第十四章分子發(fā)光光譜法

MolecularLuminescenceAnalysis

本章要求

⒈掌握分子熒光和分子磷光的基本原理；

⒉了解熒光光譜儀的結(jié)構(gòu)；

⒊了解化學(xué)發(fā)光分析法的原理及應(yīng)用。

分子發(fā)光法研究高能態(tài)分子釋放能量回到基態(tài)時(shí)所發(fā)生的光輻射，包括：光致發(fā)光（分子熒光和分子磷光）、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光和電化學(xué)發(fā)光等。分子熒光分子受激后，由第一激發(fā)態(tài)單重態(tài)回到基態(tài)的任一振動(dòng)能級(jí)伴隨的光輻射；分子磷光分子受激后，由第一激發(fā)態(tài)三重態(tài)回到基態(tài)的任一振動(dòng)能級(jí)伴隨的光輻射；化學(xué)發(fā)光由化學(xué)反應(yīng)所釋放的化學(xué)能激發(fā)體系中的某物質(zhì)分子，當(dāng)分子受激躍遷回到基態(tài)產(chǎn)生的光輻射。生物發(fā)光化學(xué)發(fā)光反應(yīng)存在于生物體。電化學(xué)發(fā)光靠電極過程誘發(fā)溶液的化學(xué)發(fā)光。一、分子熒光的產(chǎn)生

分子吸收了電磁輻射后處于激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)分子經(jīng)歷一個(gè)碰撞及發(fā)射的去激發(fā)過程。14.1分子熒光光譜法1.

分子能級(jí)與躍遷分子能級(jí)比原子能級(jí)復(fù)雜；每個(gè)電子能級(jí)上，都存在振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)；基態(tài)(S0)→激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動(dòng)能級(jí))；激發(fā)態(tài)→基態(tài)：多種途徑和方式；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢(shì)。

單重態(tài)：一個(gè)所有電子自旋都配對(duì)的分子的電子態(tài)，用“S”表示。第一、第二、…電子激發(fā)單重態(tài)S1、S2…三重態(tài)：在激發(fā)態(tài)分子中，兩個(gè)價(jià)電子自旋平行的電子態(tài)，用“T”表示。第一、第二、…電子激發(fā)三重態(tài)T1、T2…熒光發(fā)射：處于激發(fā)單重態(tài)S1的最低振動(dòng)能級(jí)的分子返回基態(tài)S0的過程中產(chǎn)生。熒光發(fā)射過程約10-8s，熒光特征波長比吸收波長要長。熒光猝滅：熒光分子與溶劑或其他物質(zhì)作用使熒光強(qiáng)度減弱的現(xiàn)象。使熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)為熒光猝滅劑。磷光發(fā)射：激發(fā)態(tài)分子經(jīng)過系間跨越到達(dá)激發(fā)三重態(tài)后，并迅速的振動(dòng)弛豫到達(dá)第一激發(fā)三重態(tài)T1的最低振動(dòng)能級(jí)上，從T1態(tài)分子經(jīng)發(fā)射光子回到基態(tài)，需要時(shí)間10-4~

10

s。磷光的壽命要比熒光長得多。熒光與磷光的根本區(qū)別：熒光是由激發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)至基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)間的躍遷產(chǎn)生的；磷光是由激發(fā)三重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)至基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)間的躍遷產(chǎn)生的。⒉熒光的激發(fā)光譜與發(fā)射光譜

熒光(磷光)：光致發(fā)光，輻射光波長如何選擇？⑴熒光(磷光)的激發(fā)光譜與發(fā)射光譜

分子對(duì)光的吸收具有選擇性，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜是熒光物質(zhì)的基本特征。

Δ

繪制激發(fā)光譜曲線時(shí)，固定測(cè)量波長為熒光（磷光）最大發(fā)射波長em，改變激發(fā)波長ex

，根據(jù)所測(cè)得熒光發(fā)射強(qiáng)度與激發(fā)波長的關(guān)系，可繪制激發(fā)光譜曲線。

Δ

固定激發(fā)光波長為最大激發(fā)光波長

ex，測(cè)量不同的波長所發(fā)射的熒光（磷光）強(qiáng)度時(shí)，使激發(fā)波長和強(qiáng)度保持不變，改變發(fā)射光波長

em

，可繪制熒光（磷光）光譜曲線。熒光強(qiáng)度nm激發(fā)光譜和發(fā)射光譜可用于鑒別熒光物質(zhì)，也是選擇

ex和

em的依據(jù)。在熒光和磷光的產(chǎn)生的過程中，基態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)躍遷到第一激發(fā)態(tài)各個(gè)振動(dòng)能級(jí)的吸收過程中，振動(dòng)能級(jí)越高，兩個(gè)能級(jí)間的能量差越大，即激發(fā)所需要的能量越高，峰的波長越短。二、熒光強(qiáng)度、熒光量子產(chǎn)率、熒光壽命⒈熒光強(qiáng)度

