微藻生物柴油的研究與應(yīng)用

污染和能源短缺對(duì)社會(huì)發(fā)展的影響越來(lái)越明顯，這不僅限制了經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展，而且可能會(huì)危及國(guó)家能源安全。開發(fā)可再生清潔能源對(duì)緩解能源、經(jīng)濟(jì)和環(huán)境危機(jī)具有多重意義。與其他可再生能源相比,生物能源來(lái)源豐富,具有可儲(chǔ)藏、可運(yùn)輸和可再生以及二次污染少等特點(diǎn)。生物能源可粗分三代:第一代主要以玉米、甘蔗和大豆等糧食作物為原料,因涉及糧食安全問(wèn)題倍受爭(zhēng)議;第二代以秸稈、枯草等非糧食原料生產(chǎn)燃料乙醇和生物柴油,因原料供應(yīng)不穩(wěn)定、運(yùn)輸成本高等限制,生產(chǎn)規(guī)模擴(kuò)大存在難度;第三代以藻類為原料生產(chǎn)燃料乙醇和生物柴油,在理論上開發(fā)潛力大、優(yōu)勢(shì)明顯而倍受關(guān)注。微藻是自然界起源最早、分布最廣、種類和數(shù)量最大的生物質(zhì)資源,在特定條件下可大量積累并儲(chǔ)藏油脂,其含量占到細(xì)胞干重的10%~50%,甚至更高。微藻作為生物柴油生產(chǎn)原料,與其他產(chǎn)油生物相比具有許多優(yōu)勢(shì)[3,4,7,8,9,10,11,12,13]。首先,微藻對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求簡(jiǎn)單,能適應(yīng)各種生長(zhǎng)環(huán)境,可避免與傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)爭(zhēng)奪耕地。其次,微藻無(wú)葉莖根分化,預(yù)處理成本相對(duì)較低,且在提取油脂后的藻渣還可生產(chǎn)其他高附加值產(chǎn)品。同時(shí),微藻光合作用效率高,一般1天內(nèi)生物量就可翻番,某些藻株(如萊茵衣藻和小球藻)甚至只需幾小時(shí),特別是在混養(yǎng)(自養(yǎng)+異養(yǎng))情況下其繁殖速率更快,通常培養(yǎng)周期不超過(guò)兩周。微藻可全年培養(yǎng)、不受季節(jié)限制,可保證生產(chǎn)原料的穩(wěn)定供應(yīng)。此外,微藻光合作用固定CO2,同時(shí)高效吸收廢水中氮磷等營(yíng)養(yǎng)鹽,降低水體富營(yíng)養(yǎng)化程度,具有很強(qiáng)的環(huán)境修復(fù)功能。從燃料角度,微藻生物柴油熱值高、點(diǎn)火性好,不含石蠟、低溫流動(dòng)性強(qiáng),可應(yīng)用于運(yùn)輸領(lǐng)域?？商娲裼陀糜诠卉嚒⑵囘\(yùn)輸,還可作為非道路用柴油機(jī)的替代燃料,應(yīng)用于海洋運(yùn)輸、水域動(dòng)力設(shè)備、地段礦業(yè)設(shè)備及燃料發(fā)電廠等領(lǐng)域。微藻生物柴油通用性好,無(wú)須改動(dòng)柴油機(jī)可直接添加使用。另一方面,微藻柴油含硫低、不含芳香族烷烴,作為替代能源可降低硫氧化物、烴類、一氧化碳等物質(zhì)的排放,屬于環(huán)境友好的可再生能源。盡管微藻生物柴油具有諸多優(yōu)勢(shì),但不可否認(rèn)迄今為止,其商業(yè)化生產(chǎn)在國(guó)內(nèi)外尚未實(shí)現(xiàn)。表觀上是由于生產(chǎn)成本太高導(dǎo)致的,實(shí)質(zhì)上卻是對(duì)生產(chǎn)過(guò)程的共性科學(xué)原理認(rèn)知不足、系列關(guān)鍵性技術(shù)尚未有效解決等眾多因素共同制約的。為此,作者針對(duì)微藻柴油生產(chǎn)主要環(huán)節(jié)的研究現(xiàn)狀予以概述,重點(diǎn)分析存在的主要問(wèn)題,并針對(duì)未來(lái)發(fā)展方向提出了自己的觀點(diǎn),目的推動(dòng)該產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。1微藻生物柴油的關(guān)鍵技術(shù)集成開發(fā)微藻生物柴油開發(fā)從微藻種質(zhì)資源獲得開始,到生產(chǎn)出合格制品涉及諸多環(huán)節(jié)的不同技術(shù)。例如:(1)生長(zhǎng)快、含油高、抗逆強(qiáng)等適宜于規(guī)?；こ膛囵B(yǎng)的優(yōu)良藻株篩選;(2)富油工程微藻基礎(chǔ)生物學(xué)特性研究;(3)能源微藻培養(yǎng)條件的優(yōu)化、過(guò)程控制與放大;(4)能源微藻種子的批量生產(chǎn)與穩(wěn)定供應(yīng);(5)能源微藻工業(yè)化生產(chǎn)設(shè)施研制與運(yùn)營(yíng);(6)敵害生物預(yù)警和防御體系建設(shè);(7)能源微藻多級(jí)采收及培養(yǎng)水體的循環(huán)利用;(8)富油微藻細(xì)胞破壁與油脂分離提取技術(shù);(9)微藻生物柴油制備及藻渣綜合加工利用等。上述微藻生物柴油開發(fā)的各個(gè)環(huán)節(jié)的不同技術(shù)之間,存在著相互交叉和牽連。某個(gè)環(huán)節(jié)的單項(xiàng)技術(shù)改變,將導(dǎo)致其他環(huán)節(jié)發(fā)生相應(yīng)調(diào)整,有時(shí)甚至重新設(shè)置整個(gè)流程工藝?？梢哉f(shuō),微藻生物柴油開發(fā)需要但不完全依賴于單一技術(shù),是多種技術(shù)的集成。