大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉化第1頁試驗原理試驗儀器試驗試劑試驗步驟注意事項大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉化第2頁試驗原理

電轉化法是利用瞬間高壓在細胞上打孔，因而需用冰涼超純水屢次洗滌處于對數(shù)生長前期細胞，以使細胞懸浮液中應含有盡可能少導電離子。轉化效率為109～1010轉化子/μgDNA。熱激法是利用冰涼CaCl2處理對數(shù)生長久細胞，能夠誘導其產(chǎn)生短暫“感受態(tài)”，易于攝取外源DNA。轉化效率為106～107轉化子/μgDNA。大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉化第3頁試驗儀器1．超凈工作臺2．低溫離心機3．恒溫搖床4．恒溫培養(yǎng)箱5．-70℃冰箱6．制冰機7．移液器50ul、200ul、1000ul大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉化第4頁試驗試劑１．氨芐（母液50mg/ml，終濃度為50ug/ml）：

2ml母液需氨芐100mg２．CaCl2(終濃度20mM)：需貯液1M、20ml，需

CaCl2固體4g３．MgCl2(終濃度80mM)：需貯液1M40ml，需

MgCl2固體4g４．甘油：500ml大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉化第5頁試驗步驟CaCl2感受態(tài)細胞制備試驗步驟電轉化法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞試驗步驟大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉化第6頁CaCl2感受態(tài)細胞制備試驗步驟

1．前夜接種受體菌（DH5

或DH10B），挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中

37℃搖床培養(yǎng)過夜（約16小時）；2．取1ml過夜培養(yǎng)物轉接于100mlLB培養(yǎng)基中，在37℃搖床上猛烈振蕩培養(yǎng)約2.5-3小時（250-300rpm）；3．將0.1MCaCl2溶液置于冰上預冷；以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作；4．吸收1.5ml培養(yǎng)好菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘；5．4℃下3000g冷凍離心5分鐘；6．棄去上清，加入100

l預冷0.1MCaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮，在冰放置20分鐘；7．4℃下3000g冷凍離心5分鐘；8．棄去上清，加入100

l預冷0.1MCaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸??；9．細胞懸浮液可馬上用于轉化試驗或添加冷凍保護劑（15%-20%甘油）后超低溫冷凍貯存?zhèn)溆茫ǎ?0℃）。大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉化第7頁電轉化法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞

試驗步驟

1．前夜接種受體菌（DH5

或DH10B），挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)過夜；

2．取2ml過夜培養(yǎng)物轉接于200mlLB培養(yǎng)基中，在37℃搖床上猛烈振蕩培養(yǎng)至OD600＝0.6（約2.5-3小時）；

3．將菌液快速置于冰上。以下步驟務必在超凈工作臺和冰上操作；

4．吸收1.5ml培養(yǎng)好菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘；

5．4℃下3000g冷凍離心5分鐘；

6．棄去上清，加入1500

l冰涼10%甘油，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮；

7．4℃下3000g冷凍離心5分鐘

8．棄去上清，加入750

l冰涼10%甘油，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮；

9．4℃下3000g冷凍離心5分鐘10．加入20

l冰涼10%甘油，用移液器輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮；11．馬上使用或快速置于-70oC超低溫保留。大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉化第8頁注意事項1．細菌生長狀態(tài)：試驗中應親密注視細菌生長狀態(tài)和密度，盡可能使用對數(shù)生長久細胞（普通經(jīng)過檢測OD600來控制。DH5

菌株OD600為0.5時細胞密度是5×107/ml）；2．全部操作均應在無菌條件和冰上進行；3．經(jīng)CaCl2處理細胞，在低溫條件下，一定時間內(nèi)轉化率隨時間推移而增加，24小時到達最高，之后轉化率再下降（這是因為總活菌數(shù)隨時間延長而降低造成）；4．化合物及無機離子影響：在Ca2+基礎上聯(lián)合其它二價金屬離子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細菌，可使轉化效率大大提升（100-1000倍）；5．所使用器皿必須潔凈。跡量去污劑