在一定條件下，儀器所測(cè)得熒光物質(zhì)發(fā)射熒光大小的一種度量。熒光是向四面八方發(fā)射的，沒有方向性，各向同性的。

IF=

φ(I0-I)

IF=φ(I0-I0e-εbc)φ:熒光量子產(chǎn)率

IF=2.303φI0kC=KC

在低濃度時(shí)，

IF與C呈線性關(guān)系；高濃度時(shí)，產(chǎn)生自吸收和自熄滅，IF與C不成呈線性關(guān)系；⒉熒光量子產(chǎn)率

由于激發(fā)態(tài)分子的去極化過程包括輻射躍遷和非輻射躍遷，熒光的量子產(chǎn)率與上述每個(gè)過程的速率常數(shù)有關(guān)：Kf:熒光發(fā)射過程的速率常數(shù)；取決于分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)∑K:其它非輻射過程的速率常數(shù)的總和，取決于化學(xué)環(huán)境（介質(zhì)、酸度、溫度）。凡是能使Kf值升高而使其它K值降低的因素，都可以增強(qiáng)熒光。⒊熒光壽命（τ）

熒光壽命可用下式測(cè)定：

測(cè)定不同的熒光值，作出lnIFt---t

的曲線。由所得直線的斜率可計(jì)算熒光壽命τK:一般約為10-3～10-4L/molcmτ

:一般約為10-8～10-9s三、熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

對(duì)于大量的有機(jī)和無機(jī)物質(zhì)，能夠發(fā)光的物質(zhì)不是很多。因?yàn)闊晒獾漠a(chǎn)生必須具備兩個(gè)條件：首先，物質(zhì)的分子必須具有電子吸收光譜的特征，產(chǎn)生熒光的前提；其次，物質(zhì)的分子吸收了與其本身特征頻率相同能量之后，必須具有高的熒光量子產(chǎn)率。許多吸光物質(zhì)由于其結(jié)構(gòu)特征，分子的熒光量子產(chǎn)率不高，不一定會(huì)發(fā)光?？梢?，熒光物質(zhì)分子的激發(fā)、發(fā)射性質(zhì)與分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。

熒光物質(zhì)具有如下特征：⒈躍遷類型：大多數(shù)熒光化合物都是有→*或n→*躍遷激發(fā)，經(jīng)振動(dòng)弛豫或其它無輻射躍遷，再發(fā)生*→或*→n的躍遷，其中*→熒光效率高，系間跨越過程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生。

熒光物質(zhì)往往具有如下特征：⑴具有大的共軛雙鍵結(jié)構(gòu)；⑵具有剛性平面結(jié)構(gòu)；⑶取代基團(tuán)為給電子基團(tuán)。⒉

共軛雙鍵結(jié)構(gòu)

含有→*躍遷能級(jí)的芳香族化合物的熒光最強(qiáng)。發(fā)生熒光(或磷光)的物質(zhì)，其分子都含有共軛雙鍵(π鍵)的結(jié)構(gòu)體系。共軛體系越大，電子的離域性越大，越容易被激發(fā)，熒光也就越容易發(fā)生，且熒光光譜向長波移動(dòng)。任何有利于提高電子共軛度的結(jié)構(gòu)改變，都能增加熒光效率并產(chǎn)生紅移。大部分熒光物質(zhì)都具有芳環(huán)和稠環(huán)，含脂肪族和脂環(huán)族羰基化合物也會(huì)發(fā)射熒光（較芳香族少）。簡(jiǎn)單的雜環(huán)化合物，如吡啶、呋喃、喹啉等不產(chǎn)生熒光。但當(dāng)苯環(huán)被稠化至雜環(huán)核上時(shí)，ε增加，像喹啉等化合物也會(huì)產(chǎn)生熒光。⒊剛性平面結(jié)構(gòu)：實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，多數(shù)具有剛性平面結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物分子都具有強(qiáng)烈的熒光，強(qiáng)熒光化合物僅具有共軛體系不夠，還具有剛性平面結(jié)構(gòu)。剛性平面結(jié)構(gòu)增加了電子體系的相互作用和共軛，結(jié)果使分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子作用減小，外轉(zhuǎn)換能量損失減少，有利于熒光發(fā)射。而且平面結(jié)構(gòu)可以增大分子的吸光截面，增大摩爾吸光系數(shù)，增強(qiáng)熒光強(qiáng)度。

⒋取代基效應(yīng)