在實(shí)際運(yùn)作中,需要結(jié)合具體藻種特性、培養(yǎng)地區(qū)自然條件、經(jīng)濟(jì)和人力資源狀況,針對(duì)各環(huán)節(jié)所存在的多種技術(shù),經(jīng)過(guò)反復(fù)考察評(píng)估、拼接、取舍和組裝,才能建立適宜的開發(fā)流程。盡管如此,微藻生物柴油開發(fā)重點(diǎn)依靠于基礎(chǔ)科學(xué)原理和關(guān)鍵技術(shù)體系突破,概括為如下4點(diǎn):優(yōu)質(zhì)藻種的篩選和改良、微藻細(xì)胞高密度培養(yǎng)優(yōu)化與放大、微藻采收和油脂提取加工、微藻生物質(zhì)資源的綜合開發(fā)利用。其中,優(yōu)良產(chǎn)油微藻篩選是微藻生物柴油各項(xiàng)工作的基礎(chǔ),而基因工程改良技術(shù)是獲得優(yōu)質(zhì)藻株的重要手段;培養(yǎng)優(yōu)化與規(guī)模放大技術(shù)是保障微藻生物柴油產(chǎn)業(yè)化成功的核心;而后期藻體的采收、油脂提取、制備過(guò)程能耗控制是降低成本的關(guān)鍵,高附加值產(chǎn)品開發(fā)是產(chǎn)業(yè)化運(yùn)營(yíng)的重要輔助舉措。2優(yōu)質(zhì)微藻篩選及優(yōu)良產(chǎn)品培訓(xùn)2.1油脂質(zhì)量和抗高溫3.2藻株富油藻種的選育是微藻柴油生產(chǎn)流程的第一步,也是微藻能源開發(fā)的基礎(chǔ)與核心,對(duì)提高微藻產(chǎn)油效率和降低成本起著決定性作用。自1978年美國(guó)啟動(dòng)“水生物種計(jì)劃——藻類生物柴油(簡(jiǎn)稱ASP)”以來(lái),藻種選育一直是微藻能源發(fā)展致力突破的命題。在國(guó)外,尤其發(fā)達(dá)國(guó)家非常重視微藻的篩選工作。國(guó)外微藻種質(zhì)庫(kù)主要有美國(guó)的CCMP、ATCC、英國(guó)的CCAP、日本的IAM、澳大利亞的CCLM、挪威的NIVA、加拿大的NEPCC和UTCC、德國(guó)的CCAC等。近年來(lái),我國(guó)對(duì)此十分重視,從國(guó)家層面先后啟動(dòng)多項(xiàng)任務(wù),從科技部863探索課題和863重點(diǎn)項(xiàng)目、973項(xiàng)目,以及國(guó)家海洋局公益課題、中科院太陽(yáng)能計(jì)劃、中科院和中石化聯(lián)合項(xiàng)目,到“十二五”期間的科技部支撐計(jì)劃、科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)和國(guó)家海洋局可再生能源專項(xiàng),能源微藻分離篩選均為重要研究?jī)?nèi)容。微藻是否具備高產(chǎn)油能力,需根據(jù)生物產(chǎn)量及總脂(特別是中性脂)含量等綜合評(píng)估,目前研究最多的是綠藻和硅藻[6,9,10,11,14,16,19,20,21,22,23,24,25],如斜生柵藻、小球藻、微擬球藻、杜氏鹽藻、三角褐指藻、布朗葡萄藻等。此外金藻也是富油較多的微藻類群。微藻油脂含量大多在30%~50%之間,最高可達(dá)干重80%。除了油脂含量,油脂質(zhì)量也很關(guān)鍵。在油脂組成上中性脂多易于生物柴油制備,其中碳鏈長(zhǎng)度在14~18的中性脂肪酸最好。同時(shí),產(chǎn)油微藻藻株必須具備快速生長(zhǎng)特性,只有快速生長(zhǎng)的種類才能耐污染,更易于實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)和取得生物量。沒(méi)有生物量的微藻即使有理想的油脂含量,也難以成為優(yōu)質(zhì)藻株。應(yīng)當(dāng)指出,生長(zhǎng)快的微藻個(gè)體一般較小,體積小雖有利于懸浮培養(yǎng),卻不易于后期細(xì)胞采收。在考察優(yōu)良產(chǎn)油藻株時(shí),不可忽視那些個(gè)體較大(特別是絲狀)的微藻,只要其含油量較高,即使其細(xì)胞生長(zhǎng)并不很快,由于易于采收,可減少收獲過(guò)程的能耗和微藻柴油制備成本,有可能成為理想的工程藻株。抗逆能力是藻株篩選中重點(diǎn)考察的指標(biāo)。盡管某些富油微藻在室內(nèi)人工培養(yǎng)條件下可較好地生長(zhǎng),但是其最適溫度和光照強(qiáng)度范圍過(guò)窄,對(duì)環(huán)境要求苛刻,卻很難實(shí)現(xiàn)戶外大規(guī)模擴(kuò)大培養(yǎng)。在戶外光照強(qiáng)度和溫度都隨著季節(jié)、太陽(yáng)升降和天氣等出現(xiàn)很大變化,因此抗逆能力較弱的藻株在規(guī)?；瘧敉馀囵B(yǎng)中,難以達(dá)到實(shí)驗(yàn)室預(yù)期效果。相反,最適溫度和光照強(qiáng)度范圍較寬的藻株,能更好地適應(yīng)變化的環(huán)境條件,而易于取得較好的培養(yǎng)效果。另外,高溫、高堿、高鹽等極端環(huán)境條件,在對(duì)產(chǎn)油藻株產(chǎn)生脅迫的同時(shí),也不利于其他雜藻和敵害生物的生長(zhǎng)繁殖。利用高耐受性產(chǎn)油藻株對(duì)極端環(huán)境的耐受性,選擇在特定地區(qū)和特定極端條件下開展微藻的大規(guī)模培養(yǎng),可最大限度降低雜藻和敵害生物的侵染,保證產(chǎn)油微藻的單種培養(yǎng)。因此,可耐受極端環(huán)境(如高溫、高pH和高鹽度)的富油藻株通常屬于理想的工程微藻。