采用靈敏度較低的檢測器。（3）固定相與分子間作用力極弱，趨于零。由于柱子不能很強(qiáng)保留分子，因此柱壽命長。（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相對分子質(zhì)量差別必須大于10％才能得以分離。尺寸排阻色譜被廣泛應(yīng)用于分析大分子物質(zhì)相對分子質(zhì)量的79

分離原理按分子大小順序進(jìn)行分離。其固定相為化學(xué)惰性多孔物質(zhì)——凝膠，它類似于分子篩，但孔徑比分子篩大。凝膠內(nèi)具有一定大小的孔穴。體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱。樣品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。分離原理80高效液相色譜課件81

4.7親和色譜法(Affinitychromatography,AC）

親和色譜是利用生物大分子和固定相表面存在某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性分離的一種方法。

在載體（無機(jī)或有機(jī)填料）表面先鍵合一種具有一般反應(yīng)性能的間隔臂（如環(huán)氧、聯(lián)氨等）；再連接上配基（酶、抗原或激素等）。這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子相互作用而被保留，沒有這種作用的分子不被保留。4.7親和色譜法(Affinitychromatogr82

親合色譜法示意圖親合色譜法示意圖83

5高效液相色譜法的選擇1分離類型的選擇

高效液相色譜法有多種分離類型，分析前首先應(yīng)根據(jù)樣品的性質(zhì)進(jìn)行選擇，標(biāo)準(zhǔn)液相色譜類型（液-固、液-液、及離子交換色譜）最適合的分子量范圍是20O～2000;如對于分子量較大且各組分的分子量間存在較大差別的樣品，應(yīng)考慮排阻色譜；對于可電離的化合物可考慮用離子交換色譜。化學(xué)鍵合相液-液分配色譜應(yīng)用得最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計(jì)3/4的HPLC分離工作是用以C18（ODS）、C8為固定相的反相高效液相色譜完成的，對于分子量<2000的樣品，反相高效液相色譜是最常用且非常有效的分離方法。5高效液相色譜法的選擇1分離類型的選擇84

液相色譜分離類型選擇參考表

相對分子質(zhì)量＞2000

不溶于水樣品

相對分子質(zhì)量溶于水，＜2000不離解

溶于水，可離解溶于水:離子與非離子：反相離子對色譜

溶于水———排阻色譜，水為流動(dòng)相不溶于水———排阻色譜，非水流動(dòng)相同系物———分配色譜異構(gòu)體——吸附色譜分子大小差異——排阻色譜反相液-液色譜排阻色譜，水為流動(dòng)相堿：陽離子交換色譜酸：陰離子交換色譜

液相色譜分離類型選擇參考表溶于水———排阻色85如何反相高效液相色譜分離？要求樣品在極性溶劑中能夠溶解。對于可電離的低分子量化合物，常通過加入弱酸、弱堿調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH的方法，使樣品分子以非解離型進(jìn)行分離。但應(yīng)注意流動(dòng)相的pH應(yīng)在固定相允許使用的范圍內(nèi)，因強(qiáng)堿性條件下會破壞固定相的基質(zhì)。在極性溶劑中有一定溶解的中等極性樣品，仍可采用反相高效液相色譜進(jìn)行分離。在極性溶劑中不能溶解的非離子型弱極性的樣品，需用有機(jī)溶劑為流動(dòng)相的硅膠吸附色譜或以極性鍵合相（如氨基或氰基鍵合相）為固定相的正相色譜進(jìn)行分離。如何反相高效液相色譜分離？要求樣品在極性溶劑中能夠溶解。對于862分離條件的選擇式中R——液相色譜分離度；n-柱效率，用理論塔板數(shù)來表示；a-溶劑效率，用固定相對某兩個(gè)混合物的分離能力來表示；K-容量因子（分配系數(shù)），在平衡狀態(tài)下組分在固定相的量與在流動(dòng)相中的量的比值。2分離條件的選擇式中R——液相色譜分離度；n-柱效率，用理87提高分離度，可采用如下途徑：（1）增加n。其他條件相同的情況下，增加n可以使色譜峰變窄。這可通過增加柱長或選用高效能的固定相來實(shí)現(xiàn)，但柱長增加分離時(shí)間也會增加，因而通過選用高效能的固定相較好。（2）增加a和K，即增大各組分在固定相上的保留時(shí)間差來提高分離度。a值的增加可通過選擇合適的固定相種類，提高固定相的選擇性或改變流動(dòng)相的組成來達(dá)到。當(dāng)改變流動(dòng)相的組成時(shí)，K值就隨之改變。

K減小，色譜峰向前移，分離度降低；K增加，色譜峰的流出時(shí)間增加，同時(shí)峰形變寬，分離度提高。但若K過大，不但分離時(shí)間拖得很長，而且峰形變平坦，影響分辨率和檢出靈敏度，K的有效范圍以a<K<5為宜。

提高分離度，可采用如下途徑：（1）增加n。其他條件相同的情況88高效液相色譜中常用“梯度洗脫”法，即在