實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基本操作標(biāo)準(zhǔn)及注意事項(xiàng)一、酶與載體的分裝酶類(lèi)與載體：T載體(50ng/pl)用滅菌水稀釋4倍〔12.5ng/pl〕后分裝成10卩1或20pl；連接酶〔solutionI〕按5pl分裝；dNTP〔10mM〕分裝成50pl；無(wú)菌水分裝成1ml；注意：〔1〕所有分裝都必須用已滅菌的管。〔2〕所有工具酶和載體的使用過(guò)程均在冰浴中進(jìn)行?！?〕工具酶、載體以及試劑盒等實(shí)驗(yàn)室共用物品，用完后必須及時(shí)放回原處，以免耽誤他人使用?！?〕當(dāng)你發(fā)現(xiàn)你使用的是最后一管〔盒〕公用物品時(shí)，請(qǐng)馬上告知負(fù)責(zé)人購(gòu)買(mǎi)，以免耽誤使用?！?〕感受態(tài)，氨芐青霉素和IPTG由研究生輪流負(fù)責(zé)制備。每人負(fù)責(zé)六個(gè)月。其他試劑則由第一位使用新包裝的同學(xué)分裝。由于分子實(shí)驗(yàn)工具酶比較容易失活，必須在冰上進(jìn)行分裝。二、常見(jiàn)抗生素及IPTG的配置以氨芐青霉素為例：準(zhǔn)備足夠量的1.5ml的EP管、兩個(gè)100ml的離心管、0.22pm水系濾器、注射器、蒸餾水，以上用品均要進(jìn)行高壓滅菌。潔凈工作臺(tái)紫外滅菌，然后進(jìn)行以下操作。稱(chēng)取2g的氨芐青霉素粉末于離心管中，加入滅菌水至總體積為20ml，輕搖離心管，至氨芐青霉素粉末完全溶解，以免過(guò)濾時(shí)堵塞濾膜。用注射器吸取配制好的溶液，然后把濾器安在注射器上，緩緩?fù)苿?dòng)注射器活塞，把溶液經(jīng)濾膜推至100ml的離心管中。注意：動(dòng)作要緩和，使濾出液出口正對(duì)著離心管，還要防止染菌。5.把100ml離心管中已除菌的氨芐青霉素溶液分裝到1.5ml的EP管中，每管0.5ml。在EP管上做好標(biāo)記，包括名稱(chēng)、濃度、日期等。6.把做好標(biāo)記的盛有氨芐青霉素的EP管于-20°C保存。注意：當(dāng)你發(fā)現(xiàn)你使用的是最后一管抗生素時(shí)，請(qǐng)馬上告知有關(guān)人員及時(shí)配制以免耽誤使用。表1.常見(jiàn)抗生素的儲(chǔ)存濃度及工作濃度名稱(chēng)儲(chǔ)存濃度工作濃度氨芐青霉素〔ampicillin〕100mg/ml50yg/m1?100yg/ml卡那霉素〔kanamycin〕10mg/ml10yg/m1?50yg/ml氯霉素〔chloramphenicol〕25mg/mlyg/ml?25yg/ml鏈霉素〔streptomycin〕50mg/ml10yg/ml?50yg/ml四環(huán)素〔tetracyyline〕10mg/ml10yg/ml?50yg/mlIPTG1M-0.6mM三、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中各種試劑與溶液的配制分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中各種試劑與溶液的配制參見(jiàn)《分子克隆》。四、總DNA的提取具體步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。注意:革蘭氏陽(yáng)性菌DNA提取時(shí)需要加溶菌酶。五、基因擴(kuò)增1.引物與合成：設(shè)計(jì)引物序列，發(fā)至生工公司進(jìn)行合成〔jinan@sangon 〕。2．引物配制：合成后的引物先離心至管底，然后按說(shuō)明書(shū)用無(wú)菌水稀釋至10-50yM,分裝至無(wú)菌EP管中，做好標(biāo)記〔一定要標(biāo)記濃度！后，于-20度保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)體系配制：將所需各組分在冰浴中化開(kāi)后，進(jìn)行PCR反應(yīng)體系配制。反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)按不同聚合酶的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，以transgen的easyTaq酶擴(kuò)增1kb基因序列為例，100口l反應(yīng)體系為：10Xbuffer10pl,dNTP(10mM)2pl,引物各2pl〔10-50|iM。，模板1pl〔根據(jù)濃度加減體積。，Taq酶1pl，ddH2O82pl〔注意：加入順序?yàn)椋核?，buffer，dNTP，引物，模板，酶〕。渦旋混勻，分裝至四-五管，瞬時(shí)離心。