對(duì)極端溫度的耐受有耐高溫和耐低溫。就開發(fā)微藻生物柴油而言,耐高溫藻株比耐低溫藻株更應(yīng)值得關(guān)注。首先,高溫有利于飽和脂肪酸的合成,飽和脂肪酸更利于生物柴油開發(fā);而低溫(甚至冷凍)條件則更適宜藻細(xì)胞中不飽和脂肪酸的累積,不飽和脂肪酸有利于藻類細(xì)胞維持膜流動(dòng)性、保障生理生化功能,也有助于開發(fā)高附加值產(chǎn)品,但卻不利于生物柴油的制備。其次,在微藻規(guī)?；瘧敉馀囵B(yǎng)過(guò)程中,水體溫度很容易隨著日光照射快速升高,并且人工升溫較降溫而言更容易、能耗也少;同時(shí),在低溫區(qū)域規(guī)模培養(yǎng)微藻還易遭受冷凍結(jié)冰問(wèn)題困擾,導(dǎo)致培養(yǎng)設(shè)施發(fā)生損壞。另外,低溫通常伴隨著低光照條件,而低光照難以維持高微藻生物產(chǎn)量?；谏鲜鲈?建議更多關(guān)注耐高溫富油微藻的篩選。相對(duì)于海水以及咸水富油微藻,淡水微藻具有更多樣的生物類群,在室內(nèi)小規(guī)模培養(yǎng)中,其細(xì)胞生長(zhǎng)速度理論上也高于海水微藻和咸水微藻。以往我國(guó)微藻的篩選工作大多以淡水微藻為主,海洋微藻相對(duì)較少,且近岸多于近海。從國(guó)外微藻種質(zhì)庫(kù)所收集到的信息也可看到類似的情況。從微藻能源產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景分析,未來(lái)更應(yīng)關(guān)注海水微藻,其次是咸水微藻,淡水微藻中更需關(guān)注可在污水環(huán)境中生長(zhǎng)的微藻類群。這主要取決于現(xiàn)階段微藻培養(yǎng)的細(xì)胞密度還較低,每升藻液達(dá)到0.5~1.0g已實(shí)屬不易。也就是說(shuō),生產(chǎn)1噸微藻至少要上千噸水來(lái)維持,這在淡水資源稀少的任何國(guó)家都是難以允可,其經(jīng)濟(jì)成本也難以承受。因此,利用豐富而廉價(jià)的海水、咸水資源,或結(jié)合污水凈化處理進(jìn)行微藻生物柴油開發(fā)才具有可行性。就海水能源微藻篩選而言,不僅要關(guān)注沿岸和近海海洋微藻,更應(yīng)關(guān)注大洋微藻種質(zhì)。原因在于:大洋海域遠(yuǎn)離人類密集活動(dòng)的陸地,其水質(zhì)多呈寡營(yíng)養(yǎng)和低無(wú)機(jī)碳狀態(tài),微藻長(zhǎng)期在該環(huán)境中生存繁衍并成為優(yōu)勢(shì)種群,推測(cè)其在生理特性上存在著有別于其他藻株的特殊濃縮機(jī)制,有可能分離出快速生長(zhǎng)藻株;寡營(yíng)養(yǎng)環(huán)境通常是微藻產(chǎn)油的基本條件,從大洋海域獲得的藻株可能兼具高產(chǎn)油特性;大洋海域光照強(qiáng)、海溫高、通透性大,從中有希望獲得抗逆性強(qiáng)的微藻藻株。優(yōu)良能源微藻篩選還需考慮諸多其他因素,如細(xì)胞大小、細(xì)胞壁厚度、抗剪切能力、破碎難度、耐低pH或高CO2能力等。需要指出目前產(chǎn)油微藻篩選尚缺少統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。在藻種不一、培養(yǎng)方式和參數(shù)各異、油脂分析方法不固定的情況下,很難科學(xué)客觀地比較不同藻株繁殖和產(chǎn)油能力。比如,油脂分析包括化學(xué)溶劑提取總脂分析檢測(cè)、氣相色譜檢測(cè),尼羅紅等熒光染色結(jié)合熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)等多種方法,不同檢測(cè)方法所得的脂質(zhì)含量和組成存在較大差別。尼羅紅染色測(cè)定油脂時(shí),不同藻株對(duì)染料的吸收能力存在很大差異,需控制好染色條件,否則藻株對(duì)染料吸收能力的波動(dòng)將影響結(jié)果的精確性。同樣,細(xì)胞破碎和萃取油脂是否完全、油脂是否被氧化等也在很大程度上影響測(cè)定結(jié)果。為此,有必要建立統(tǒng)一的提取與檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn),客觀比較藻株的真實(shí)產(chǎn)油能力,為篩選優(yōu)良藻株打下基礎(chǔ)。2.2微藻細(xì)胞脂質(zhì)積累調(diào)節(jié)機(jī)制盡管自然界微藻種質(zhì)分布廣、數(shù)量大、多樣性高,但從中篩選到滿足產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)需求的超級(jí)藻株卻存在很大的盲目性。事實(shí)上,從上世紀(jì)70年代開始,美國(guó)ASP計(jì)劃用長(zhǎng)達(dá)20年的時(shí)間,對(duì)3000多個(gè)水生藻種的產(chǎn)油能力進(jìn)行了系統(tǒng)性研究,然而很遺憾尚未有一個(gè)藻種符合諸多標(biāo)準(zhǔn),可直接用于生物柴油產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展,通過(guò)基因工程和代謝工程手段,為有針對(duì)性的培育優(yōu)質(zhì)藻種帶來(lái)了希望。