芳香族化合物的芳環(huán)上引入不同的取代基對(duì)化合物，使熒光強(qiáng)度有很大的影響。取代基的性質(zhì)（尤其是生色基團(tuán)）對(duì)熒光體的熒光特性和強(qiáng)度均有強(qiáng)烈的影響。芳環(huán)及雜環(huán)化合物的熒光激發(fā)光譜、發(fā)射光譜及熒光效率常隨取代基的不同而異。由于目前對(duì)于激發(fā)態(tài)分子的性質(zhì)了解還很不夠，尚不能真正從機(jī)制上揭開其影響的秘密，其影響規(guī)律多出自實(shí)驗(yàn)總結(jié)和推測(cè)。⑴給電子基團(tuán)屬于這類基團(tuán)的有

-OH、-NH2、-NR2、-CN和-OR等，由于這些基團(tuán)上的n電子云幾乎與芳環(huán)上的π電子軌道平行，共享了共軛π電子，形成了p-π共軛增強(qiáng)了電子共軛程度，導(dǎo)致熒光增強(qiáng)波長紅移，使最低激發(fā)單重態(tài)與基團(tuán)之間的躍遷幾率增大→強(qiáng)度增大。

⑵吸電子基團(tuán)屬于這類基團(tuán)的有

-COOH、-COR、-C=O、-NO、-NO2和鹵素等，這些取代基取代后，熒光強(qiáng)度減弱或猝滅，其n電子的電子云不與芳環(huán)上電子云共平面，不能構(gòu)成p→共軛，不能擴(kuò)大電子共軛程度，使熒光減弱或猝滅。而S1→T1的系間跨躍較為強(qiáng)烈，同樣使熒光減弱，相應(yīng)磷光增強(qiáng)。⒌重原子效應(yīng)

熒光體取代上重原子后，熒光減弱，而磷光往往相應(yīng)增強(qiáng)。所謂重原子取代，一般指的是鹵素(Cl、Br和I)原子取代，芳烴取代上鹵素原子之后，其熒光強(qiáng)度隨鹵素原子量增加而減弱，而磷光通常相應(yīng)地增強(qiáng)，這種效應(yīng)稱為“重原子效應(yīng)”。這種效應(yīng)被解釋為，由于重原子中，能級(jí)之間的交叉現(xiàn)象比較嚴(yán)重，使得熒光體中的電子自旋一軌道耦合作用加強(qiáng)，S1→T1系間跨躍顯著增加，結(jié)果導(dǎo)致熒光強(qiáng)度減弱，磷光強(qiáng)度增強(qiáng)。如圖表示鹵代萘的熒光及磷光光譜的情況。

四、影響熒光強(qiáng)度的因素1.溶劑的影響

除一般溶劑效應(yīng)外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化；一般來說，電子激發(fā)態(tài)比基態(tài)具有更大的極性。溶劑的極性增強(qiáng)，對(duì)激發(fā)態(tài)會(huì)產(chǎn)生更大的穩(wěn)定作用，結(jié)果使物質(zhì)的熒光波長紅移，熒光強(qiáng)度增大?？鼘幵诒健⒁掖己退袩晒庑实南鄬?duì)大小為1、30和1000。2.溫度的影響

熒光強(qiáng)度對(duì)溫度變化敏感，一般情況下，輻射躍遷的速率基本不隨溫度而改變，而非輻射躍遷的速率隨溫度升高而顯著增大。因此，對(duì)大多數(shù)的熒光物質(zhì)而言，升高溫度會(huì)使非輻射躍遷概率增大，熒光效率降低。由于三重態(tài)的壽命比單重激發(fā)態(tài)壽命更長，溫度對(duì)于磷光的影響比熒光更大。3.溶液pH

對(duì)酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴(yán)格控制；共軛酸堿兩種體型具有不同的電子氛圍，往往表現(xiàn)為具有不同熒光性質(zhì)的兩種體型，各具有自己特殊的熒光效率和熒光波長。pH≈1有熒光pH≈13無熒光離子化后熒光消失⒋熒光猝滅

熒光物質(zhì)與溶劑或其它物質(zhì)之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，或發(fā)生碰撞后使熒光強(qiáng)度下降或熒光效率Φf

下降稱為熒光猝滅。使熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)稱為熒光猝滅劑。

氧分子及產(chǎn)生重原子效應(yīng)的溴化物、碘化物等都是常見的熒光猝滅劑（Q）。五、熒光和磷光分析儀器⒈熒光分析儀器

熒光分析儀器主要由四個(gè)部分組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測(cè)器。＋特點(diǎn)：有兩個(gè)單色器；光源與檢測(cè)器通常成直角。