注意：假設(shè)反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)在反應(yīng)混合液的上層加10-20pl的礦物油防止樣品在PCR的過(guò)程中蒸發(fā)。將管放入PCR儀中，在PCR儀上設(shè)置好PCR反應(yīng)參數(shù)，例如：94°C5min，94C40sec，Tm55C1min，72C2min，72C10min，16C1h,一般設(shè)30個(gè)循環(huán)。待溫度降至16C后停止PCR儀，盡快取出樣品，不允許過(guò)夜。六、瓊脂糖核酸電泳電泳緩沖液的配制：電泳緩沖液一般為T(mén)AE〔或TBE〕，其配制方法參見(jiàn)表2,先配制50X母液放于4度冰箱中，電泳時(shí)稀釋100倍使用。將制膠模具和梳子沖洗干凈，架好梳子；根據(jù)欲別離DNA片段大小用凝膠緩沖液配制適宜濃度的瓊脂糖凝膠〔表3〕：準(zhǔn)確稱(chēng)量瓊脂糖干粉，加入到配膠用的三角燒瓶?jī)?nèi)，定量加入電泳緩沖液；4．放入到微波爐內(nèi)加熱至膠粒全部熔化（一般沸三次即好），冷卻片刻，倒入制膠模具中，待其凝固；a） 室溫下30-45分鐘后凝膠完全凝結(jié)，小心拔出梳子，將凝膠安放在電泳槽內(nèi)；b） 向電泳槽中倒入電泳緩沖液，其量以沒(méi)過(guò)膠面1mm為宜，如樣品孔內(nèi)有氣泡，應(yīng)設(shè)法除去；c） 在DNA樣品中加入1/5-1/10體積的上樣緩沖液〔1%SDS,50%甘油,0.05%溴酚藍(lán)〕，混勻后，用槍將樣品混合液緩慢加入被浸沒(méi)的凝膠加樣孔內(nèi)；接通電源，紅色為正極，黑色為負(fù)極，切記DNA樣品由負(fù)極往正極泳動(dòng)（靠近加樣孔的一端為負(fù)）。根據(jù)膠的長(zhǎng)度設(shè)定電壓，一般5-8V/cm，電泳20-40min,溴酚藍(lán)跑完膠板的3/4左右即可；電泳完畢，關(guān)上電源，戴上手套，將膠放入卩g/ml的溴化乙錠（EB）溶液中，室溫下染色5-10min。蒸餾水中漂洗一下，置于紫外燈下或凝膠成像儀上觀察電泳帶及其位置，并與核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker比較被擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。如果要切膠回收，最好在觀察臺(tái)上鋪上塑料片觀察，防止污染以及紫外燈引起DNA突變。注意：溴化乙錠〔EB〕有劇毒，操作時(shí)應(yīng)注意安全，戴手套操作。但是要防止污染染色池和切膠板以外的區(qū)域。操作完后手套和膠分別放入垃圾桶和回收桶。表2.電泳緩沖液TAE配方緩沖液使用液濃貯存液〔每升〕Tris-乙酸〔TAE〕x:2mol/LTris-乙酸50x：242gTris堿05mol/LEDTAml冰乙酸100mol/LEDTA(pH8.0)表3.瓊脂糖凝膠濃度與線(xiàn)形DNA的最正確分辨范圍瓊脂糖凝膠濃度與線(xiàn)形DNA的最正確分辨范圍瓊脂糖凝膠濃度線(xiàn)形DNA的最正確分辨范圍〔bp〕0.5%1,000?30,0000.7%800?12,0001.0%500?10,0001.2%400?7,0001.5%200?3,0002.0%50?2,000七、回收與連接將切下的目的條帶按照回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行產(chǎn)物回收；連接前先電泳確定待連接載體與片段的濃度。稀釋好的T載體濃度為12.5ng/yl，不用再確定濃度，每次用量為1燦。連接反應(yīng)體系的配制〔1〕用SolutionI連接時(shí)，取一只分裝的SolutionI離心管〔含5ylSolutionI〕，加入待連接的兩個(gè)DNA樣品：載體與片段〔載體與片段的mol比為1：3-5〕，加水補(bǔ)足10yl。〔2〕用T4連接酶5yl連接時(shí)，取一只滅菌PCR管，加入10X連接buffer1燦,待連接的兩個(gè)DNA樣品：載體與片段〔載體與片段的mol比為1：-5〕，T4連接酶1yl,加水補(bǔ)足10血〔3〕連接至T載體時(shí)反應(yīng)體系一般為：回收的PCR產(chǎn)物4yl,solutionI5yl,4倍稀釋的pMD-18T克隆載體（12.5ng/yl〕1yl。注意：加入順序?yàn)椋核?，buffer，DNA樣品，酶混勻樣品并短暫離心使樣品全部沉于管底。將離心管置于16°C孵育4h以上或過(guò)夜。八、E.coliDH5a和B121感受態(tài)細(xì)胞的制備采用CaCl2制備法制備E.coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞，步驟如下：準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)：〔1〕準(zhǔn)備LB固體培養(yǎng)基和分裝于試管〔2-5ml〕和三角瓶〔100ml〕的液體培養(yǎng)基。