通過(guò)基因工程技術(shù)有針對(duì)地改變微藻細(xì)胞結(jié)構(gòu),定向改良藻株的特定性狀(例如如光合效率、生長(zhǎng)速度、抗逆性以及油脂產(chǎn)量等),調(diào)控微藻脂肪酸的合成途徑,提高脂肪酸合成能力,培育生物產(chǎn)量和油脂含量更高的工程藻株已成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)[7,10,18,21,23,25]。借助人工篩選出的優(yōu)良產(chǎn)油藻株,在大量基礎(chǔ)生物學(xué)(如基因組學(xué),轉(zhuǎn)錄組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝網(wǎng)絡(luò)等多個(gè)學(xué)科)研究基礎(chǔ)上,通過(guò)RNAi干擾、基因敲除等技術(shù),實(shí)現(xiàn)表達(dá)目標(biāo)產(chǎn)物合成酶基因過(guò)表達(dá),以及阻斷某些代謝通路等途徑,也有希望培育出生長(zhǎng)更快、產(chǎn)油效率更高的產(chǎn)油微藻工程藻株。而到目前為止,人們對(duì)微藻細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)及其他高附加值產(chǎn)品的代謝機(jī)制仍不十分清楚。在其他高等植物中基因工程和代謝工程研究已取得了一定進(jìn)展,且研究發(fā)現(xiàn)微藻細(xì)胞與高等產(chǎn)油植物體內(nèi)脂質(zhì)的合成途徑基本一致。因此,借鑒同源分析和已有研究結(jié)果,將有助于工程微藻應(yīng)用開發(fā)與基因改良。與其他生物一樣,微藻細(xì)胞脂質(zhì)的積累調(diào)節(jié)機(jī)制異常復(fù)雜。目標(biāo)基因在過(guò)表達(dá)的同時(shí),可能還受到其他信號(hào)的負(fù)反饋調(diào)控抑制,導(dǎo)致過(guò)表達(dá)效果被緩沖稀釋。因此針對(duì)某一特定基因的改造,對(duì)脂質(zhì)積累作用通常十分有限。關(guān)鍵酶分離只是改良的第一步,接下來(lái)還需弄清微藻細(xì)胞具體合成代謝機(jī)制,在分子水平對(duì)微藻的不斷改良,才可能獲得高效優(yōu)質(zhì)的工程微藻。3油中的微藻培養(yǎng)和規(guī)模改進(jìn)3.1營(yíng)養(yǎng)鹽濃度與微藻生長(zhǎng)的關(guān)系微藻產(chǎn)油效率主要取決于其含油量與生長(zhǎng)速率,二者通常呈負(fù)相關(guān)性,細(xì)胞大量積累油脂過(guò)程常伴隨生長(zhǎng)速度的下降。除藻種自身原因外,決定微藻產(chǎn)油效率(微藻含油量和生長(zhǎng)速率的乘積)最大和更直接的在于微藻培養(yǎng)。微藻培養(yǎng)看似簡(jiǎn)單,但有效控制諸多復(fù)雜因素,將微藻(尤其規(guī)?；?培養(yǎng)好,發(fā)揮其最大產(chǎn)油效率卻不易把握。需要深入認(rèn)知培養(yǎng)過(guò)程中存在的共性和個(gè)性問(wèn)題,在此基礎(chǔ)上不斷優(yōu)化才能建立培養(yǎng)模式條件。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)微藻的認(rèn)知大多源自一次(或間歇)性懸浮培養(yǎng)[32,33,34,35,36,37,38,39]。該培養(yǎng)的結(jié)論比較直觀,但與優(yōu)化培養(yǎng)條件之間尚存在很大差距。具體表現(xiàn)在:(1)對(duì)培養(yǎng)過(guò)程動(dòng)態(tài)分析不足。最佳營(yíng)養(yǎng)鹽濃度通常指培養(yǎng)起始濃度,該濃度隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)迅速下降;同時(shí)最佳細(xì)胞生長(zhǎng)(或油脂積累)量也只是某一特定時(shí)間的結(jié)果。這樣得到的結(jié)論只是整個(gè)培養(yǎng)期間的平均生長(zhǎng)速率與營(yíng)養(yǎng)鹽開始濃度之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系,缺少瞬時(shí)生長(zhǎng)速率與屆時(shí)營(yíng)養(yǎng)鹽濃度之間真正的對(duì)應(yīng)關(guān)系。(2)從定性角度講,低氮(磷)濃度有利于油脂積累、但不利于生物量增加。但是從定量角度上,對(duì)決定微藻從生長(zhǎng)階段向油脂積累階段轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵濃度并不清晰,難以有的放矢地控制營(yíng)養(yǎng)鹽濃度。(3)考察某一因素對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)(或油脂積累)作用時(shí),通常未排除其他因素的干擾,難免得到偏差、膺像,甚至錯(cuò)誤的結(jié)論。(4)無(wú)論色素含量、細(xì)胞大小和密度、單位細(xì)胞所接受的光照量、其他生理生化指標(biāo)、細(xì)胞代謝產(chǎn)物及調(diào)控水平等各類參數(shù)指標(biāo),在微藻培養(yǎng)過(guò)程中均存在動(dòng)態(tài)變化,且上述各參數(shù)間也存在錯(cuò)綜復(fù)雜的相互作用,需仔細(xì)分析甄別,才能從中找出真正的限制性因素。換言之,在微藻培養(yǎng)中僅謀求木桶長(zhǎng)板是不夠的,更重要的是找到限制木桶容量的短板并加以彌補(bǔ);并且短板常常是相對(duì)的,在某一短板被彌補(bǔ)后又會(huì)出現(xiàn)新的替代短板。