HBVDNA檢測(cè)在乙肝治療中的應(yīng)用羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司王亞雄2006年8月11日上海為什么進(jìn)行HBVDNA檢測(cè)HBVDNA檢測(cè)帶給我們的益處目前HBVDNA的檢測(cè)方法羅氏COBASAmplicor系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)新一代技術(shù)COBASTaqMan主要內(nèi)容乙型肝炎：全球性的健康問(wèn)題目前HBV攜帶者超過(guò)350million25–40%HBsAg陽(yáng)性人群會(huì)死于肝硬化或肝癌全球350millionHBV攜帶者,75%在亞洲

中表面抗原（S+preS2）核蛋白殼HBcAg(HBeAg)DNA聚合酶膜蛋白基因組DNA小表面抗原HBsAg(S)RNA引物大表面抗原（S+preS2+preS1)乙肝病毒顆粒示意圖慢性乙肝檢測(cè)指標(biāo)HBsAg–確定慢性乙肝HBeAg/anti-HBe–區(qū)分感染的不同時(shí)期HBV聚合酶–檢測(cè)病毒的酶活性HBVDNA–檢測(cè)病毒載量(病毒轉(zhuǎn)錄活性)HBcAg–檢測(cè)病毒蛋白(病毒翻譯活性)HBV病毒基因慢性乙型肝炎暴露后時(shí)間滴度ALTAnti-HBcSymptoms

5

601234

6

71

2

345

8

9

10HBsAgHBeAg月年HBVDNAAnti-HBe慢性乙肝的三種臨床表現(xiàn)HBeAg陽(yáng)性慢性乙肝

HBeAg,ALT升高,HBV-DNA107to1011

拷貝每毫升，病理切片指征明顯HBeAg陰性慢性乙肝

Anti-HBe,ALT升高，HBV-DNA104to108拷貝每毫升,病理切片指征明顯HBsAg陰性攜帶期

Anti-HBe,ALT正常,HBV-DNA<101to104拷貝每毫升,病理切片變化極小EASL（歐洲肝病學(xué)會(huì)）將顯著的復(fù)制水平定為HBV-DNA105

拷貝每毫升

HBV保持復(fù)制活性（HBVDNA≥105copies/mL）,轉(zhuǎn)氨酶3－6月內(nèi)

持續(xù)升高，建議進(jìn)行治療對(duì)于e抗原陽(yáng)性的慢性乙肝患者而言，采用干擾素治療結(jié)束后，應(yīng)該

檢測(cè)e抗原、e抗體和HBVDNA水平，并且每6個(gè)月評(píng)估病毒學(xué)反應(yīng)對(duì)于e抗原陰性的慢性乙肝患者而言，在經(jīng)過(guò)抗病毒治療后，檢測(cè)血

清HBVDNA水平是評(píng)估病毒學(xué)反應(yīng)的唯一方式歐洲肝病學(xué)會(huì)（EASL）2003乙肝防治指南/article/PIIS0168827803003787/fulltext#section7HBV-DNA血清陽(yáng)性病人，如果ALT>2ULN,要考慮治療治療期間，ALT、e抗原和HBV-DNA至少每3個(gè)月檢測(cè)一次

亞太乙肝防治共識(shí)2003JournalofGastroenterologyandHepatology(2003)18,239–245抗病毒一般適應(yīng)癥主要指標(biāo)：HBVDNA≥105

拷貝/mL病毒學(xué)應(yīng)答重要指標(biāo)包括血清HBV，DNA檢測(cè)不到(PCR法)

或低于檢測(cè)下限，或較基線(xiàn)下降≥2log10

中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)/中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病分會(huì)－慢性乙肝防治指南/GB/14740/21474/56295/index.html為什么進(jìn)行HBVDNA檢測(cè)HBVDNA檢測(cè)帶給我們的益處目前HBVDNA的檢測(cè)方法羅氏COBASAmplicor系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)新一代技術(shù)COBASTaqMan主要內(nèi)容HBVDNA檢測(cè)帶給我們的益處監(jiān)測(cè)抗病毒治療效果早期確定病毒學(xué)應(yīng)答預(yù)測(cè)治療后反應(yīng)(HBsAg消失)預(yù)測(cè)耐藥突變預(yù)測(cè)肝移植后復(fù)發(fā)檢測(cè)HBsAg攜帶者的病毒的活動(dòng)情況指標(biāo)正常/HBeAg陽(yáng)性(n.31)anti-HBe陽(yáng)性(n.15)轉(zhuǎn)陰ALT

12

7HBeAg

12

NDdot-blothybridization.

