duddingoniaflagrans凍干制劑厚壁孢子的培養(yǎng)及其對(duì)線蟲(chóng)幼蟲(chóng)的毒殺作用

動(dòng)物寄生蟲(chóng)在動(dòng)物身上很常見(jiàn)，具有分布廣泛、感染率高、危害巨大的特點(diǎn)。在使用捕食線蟲(chóng)性真菌對(duì)家畜胃腸道線蟲(chóng)進(jìn)行生物防控方面,許多研究人員做了大量工作。2000年,Baudena等1997年,Fernández等基于此,本研究選擇不同的培養(yǎng)基質(zhì)、培養(yǎng)方法和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)D.flagrans進(jìn)行培養(yǎng),計(jì)數(shù)培養(yǎng)得到的厚壁孢子數(shù)量,以評(píng)價(jià)D.flagrans的培養(yǎng)情況并對(duì)最優(yōu)培養(yǎng)方法進(jìn)行篩選,然后培養(yǎng)D.flagrans厚壁孢子并將其制備成凍干制劑,研究D.flagrans凍干制劑對(duì)線蟲(chóng)幼蟲(chóng)的體外殺滅效果,以期為確定D.flagrans凍干制劑厚壁孢子批量生產(chǎn)的培養(yǎng)方法及其殺蟲(chóng)所使用的參考劑量提供參考。1材料和方法1.1試驗(yàn)材料1.1.1試驗(yàn)中的細(xì)菌捕食線蟲(chóng)性真菌D.flagrans,由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院寄生蟲(chóng)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供,于-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?.1.2傳統(tǒng)模式的判定自然感染線蟲(chóng)且未驅(qū)過(guò)蟲(chóng)的綿羊,由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物園提供。試驗(yàn)前用糞袋收集綿羊糞便,根據(jù)綿羊糞便中的線蟲(chóng)蟲(chóng)卵及3期幼蟲(chóng)的大小和形態(tài),判定綿羊感染的寄生性線蟲(chóng)主要為食道口屬(Oesophagostomun)、夏伯特屬(Chabertie)線蟲(chóng)以及捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)(Haemonchuscontortus)。1.1.3培養(yǎng)基的制備吐溫-80、瓊脂粉和沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基,均購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司;新鮮玉米粉、玉米粒、大麥粒,均購(gòu)自集貿(mào)市場(chǎng)。0.4g/L玉米粉瓊脂培養(yǎng)基(CMA):稱取篩網(wǎng)過(guò)濾后的新鮮玉米粉20g,置于三角瓶中,加蒸餾水至500mL,微火煮沸1h后補(bǔ)蒸餾水至500mL,多層紗布過(guò)濾。取濾液5mL,加蒸餾水495mL,調(diào)pH為6.0~6.2,再加瓊脂粉20g,加熱待其溶解后,于121℃條件下高壓滅菌20min,傾注于滅菌玻璃培養(yǎng)皿中,置于4℃下保存?zhèn)溆谩?.05%瓊脂粉沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基:稱取10g沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基和0.1g瓊脂粉,置于三角瓶中,加蒸餾水至200mL,攪拌加熱煮沸至完全溶解,分裝于50mL三角瓶中,于121℃條件下高壓滅菌20min,置于4℃下保存?zhèn)溆?。孢子洗脫?吸取2mL吐溫-80,加入1000mL蒸餾水中,微熱并晃動(dòng)使吐溫-80與蒸餾水充分混勻,然后分裝于500mL三角瓶中,于121℃條件下高壓滅菌20min后備用。玉米粒和大麥粒培養(yǎng)基:將玉米粒或大麥粒用蒸餾水清洗干凈后于烘箱內(nèi)烘干,然后分裝于250mL三角瓶?jī)?nèi),每種培養(yǎng)基12瓶,每瓶70g玉米?；虼篼溋?加70mL蒸餾水,于121℃條件下高壓滅菌20min后備用。1.2儀器、藥品和儀器LDZX-50FBS型立式壓力蒸汽滅菌器,上海申安醫(yī)療器械廠;超凈工作臺(tái),哈爾濱東聯(lián)儀器有限公司;NHWY-2102C搖床,常州諾基儀器有限公司;SP-02型生化培養(yǎng)箱,湖北黃石恒豐醫(yī)療有限公司;BX51TF-OLYMPUS顯微鏡,日本奧林巴斯公司;血細(xì)胞計(jì)數(shù)器,上海求精生化試劑儀器有限公司;MODULYOD-230型真空冷凍干燥機(jī)、移液器,美國(guó)Thermo公司。1.3測(cè)試方法1.3.1培養(yǎng)基的制備即在玉米粒或大麥粒培養(yǎng)基中批量培養(yǎng)D.flagrans厚壁孢子,具體步驟如下:在無(wú)菌條件下,先將長(zhǎng)滿D.flagrans菌絲的0.4g/L玉米粉瓊脂培養(yǎng)基均分為6塊,之后分別取出3瓶玉米粒和3瓶大麥粒培養(yǎng)基,每瓶放入等量的搗碎瓊脂塊并攪拌振蕩混勻,于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1.3.2d.flagrans培養(yǎng)基的制備即液體培養(yǎng)基加固體培養(yǎng)基兩階段批量培養(yǎng),具體步驟如下:在無(wú)菌條件下,先將長(zhǎng)滿D.flagrans菌體的0.4g/L玉米粉瓊脂培養(yǎng)基均分為6塊,之后分別搗碎并等量加入到6瓶事先制備好的含0.05%瓊脂粉的沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中,于25℃、100r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)7d。