因此,要維持微藻培養(yǎng)最佳效果,并有效挖掘微藻產(chǎn)油潛力,需對(duì)短板進(jìn)行循環(huán)定位并加以彌補(bǔ),維持培養(yǎng)體系的整體平衡。微藻群體與個(gè)體之間的復(fù)雜關(guān)系尚需進(jìn)一步闡明。比如:光照強(qiáng)度通常只是培養(yǎng)體系表面光強(qiáng),沒(méi)有綜合考慮細(xì)胞密度、培養(yǎng)體系類型、光耗散、光徑及細(xì)胞穿梭節(jié)律等因素的作用。群體與個(gè)體間的差異與相互依賴關(guān)系不清晰,難以剖析微藻細(xì)胞究竟處于光抑制還是光不足狀態(tài)。尚需結(jié)合攪拌速率、培養(yǎng)設(shè)備類型、細(xì)胞密度及氣流液流等因素綜合分析,將群體問(wèn)題平均到個(gè)體水平考察,可更準(zhǔn)確闡述相關(guān)規(guī)律并采取相應(yīng)措施。未來(lái)能源微藻的規(guī)?；a(chǎn)不可能完全脫離光自養(yǎng)培養(yǎng),而室外光照強(qiáng)度、溫度等因素均隨季節(jié)、日出日落、云量等呈現(xiàn)非典型性周期震蕩。應(yīng)結(jié)合活體快速檢測(cè)技術(shù)(如葉綠素?zé)晒庵参镄史治?等,準(zhǔn)確分析把握各參數(shù)瞬間變化產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)影響。只有對(duì)上述動(dòng)態(tài)變化規(guī)律有了充足認(rèn)識(shí),才能在實(shí)際培養(yǎng)中有的放矢,保障培養(yǎng)體系高效穩(wěn)定的生產(chǎn)。3.2培養(yǎng)方式的選擇微藻規(guī)模培養(yǎng)是微藻生物柴油生產(chǎn)的關(guān)鍵,目前培養(yǎng)主要有開放式和封閉式兩大系統(tǒng)。開放式培養(yǎng)系統(tǒng)一般建于室外,多以自然光為光源和熱源,具有建設(shè)成本低廉、能源投入少、易于清洗等特點(diǎn),其中以環(huán)形跑道式培養(yǎng)池最為常見。開放池多用葉輪轉(zhuǎn)動(dòng)方式維持藻液的循環(huán)混合,防止藻體沉淀,提高藻體光能利用率。為降低污染和水分蒸發(fā),生產(chǎn)中常在培養(yǎng)池體上覆蓋透光膜。開放池在微藻規(guī)模培養(yǎng)中已有廣泛應(yīng)用,培養(yǎng)體積通常從噸級(jí)到數(shù)百噸不等。其不足在于占地面積大,光溫控制難度高、藻細(xì)胞生長(zhǎng)易受環(huán)境變化影響、生物產(chǎn)率低等,可培養(yǎng)的藻株種類有限。此外該系統(tǒng)培養(yǎng)過(guò)程易受雜藻、菌類等敵害生物污染,培養(yǎng)穩(wěn)定性較差。封閉式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)運(yùn)行相對(duì)穩(wěn)定,光利用率高,培養(yǎng)條件易于人工控制,可實(shí)現(xiàn)微藻高密度培養(yǎng),其最大不足是建設(shè)和運(yùn)行成本較高。兩種培養(yǎng)系統(tǒng)各具優(yōu)缺點(diǎn),在生產(chǎn)上選擇哪種培養(yǎng)方式需依據(jù)藻的特性、產(chǎn)品定位、經(jīng)濟(jì)實(shí)力等情況進(jìn)行抉擇。通常生長(zhǎng)快或抗逆的微藻采用開放式培養(yǎng)池培養(yǎng),相反細(xì)胞生長(zhǎng)慢、抗逆性弱的微藻采用封閉式光生物反應(yīng)器培養(yǎng);產(chǎn)品價(jià)位相對(duì)較低、對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量要求不高的采用開放式培養(yǎng)池培養(yǎng),而產(chǎn)品價(jià)位較高、對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量要求嚴(yán)格的采用封閉式光生物反應(yīng)器培養(yǎng);在生產(chǎn)上,規(guī)模較小的微藻種子培養(yǎng)采用封閉式反應(yīng)器系統(tǒng),以獲得較高的單位體積生物量,而規(guī)模放大則采用開放池培養(yǎng)。上述兩種體系各有優(yōu)、缺點(diǎn),有效組合模式可相互彌補(bǔ)其不足,已被很多產(chǎn)業(yè)部門接受,也將適宜于微藻生物能源開發(fā)。另外,新近研制出一種介于二者之間的培養(yǎng)模式,其最大特點(diǎn)是將藻液混勻所剩余的能量用于藻體收獲,可有效降低能耗。其基本構(gòu)思是:在培養(yǎng)裝置一端設(shè)節(jié)律性起降裝置,該裝置產(chǎn)生波浪,在波向外傳導(dǎo)過(guò)程中實(shí)現(xiàn)藻液混勻;當(dāng)波傳播到光生物反應(yīng)器另一端時(shí)收集剩余能量,利用該能量將藻液擠入帶有瓣膜閥門的細(xì)管中,不斷提升藻液水位,然后在重力作用下藻液經(jīng)微孔濾膜完成固液分離,過(guò)濾液重新返回到培養(yǎng)體系中,而濃縮藻體收集后加工。該培養(yǎng)模式目前尚需不斷完善。3.3光生物反應(yīng)器的應(yīng)用情況用于微藻培養(yǎng)的光生物反應(yīng)器與發(fā)酵生物反應(yīng)器基本原理和結(jié)構(gòu)類似,主要通過(guò)溫度、溶解氧、CO2、pH值等培養(yǎng)條件調(diào)節(jié)與控制,實(shí)現(xiàn)優(yōu)化培養(yǎng)并獲得更多的生物產(chǎn)品。