12

7IgManti-HBc

ND

5AmplicorHBVMonitor

5

2HBsAg

3

2經(jīng)治療生化指標(biāo)正常病人中病毒清除率治療中/后，應(yīng)答者與不應(yīng)答者HBVDNA水平的比較baseline1-3wks4-7wks8-11wks12-15wks16-24wks0-5mths6-11mths12-18mths1x1021x1041x1061x1081x1010HBVDNA

levelscopies/mlmean±SEMp=0.07p=0.2p<0.01p<0.001p<0.001p<0.001p<0.001p<0.001p<0.001-不應(yīng)答者--應(yīng)答者-治療中治療后監(jiān)測(cè)抗病毒治療，預(yù)測(cè)耐藥Puchhammer-StocklE.atal.JInfectDis181:2063,2000HBVDNA載量顯示攜帶者處于活動(dòng)或非活動(dòng)狀態(tài)HBVDNAcopies/mlManesisK.etal.Gastroenterology122(7):2092-3,2002.1.E+021.E+031.E+041.E+051.E+061.E+071.E+081.E+09非活動(dòng)狀態(tài)活動(dòng)狀態(tài)HBVDNA載量在肝移植中的應(yīng)用

在肝移植中(LiverTransplantation)

為防治肝移植后的復(fù)發(fā)所采取的預(yù)防性治療需要達(dá)到HBVDNA<104copies/mL的指標(biāo)為什么進(jìn)行HBVDNA檢測(cè)HBVDNA檢測(cè)帶給我們的益處目前HBVDNA的檢測(cè)方法羅氏COBASAmplicor系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)新一代技術(shù)COBASTaqMan主要內(nèi)容目前HBVDNA的檢測(cè)方法羅氏COBASAmplicorHBVMonitorDigeneHybridCapture雜交捕捉AbbottGenostix已消失BayerbDNA3.0國(guó)產(chǎn)HBVDNA檢測(cè)試劑及方案羅氏COBASTaqManHBVmonitor靈敏度比較TechnologyLODcopies/mLRocheAMPLICOR300DigeneHybridCapture~140,000AbbottGenostix~500,000BayerbDNA3.0~2,000RocheCobasTaqman~35國(guó)產(chǎn)試劑？BranchedDNA(bDNA)靶探針*Preamplifier*Microwell靶DNA捕獲探針微孔板捕獲探針Amplifier*withhybridizedLabelProbes**componentscontainingIso-C/Iso-G信號(hào)擴(kuò)增BranchedDNA(bDNA)國(guó)內(nèi)Realtime方法HBV的檢測(cè)現(xiàn)狀

PCR反應(yīng)Mg2+dCTPdGTPdUTPdATPTaqDNAPolymeraseAmpErase?TargetDNAPCR模板擴(kuò)增1cycle=22cycle=43cycle=84cycle=165cycle=326cycle=647cycle=128SinglestrandRNA水解探針