〔2〕分別配制含15%甘油的和不含甘油的0.1MCaCl2。⑶準(zhǔn)備干凈培養(yǎng)皿、非常干凈的100ml離心管2只，1.5mlEP管50只,1ml和200燦槍尖各一盒?！?〕將以上培養(yǎng)基和物品高壓滅菌。在LB平板上活化iDH5a。將活化的iDH5a單菌落接種于成含LB培養(yǎng)基的試管中，37°C搖床過(guò)夜培養(yǎng)。第二天按1%接種量接種到含100mlLB培養(yǎng)基的三角瓶中，37C搖床培養(yǎng)至OD600=0.4-0.6〔約2h〕。600冰浴10min,倒入滅過(guò)菌的100ml離心管中離心，4000rpm，10min,4C。去掉上清，加20ml配制好的已滅菌的0.1MCaCl2，將菌體打散后靜置20min，4000rpm離心10min，去掉上清。加1-2ml滅菌的0.1MCaCl2(含15%甘油)制成感受態(tài)細(xì)胞。將制好的感受態(tài)細(xì)胞分裝成50山小份保存于-80C冰箱。E.coliBl21和BL21(DE3)的制備方法同上。注意：〔1〕所有操作均在冰上進(jìn)行；〔2〕整個(gè)制備過(guò)程必須保證無(wú)菌操作；〔3〕E.coliBl21，BL21(DE3),DH5a菌種每學(xué)期更換一次。九、轉(zhuǎn)化取50pl感受態(tài)細(xì)胞于冰浴上融化。加入10pl連接產(chǎn)物或3-5pl純質(zhì)粒，輕輕吹打混勻，冰浴20min。放入42°C水浴中熱激90秒，立即放入冰浴中2-10min。加入ml不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，于37C培養(yǎng)1h。將培養(yǎng)物4000rpm離心3min,保留約200pl上青于管中，將菌體用無(wú)菌槍尖輕輕打散，均勻涂布于含100pg/mlAmp+的平板外表，平板于37C先正置1-2h，后倒置培養(yǎng)12-16h至菌落出現(xiàn)。十、重組子的篩選和鑒定從轉(zhuǎn)化平板上挑取白色菌落，轉(zhuǎn)接至含抗生素Amp+〔100pg/ml〕的LB液體培養(yǎng)基，37C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。菌液可以用以下三種方法驗(yàn)證是否是陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。注意：同時(shí)培養(yǎng)陰性菌落作為對(duì)照！〔一〕酚抽驗(yàn)證取1ml菌液12,000rpm離心1min收集菌體，盡量倒干凈上清后加入50plTris飽和酚和50pl水，漩渦震蕩5min充分混勻。12,000rpm離心10min后迅速取上清進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳?！捕迟|(zhì)粒酶切驗(yàn)證按照質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行質(zhì)粒提取，用未插入片段的質(zhì)粒作為陰性對(duì)照，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。電泳后可根據(jù)質(zhì)粒的大小初步判斷質(zhì)粒中是否有插入片段，并推測(cè)質(zhì)粒的濃度。利用引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)或質(zhì)粒上的酶切位點(diǎn)，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切。根據(jù)待切質(zhì)粒的濃度確定要加的體積，選擇合適的限制性?xún)?nèi)切酶和配套Buffer。在離心管中加入如下成分：10xBuffer2pl待切樣品xpl〔一般為5pl左右〕酶 1pl10U/ul加滅菌水補(bǔ)足20pl酶的多少并不是一成不變的，關(guān)鍵要看待切DNA的濃度，如果濃度較低，可以適當(dāng)少加酶。不要在20pl體系中加入超過(guò)2N的酶，那樣容易產(chǎn)生星號(hào)活性。4、 混勻樣品并短暫離心使樣品沉于管底。5、 將離心管置于37°C中溫育2h,假設(shè)待切樣品為PCR產(chǎn)物，則可將反應(yīng)時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)。最長(zhǎng)酶切時(shí)間要取決于是否會(huì)產(chǎn)生星號(hào)活性。如果50燦體系加入1燦酶,則可過(guò)夜酶切一般不會(huì)出現(xiàn)星號(hào)活性。6、 用未酶切的質(zhì)粒作為對(duì)照，瓊脂糖電泳鑒定酶切結(jié)果。注意：當(dāng)酶切樣