光生物反應(yīng)器與發(fā)酵用反應(yīng)器最大不同在于研制材料一般是透光的,或者需要內(nèi)置光源提供光照。具有透光性的材料目前主要局限在玻璃、有機(jī)玻璃和塑料等,其他材質(zhì)通常透光性很差或根本不具備透光性。一般而言,透光材料的抗壓性和耐高溫性能都較差,難以采用高溫高壓方式滅菌消毒。透光材料的上述特性導(dǎo)致光生物反應(yīng)器研制、放大等受到了很大限制。采用內(nèi)置式光源可擺脫上述限制,對(duì)生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品而言也是可行的。但是對(duì)于微藻能源生產(chǎn)而言,內(nèi)置式光源僅適用于種子培養(yǎng),在后期規(guī)?；a(chǎn)中其總能量?jī)羰罩樨?fù)值而失去意義。目前應(yīng)用較多的光生物反應(yīng)器有垂直柱狀反應(yīng)器、平板式反應(yīng)器和管道式反應(yīng)器等形式,每種光生物反應(yīng)器都有各自的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)。垂直柱狀光生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)簡(jiǎn)潔緊湊,具有高生物質(zhì)轉(zhuǎn)化和低能耗的特點(diǎn)。其移動(dòng)性強(qiáng),剪應(yīng)力低且混合好,光抑制和光氧化少,有較廣的適應(yīng)范圍。該系統(tǒng)易于微藻固定化培養(yǎng),也較易消毒滅菌,適宜于微藻規(guī)?；囵B(yǎng)。但此類型反應(yīng)器表面光照面積隨規(guī)模擴(kuò)大而迅速減少。每個(gè)柱狀光生物反應(yīng)器單元的培養(yǎng)體積在幾十升到幾百升規(guī)模時(shí),其細(xì)胞培養(yǎng)效果較好。平板式光生物反應(yīng)器有較大的照射面積、光徑好,光能利用率和生產(chǎn)效率都較高,成本相對(duì)較低,是最適宜室外規(guī)模化微藻培養(yǎng)的光生物反應(yīng)器之一。但平板式光生物反應(yīng)器的規(guī)?；a(chǎn)需大量材料支持,生產(chǎn)擴(kuò)大難度較高。其溫度控制難度大,并有一定程度貼壁生長(zhǎng)、清洗難度大。同樣,每個(gè)平板光生物反應(yīng)器單元的培養(yǎng)體積在幾十升到百升級(jí)規(guī)模時(shí),可獲得較好的培養(yǎng)效果。管道式光生物反應(yīng)器受光面積較大,適于戶外培養(yǎng),相對(duì)高產(chǎn),成本也較低。該系統(tǒng)可保持很高的表面積比,但同時(shí)占地面積大,其傳質(zhì)特性較差,需與脫氣罐連接排除培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的氧氣,并定時(shí)補(bǔ)充CO2以穩(wěn)定pH值。其次該系統(tǒng)控溫難度較大,而目前配置恒溫系統(tǒng)成本很高。此外,該反應(yīng)器培養(yǎng)過(guò)程藻細(xì)胞易貼壁,需研發(fā)專有清洗系統(tǒng),連續(xù)或間歇性清除貼壁細(xì)胞,保持其透光度和培養(yǎng)效果,避免不斷拆除和消毒等操作所造成的大量材料、人力和時(shí)間浪費(fèi)。通常,管道光生物反應(yīng)器培養(yǎng)體積在百升到噸級(jí)規(guī)模時(shí),有比較理想的培養(yǎng)效果。總之,光生物反應(yīng)器在微藻的大規(guī)模培養(yǎng)中具備眾多優(yōu)勢(shì)而倍受關(guān)注,其規(guī)模放大是微藻規(guī)模培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié),難點(diǎn)在于如何保持光利用、溫度、混合、氣體交換、傳質(zhì)等特性的穩(wěn)定。如何在反應(yīng)器原理和結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)上進(jìn)行突破和改進(jìn),保證光傳輸與均勻分布,從根本上解決光反應(yīng)器占地大、投資比重大及操作能耗高等問(wèn)題仍將是未來(lái)研究重點(diǎn)。3.4微藻的生物處理藻類細(xì)胞可液體懸浮培養(yǎng)和固定化培養(yǎng)。固定化培養(yǎng)可改善藻體自身的代謝調(diào)控、提升藻細(xì)胞功能,有效提高光合生長(zhǎng)速率及油脂含量,是提高微藻產(chǎn)油率的有效途徑。將固定于聚苯乙烯載體的微藻置于污水中培養(yǎng),采用刮板法收獲藻細(xì)胞,可獲得較理想的生物量和脂肪酸含量,去除污水中總氮、總磷的效果良好。固定化技術(shù)可在一定程度上降低收獲成本、避免輪蟲等敵害生物攝食,其固定化培養(yǎng)載體可重復(fù)利用。如將微藻固定化與污水處理技術(shù)偶聯(lián),其綜合應(yīng)用效果將顯著優(yōu)于游離培養(yǎng),為進(jìn)一步探索方向。3.5雜藻入侵引發(fā)的污染源敵害生物污染問(wèn)題在小規(guī)模微藻培養(yǎng)中并不突出,但在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中,隨著培養(yǎng)規(guī)模的逐步擴(kuò)大其危害愈發(fā)嚴(yán)重。危害微藻培養(yǎng)的敵害生物很多,其繁殖與攝食能力強(qiáng),常常為微藻生長(zhǎng)速率的數(shù)百甚至千萬(wàn)倍,主要包括原生動(dòng)物和后生動(dòng)物,如輪蟲、纖毛蟲、鹵蟲、變形蟲、昆蟲幼蟲(如孑孓)等。