(TaqMan)模式淬滅基團(tuán)報(bào)告熒光激發(fā)熒光淬滅激發(fā)熒光檢測(cè)到信號(hào)實(shí)時(shí)熒光定量模式0510152025300102030405060相對(duì)熒光強(qiáng)度None1ThresholdCycleThreshold(Ct)for108C/PCRHBVDNALogC/PCR2876543循環(huán)數(shù)需要關(guān)注的國(guó)內(nèi)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的問(wèn)題儀器90％源于進(jìn)口，ABI、ROCHE、Bio-Rad…試劑100％國(guó)產(chǎn)，匹基、達(dá)安、科華、復(fù)星…需要關(guān)注的國(guó)內(nèi)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的問(wèn)題目前國(guó)內(nèi)使用的進(jìn)口RealtimePCR儀全部是針對(duì)科研用途研發(fā)的，缺乏臨床診斷所需的質(zhì)控系統(tǒng)所有進(jìn)口PCR儀均為開(kāi)放系統(tǒng)，除Roche外均不提供臨檢用試劑儀器廠(chǎng)家僅負(fù)責(zé)儀器運(yùn)行是否正常，不對(duì)檢測(cè)結(jié)果做任何保障均采用外部標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)定量，標(biāo)準(zhǔn)品為重組質(zhì)粒，與臨床標(biāo)本有無(wú)差異－－？質(zhì)控品及標(biāo)準(zhǔn)品有無(wú)朔源性－－？試劑是否標(biāo)明“域值”或“CrossBand”取值范圍－？陽(yáng)性質(zhì)控是否給出標(biāo)準(zhǔn)值范圍－－？標(biāo)準(zhǔn)品濃度是否覆蓋聲明的檢測(cè)靈敏度－－？是否提供內(nèi)部質(zhì)控品－－？純化產(chǎn)率如何控制－－？需要關(guān)注的國(guó)內(nèi)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的問(wèn)題檢測(cè)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化的問(wèn)題標(biāo)準(zhǔn)化的各要素校準(zhǔn)品試劑分析儀為什么進(jìn)行HBVDNA檢測(cè)HBVDNA檢測(cè)帶給我們的益處目前HBVDNA的檢測(cè)方法羅氏COBASAmplicor系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)新一代技術(shù)COBASTaqMan主要內(nèi)容COBASAmplicor檢測(cè)原理雜交(37C)PCR擴(kuò)增變性雜交清洗加AV-HRP加TMB內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品(QS)全程監(jiān)控樣本制備/PCR過(guò)程

兼作定量參照BBBB

內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品DNA

模板DNA模板DNA內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品DNACOBASAmplicor：與固定在磁珠上的探針雜交內(nèi)對(duì)照防止假陰結(jié)果，精確定量PCRCOBASAMPLICORHBVMonitor特點(diǎn)檢測(cè)下線(xiàn)300copies/mL,>95%檢出率線(xiàn)性范圍300-200,000copies/mL同等定量亞型A-F血清或血漿100ul樣本6小時(shí)檢測(cè)時(shí)間,30分鐘手工準(zhǔn)備內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)防污染系統(tǒng)COBASAmplicorVSbDNACOBASAmplicorvsbDNACOBASAmplicorvsbDNACobasAmplicorbDNA標(biāo)本準(zhǔn)備乙醇沉淀磁珠吸附擴(kuò)增靶序列光信號(hào)線(xiàn)性范圍300－200,0002000-100,000,000特異性100%99.2%（96-98%)亞型A－FA－F污染控制有無(wú)定量方案內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品外部標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Control數(shù)量3個(gè)12個(gè)報(bào)告時(shí)間8小時(shí)24小時(shí)COBASAmplicorHBV靈敏度vs其它測(cè)試?-預(yù)測(cè)反跳？-預(yù)測(cè)突變？-預(yù)測(cè)肝移植復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)？其他測(cè)試的靈敏度COBASAmplicorHBV靈敏度1101001,00010,000100,0001,000,00010,000,000100,000,000048122024WeeksoftherapyHBVDNAcopies/mL為什么進(jìn)行HBVDNA檢測(cè)HBVDNA檢測(cè)帶給我們的益處目前HBVDNA的檢測(cè)方法羅氏COBASAmplicor系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)新一代技術(shù)COBASTaqMan主要內(nèi)容COBASTaqMan實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)系統(tǒng)COBASTaqMan特點(diǎn)及益處動(dòng)態(tài)PCR整合定量標(biāo)準(zhǔn)，不需外標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)檢測(cè)管封閉，無(wú)需開(kāi)蓋四色熒光通道(計(jì)劃升級(jí)到六色) 檢測(cè)管:k-tubeork-plate寬廣的動(dòng)力學(xué)范圍連續(xù)檢測(cè)檢測(cè)時(shí)間從6小時(shí)減少到2～3小時(shí) 增加通量提供內(nèi)質(zhì)控減少污染風(fēng)險(xiǎn)允許多重PCR靶標(biāo)檢測(cè)可用于其他檢測(cè)模式(雜交探針)處理過(guò)程簡(jiǎn)單可與AmpliPrep聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化 益處特點(diǎn)COBASTaqMan定量原理0510152025300102030405060相對(duì)熒光強(qiáng)度None1ThresholdCycleThreshold(Ct)for108C/PCRHBVDNALogC/PCR2876543循環(huán)數(shù)COBASTaqManHBV檢測(cè)線(xiàn)性范圍COBASTaqManHBV檢測(cè)各亞型表現(xiàn)COBASTaqManHBVTestvsCAHBM

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