熒光分析儀與分光光度計(jì)的區(qū)別：⒈熒光分析儀采用垂直測(cè)量方式，在與激發(fā)光相垂直的方向測(cè)量熒光，以消除透射光的影響。⒉熒光分析儀有兩個(gè)單色器，一個(gè)是激發(fā)單色器，用于獲得單色性較好的激發(fā)光；另一個(gè)是發(fā)射單色器，用于分出某一波長的熒光，消除其它雜散光的干擾。⑴

光源激發(fā)光源比吸收測(cè)量中的光源有更大的發(fā)射強(qiáng)度，適用波長范圍寬。熒光光度計(jì)中常用高壓汞燈和氙弧燈。①高壓汞燈常用其發(fā)射365nm、405nm、436nm三條譜線以365nm譜線最強(qiáng)。平均壽命為1500～3000h。②氙弧燈最廣泛的一種光源，可發(fā)射200~800nm很強(qiáng)的連續(xù)光源。⑵

單色器大多數(shù)熒光光度計(jì)一般采用兩個(gè)光柵單色器，有較高的分辨率，能掃描圖譜，既可獲得激發(fā)光譜，又可獲得熒光光譜。第一單色器作用：分離出所需要的激發(fā)光，選擇最佳激發(fā)波長

ex

，激發(fā)液池內(nèi)的熒光物質(zhì)

ex

第二單色器作用：濾掉一些雜散光和雜質(zhì)所發(fā)射的干擾光，用來選擇測(cè)定用的熒光波長

em，測(cè)定熒光強(qiáng)度，定量分析。⑶

樣品池盛放測(cè)定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上邊。⑷

檢測(cè)器把光信號(hào)轉(zhuǎn)化成電信號(hào),放大,直接轉(zhuǎn)成熒光強(qiáng)度。熒光的強(qiáng)度一般較弱，要求檢測(cè)器有較高的靈敏度，熒光光度計(jì)采用光電倍增管。熒光分析比吸收光度法具有高得多的靈敏度，原因是熒光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度成正比，提高激發(fā)光強(qiáng)度可大大提高熒光強(qiáng)度。⒉磷光分析儀器

熒光計(jì)上配上磷光測(cè)量附件即可對(duì)磷光進(jìn)行測(cè)量。在有熒光發(fā)射的同時(shí)測(cè)量磷光。⑴樣品池盛試液的石英液槽需放置在盛液氮的石英杜瓦瓶內(nèi)。⑵磷光鏡利用磷光鏡不僅可分別測(cè)出熒光和磷光強(qiáng)度而且可以測(cè)出不同壽命的磷光。a.低溫杜瓦瓶b.斬波片六熒光分析方法與應(yīng)用⒈特點(diǎn)⑴靈敏度高：比UV-Vis高2~4個(gè)數(shù)量級(jí)；⑵檢測(cè)限：一般在10-5～10-8mol/L；

⑶選擇性強(qiáng)：可依據(jù)特征發(fā)射、又可根據(jù)特征吸收光譜；⑷試樣量少缺點(diǎn)：應(yīng)用范圍小。⒉定量分析法①標(biāo)準(zhǔn)曲線法②比較法：在線性范圍內(nèi)，標(biāo)樣和試樣的熒光強(qiáng)度比較。⒊熒光分析法的應(yīng)用⑴無機(jī)化合物的分析與有機(jī)試劑配合物后測(cè)量；可測(cè)量約60多種元素。⑵生物與有機(jī)化合物的分析脂肪族的有機(jī)化合物的分子結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，本身能發(fā)射熒光的很少，與某些試劑反應(yīng)后能進(jìn)行熒光分析。芳香族有機(jī)化合物因其具有共軛的不飽和體系，多數(shù)能發(fā)生熒光，可以直接用熒光法測(cè)定。4.磷光分析法的應(yīng)用⑴稠環(huán)芳烴⑵農(nóng)藥、生物堿、植物生長激素⑶藥物分析和臨床分析，如：人體血液中的柯卡因、苯巴比妥、磺胺嘧啶、致幻劑、維生素?；瘜W(xué)發(fā)光分析是利用某些化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的光輻射現(xiàn)象而建立的一種分析方法。特點(diǎn)：⑴靈敏度高：用魯米諾化學(xué)發(fā)光體系測(cè)定Cr3+、Co2+等離子的檢出限也低至10-9mg/L。⑵測(cè)定的線性范圍寬。一般有5~6個(gè)數(shù)量級(jí)。⑶分析速度快。流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析每小時(shí)可測(cè)定40個(gè)以上的試樣。⑷儀器設(shè)備簡(jiǎn)單。局限性：發(fā)光試劑有限；機(jī)理進(jìn)一步研究。14.2化學(xué)發(fā)光法一、基本原理1.化學(xué)發(fā)光反應(yīng)