以危害微藻工程培養(yǎng)的纖毛蟲為例,藻種接種后的2~3d便可能出現(xiàn),輕者影響微藻的生長(zhǎng),重者因纖毛蟲的吞噬將出現(xiàn)藻細(xì)胞數(shù)量的急劇下降。輪蟲繁殖速度快、攝食能力強(qiáng),一旦發(fā)生污染,幾天時(shí)間內(nèi)可將培養(yǎng)的微藻全部食光。輪蟲在微藻培養(yǎng)中主要有3方面危害,其一輪蟲大量繁殖引起水體溶氧急劇下降、代謝氨和毒素大量積累并導(dǎo)致水質(zhì)惡化;其二輪蟲大量吞食微藻細(xì)胞,據(jù)計(jì)算1個(gè)輪蟲每天能攝食數(shù)萬(wàn)個(gè)微藻細(xì)胞。因此,一旦規(guī)?；⒃迮囵B(yǎng)體系中發(fā)生輪蟲污染,將很可能引起微藻細(xì)胞密度的迅速下降,最終致使整個(gè)培養(yǎng)失敗。此外,輪蟲、鹵蟲以及變形蟲等敵害生物繁殖產(chǎn)生大量卵,它們?cè)谏a(chǎn)養(yǎng)殖中很難徹底清除,可能成為下次培養(yǎng)的污染源,形成惡性循環(huán)。雜藻入侵也是微藻大規(guī)模培養(yǎng)中的重要敵害。微藻生長(zhǎng)通常與產(chǎn)油呈負(fù)相關(guān)性,在微藻油脂積累過(guò)程中,其細(xì)胞生長(zhǎng)速率呈現(xiàn)下降,這時(shí)其他某些生長(zhǎng)快但不產(chǎn)油的微藻(簡(jiǎn)稱雜藻)入侵后易成為優(yōu)勢(shì)種,降低培養(yǎng)體系的產(chǎn)油效率和微藻產(chǎn)品質(zhì)量。同時(shí),雜藻污染后必然與能源微藻競(jìng)爭(zhēng)二氧化碳、光能和營(yíng)養(yǎng),最終使能源微藻生長(zhǎng)更慢。另外,雜藻與原生動(dòng)物一樣,作為污染源可長(zhǎng)期影響能源微藻培養(yǎng)周圍環(huán)境,制約微藻培養(yǎng)規(guī)模擴(kuò)大和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。微藻規(guī)模化培養(yǎng)涉及環(huán)節(jié)眾多,無(wú)論開放式系統(tǒng)還是封閉式光生物反應(yīng)器培養(yǎng),都難以杜絕來(lái)自水源、空氣、肥料、儀器、培養(yǎng)管道和容器(或光反應(yīng)器)等的敵害生物,有時(shí)前期培養(yǎng)的藻種就已污染了敵害生物。因此如果管理措施不到位,發(fā)生敵害生物污染不可避免,而且一旦出現(xiàn)污染即使耗時(shí)費(fèi)力也難以根除。對(duì)敵害生物的防治需要先對(duì)物料嚴(yán)格消毒處理,有效阻斷污染源傳入途徑。目前國(guó)內(nèi)外在消毒凈化處理上常用的主要有臭氧、紫外線、次氯酸鈉、物理過(guò)濾等方法。在規(guī)模擴(kuò)大培養(yǎng)中,對(duì)藻種純度的控制可通過(guò)微孔過(guò)濾和尼龍網(wǎng)隔離等手段,該技術(shù)能有效清除大型的食藻動(dòng)物,但對(duì)于個(gè)體很小的卻難以去除。原生動(dòng)物和藻類都為真核單細(xì)胞生物,在使用藥物清除原生動(dòng)物時(shí),很難保證對(duì)產(chǎn)油微藻生長(zhǎng)不產(chǎn)生傷害。以往有通過(guò)降低藻液pH值至3.0殺死金藻液和扁藻液中的尖鼻蟲、使用次氯酸鈉治理小新月菱形藻中鞭毛蟲污染的報(bào)道。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中,甲醛、氨水、過(guò)氧化氫等也常被用來(lái)處理原生動(dòng)物污染。但上述方法專一性不強(qiáng),在殺死原生動(dòng)物的同時(shí)也嚴(yán)重制約了微藻生長(zhǎng)。奎寧作為抗瘧疾特效藥可殺滅鹽藻培養(yǎng)中的纖毛蟲,然而在大規(guī)模培養(yǎng)中使用的成本太高。國(guó)內(nèi)外輪蟲防治的方法包括:①Cu、Zn、Cd、Pb等對(duì)輪蟲具有高毒性的金屬離子,其24h的半致死濃度通常在1mg/L左右。②有機(jī)磷類,氨基甲酸類等農(nóng)藥。上述2種方法只考慮了脅迫對(duì)輪蟲的影響,而未考慮對(duì)微藻生長(zhǎng)繁殖及產(chǎn)品質(zhì)量影響。③病毒與真菌:20世紀(jì)90年代,Comps等人從養(yǎng)殖場(chǎng)死亡的輪蟲體內(nèi)分離到病毒和真菌(海洋雙RNA病毒和鏈壺菌),通過(guò)實(shí)驗(yàn)將其感染輪蟲,證明這類病毒和真菌可使輪蟲種群數(shù)量減少、懷卵率降低。綜上所述,敵害生物問(wèn)題限制著能源微藻產(chǎn)業(yè)發(fā)展,目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)有效避免敵害生物入侵和治理技術(shù),急需探討成本低、專一性強(qiáng)且對(duì)藻類毒性小的技術(shù)方法。3.6混養(yǎng)模式與特性根據(jù)對(duì)光源和碳源的需求可將微藻營(yíng)養(yǎng)方式分為光自養(yǎng)、光異養(yǎng)、化能自養(yǎng)、化能異養(yǎng)和混合營(yíng)養(yǎng)等方式。許多微藻既可進(jìn)行光自養(yǎng)亦可異養(yǎng)生長(zhǎng),甚至混養(yǎng)。自養(yǎng)方式能直接利用陽(yáng)光、CO2等自然資源,充分利用非農(nóng)耕土地(如荒漠和鹽堿地),其最大不足在于藻細(xì)胞密度和生長(zhǎng)速度相對(duì)較低。