然后將培養(yǎng)好的D.flagrans瓊脂粉沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基分別倒入3瓶玉米粒和3瓶大麥粒培養(yǎng)基中,攪拌振蕩混勻,于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1.3.3厚壁孢子的洗脫與計(jì)數(shù)在無(wú)菌條件下,將上述2種批量培養(yǎng)方式(單步批量培養(yǎng)法和雙步批量培養(yǎng)法)下培養(yǎng)的玉米粒培養(yǎng)基和大麥粒培養(yǎng)基,分別在第3,4和5周時(shí)用制備好的孢子洗脫液少量多次洗脫D.flagrans厚壁孢子,最后再用孢子洗脫液將孢子懸液均定容到10mL,充分混勻后置于400倍顯微鏡下血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),確定每克培養(yǎng)基所含的D.flagrans厚壁孢子數(shù)量。1.3.4厚壁孢子的收集和包裝使用篩選出的最優(yōu)培養(yǎng)法培養(yǎng)D.flagrans厚壁孢子,之后將洗脫后的孢子懸液收集于三角瓶中并充分?jǐn)嚢杈鶆?再用移液器將其分裝于備好的凍干玻璃瓶?jī)?nèi),每瓶分裝2mL(孢子密度為1×101.3.5小鼠糞便的制備用無(wú)菌注射用水溶解D.flagrans凍干制劑,備用。用糞袋收集綿羊糞便,將其充分碾碎混勻,放于9cm培養(yǎng)皿中,每個(gè)培養(yǎng)皿10g,每組3個(gè),共5組:第1組為空白對(duì)照組,只加等量的無(wú)菌注射用水并與糞便充分混勻;第2~5組依次按每克糞便2×101.4數(shù)據(jù)處理和分析對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化或歸一化處理后,用SAS9.0軟件進(jìn)行方差分析,采用Duncan法進(jìn)行多重比較。2結(jié)果與分析2.1培養(yǎng)方法對(duì)d.flagrans培養(yǎng)效果的影響由D.flagrans培養(yǎng)結(jié)果可以看出,當(dāng)其產(chǎn)生的菌絲長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基時(shí),玉米粒和大麥粒2種不同培養(yǎng)基中的菌落外觀色彩有一定差異,玉米粒培養(yǎng)基中的菌落顏色呈微黃色(圖1),單步批量培養(yǎng)法和雙步批量培養(yǎng)法培養(yǎng)的D.flagrans菌落外觀色彩無(wú)明顯差異;而大麥粒培養(yǎng)基中的菌落呈白色(圖1),單、雙步批量培養(yǎng)法培養(yǎng)的D.flagrans菌落外觀色彩也無(wú)明顯差異。2.2雙步批量培養(yǎng)法在玉米培養(yǎng)基中的雙步培養(yǎng)由表1可知,采用單步批量培養(yǎng)法在玉米粒培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí),培養(yǎng)第3周D.flagrans厚壁孢子數(shù)量達(dá)到最大值,為2.4×10由表1還可知,采用雙步批量培養(yǎng)法在玉米粒培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí),培養(yǎng)第4周D.flagrans厚壁孢子數(shù)量達(dá)到最大值,為3.2×10由表1還可看出,利用同一種培養(yǎng)基在2種不同的培養(yǎng)方法下培養(yǎng)時(shí),培養(yǎng)3,4和5周后,每克培養(yǎng)基所含的D.flagrans厚壁孢子數(shù)量均有顯著差異(P<0.05),且均以雙步培養(yǎng)法優(yōu)于單步培養(yǎng)法。2.3海濃織物海傳從外觀上看,D.flagrans凍干制劑(圖2)呈較疏松的海綿狀;血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)結(jié)果(圖3)顯示,每個(gè)凍干玻璃瓶?jī)?nèi)的平均D.flagrans厚壁孢子數(shù)量為2×10SAS軟件分析發(fā)現(xiàn),綿羊糞便按4×103d.flagrans凍干制劑的制備方法一般情況下,捕食線蟲(chóng)性真菌在營(yíng)養(yǎng)豐富的環(huán)境中通常會(huì)生長(zhǎng)得非常旺盛,但產(chǎn)孢很少;在低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上容易產(chǎn)孢,但是生長(zhǎng)很差由捕食線蟲(chóng)性真菌D.flagrans凍干制劑體外殺線蟲(chóng)幼蟲(chóng)效果的測(cè)定結(jié)果可知,D.flagrans凍干制劑殺蟲(chóng)效果良好,其在綿羊糞便中的殺線蟲(chóng)幼蟲(chóng)劑量存在一個(gè)閾值。本研究表明,D.flagrans凍干制劑的殺線蟲(chóng)幼蟲(chóng)劑量閾值為每克糞便4×10目前,國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)關(guān)于捕食線蟲(chóng)性真菌D.flagrans在家畜線蟲(chóng)病防控方面進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)的報(bào)道,但是隨著化學(xué)驅(qū)蟲(chóng)藥弊端的日益顯現(xiàn)及對(duì)動(dòng)物性食品質(zhì)量安全要求的不斷提高,可以通過(guò)制備捕食線蟲(chóng)性真菌D.flagrans新型制劑來(lái)對(duì)家畜寄生性線蟲(chóng)進(jìn)行生物防控,而將D.flagrans制備成凍干制劑可將捕食線蟲(chóng)性真菌的保存時(shí)間延長(zhǎng)至數(shù)十年。凍干制劑