添加有機(jī)碳源的異養(yǎng)方式可有效提高藻體密度和油脂含量,但添加碳源不僅增加生產(chǎn)成本,同時(shí)也增加染菌幾率。混養(yǎng)模式中藻體兼有光合和利用有機(jī)物的2種代謝方式,可結(jié)合反應(yīng)器光、暗區(qū)設(shè)計(jì)或光暗比調(diào)控,通過(guò)對(duì)不同碳源的分配調(diào)控,使形成光下固定CO2和光能、暗處應(yīng)用有機(jī)碳源和O2的混合生長(zhǎng)模式,最大化促進(jìn)產(chǎn)油微藻的生物質(zhì)積累。從能量收支平衡角度而言,光自養(yǎng)方式是獲得能源的最根本途徑,未來(lái)能源微藻開發(fā)也難以完全脫離光自養(yǎng);而從細(xì)胞生長(zhǎng)和油脂積累角度考慮,異養(yǎng)培養(yǎng)更有效,可適宜于微藻種子培養(yǎng)。研發(fā)兼養(yǎng)或異養(yǎng)與自養(yǎng)的組合技術(shù),將有助于推動(dòng)能源微藻產(chǎn)業(yè)發(fā)展。3.7理化因子對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)和油脂積累的影響微藻培養(yǎng)中涉及的理化因子很多,有光強(qiáng)、鹽度、pH值,以及氮、磷、鐵等營(yíng)養(yǎng)鹽濃度,它們直接影響著微藻的營(yíng)養(yǎng)代謝。從能源生產(chǎn)角度研究藻細(xì)胞生長(zhǎng)及油脂積累的關(guān)系,可最大程度優(yōu)化培養(yǎng)效果。這方面目前所做的研究大多停留在宏觀方面,隨著分子技術(shù)的發(fā)展,由宏觀水平轉(zhuǎn)向分子水平探討理化因子對(duì)藻細(xì)胞合成代謝的影響機(jī)制將成為研究重點(diǎn)。理化因子對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)及油脂含量的影響分為適宜模式和脅迫模式。前者通過(guò)維持適宜的理化條件,促使藻細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)增殖,以高生物量的獲得提高油脂產(chǎn)率;后者通過(guò)脅迫作用,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)持續(xù)積累,從提高油脂含量的角度提高油脂產(chǎn)率。營(yíng)養(yǎng)脅迫對(duì)油脂積累的促進(jìn)作用受到很多關(guān)注,尤其在氮限制與油脂含量的研究已發(fā)表很多文章[2,3,6,9,10,20,25,47,48,49]。兩種模式從不同角度探討了提高油脂產(chǎn)率,事實(shí)上只有適宜模式才能真正提高油脂總產(chǎn)率。油脂產(chǎn)率與藻細(xì)胞總量密切相關(guān),脅迫模式下油脂的積累以犧牲細(xì)胞生長(zhǎng)為代價(jià),單純的營(yíng)養(yǎng)脅迫難以達(dá)到理想效果?？紤]到2種模式分別對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和油脂積累顯著的作用,先采用光生物反應(yīng)器以適宜理化條件培養(yǎng)微藻,獲得足夠生物量,然后再轉(zhuǎn)入脅迫模式促進(jìn)油脂積累,即二步培養(yǎng)法,可綜合發(fā)揮二者優(yōu)勢(shì)同時(shí)彌補(bǔ)各自不足,不失為能源微藻規(guī)模開發(fā)的理想方案。4占到總成本20%生物柴油生產(chǎn)需要經(jīng)過(guò)藻體分離采收、油脂提取和轉(zhuǎn)化等過(guò)程。該階段需耗費(fèi)很多能量,有時(shí)可占到總成本50%。目前藻體分離收集所面臨的難題還未很好地解決,尚需獲得實(shí)質(zhì)性技術(shù)突破,開發(fā)出經(jīng)濟(jì)而操作便捷的采收與制備工藝技術(shù),降低微藻柴油生產(chǎn)成本,推動(dòng)微藻柴油產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。4.1采用特征分離技術(shù)微藻采收分離目前常用的方法有膜過(guò)濾、離心及絮凝等。其中,離心是較常用的分離方法,不會(huì)引入其他化學(xué)試劑。但操作繁瑣,能耗大、成本高、細(xì)胞易破碎。膜過(guò)濾法存在濾膜易污染問(wèn)題,可通過(guò)采用逆流反沖操作得到一定改善。絮凝也是工業(yè)生產(chǎn)上常用的分離方法,通過(guò)將微藻細(xì)胞絮凝成塊后分離,該技術(shù)需加入絮凝劑,而后續(xù)分離中絮凝劑較難除去,易于造成環(huán)境污染。微藻培養(yǎng)液的絕大部分是水,而微藻個(gè)體較小(直徑一般只有10幾微米),一般的固液分離方法對(duì)微藻的采收分離很難見效。高效率、低能耗采收裝置及培養(yǎng)液循環(huán)使用技術(shù)的開發(fā)將是未來(lái)關(guān)注的重點(diǎn)?？紤]到生態(tài)保護(hù),微藻采收過(guò)程中應(yīng)優(yōu)先考慮物理采收方法,以化學(xué)方法為輔。或?qū)⒍喾N技術(shù)串聯(lián)與耦合,整合各自優(yōu)勢(shì)實(shí)現(xiàn)藻液逐級(jí)濃縮,達(dá)到有效收獲微藻的目的。4.2沖擊、超聲輔助提取法微藻油脂主要以甘油三酯或脂肪酸形式分布在細(xì)胞中,微藻油脂提取常用的方法包括機(jī)械破碎法、溶劑萃取法、水酶法、超臨界CO2萃取法等。油脂制備主要有酯交換、熱解、熱化學(xué)液化等方法。其中酯交換法是當(dāng)前制備生物柴油的