第二十章臨床免疫檢驗的質量保證目錄第一節(jié)基本概念第二節(jié)臨床免疫學檢驗的技術特點第三節(jié)分析前質量保證第四節(jié)分析中質量保證第五節(jié)分析后質量保證第一節(jié)基本概念重點提示質量保證：臨床實驗室為證明提供患者臨床診療或臨床實驗研究數據的有效性，采取一系列有效的措施，包括分析前、分析中和分析后的三個過程。敏感性:實際患病正確判斷為陽性（真陽性）的百分率。公式=TP/TP+FNTP=真陽性FN=假陰性如TP=85，FN=15，敏感性=85/(85+15)=85%特異性:實際無病者正確判斷為真陰性的百分率。公式=TN/TN+FPTN=真陰性FP=假陽性如TN=85，FP=15，敏感性=85/(85+15)=85%陽性預測值(PPV):特定試驗方法測定得到的陽性結果（包括假陽性）中真陽性的百分率。公式=TP/TP+FPTP=真陽性FP=假陽性如TP=85，FP=15，PPV=85/(85+15)=85%陰性預測值(NPV):特定試驗方法測定得到的陰性結果（包括假陰性）中真陰性的百分率。公式=TN/TN+FNTP=真陽性FP=假陽性如TN=85，FN=15，NPV=85/(85+15)=85%精密度:各個獨立測定結果間的一致性程度。用SD及CV表示準確度：待測物與真實值得一致程度。室內質量控制:由實驗室工作人員采取一定方法和步驟。連續(xù)評價本實驗室工作的可靠程度。主要檢查精密度。室間質量評價：客觀比較某一實驗室的測定結果與靶值得差異，由外單位采取一定方法，連續(xù)客觀評價實驗室的結果，發(fā)現誤差并校正結果，使各實驗室間的結果就有可比性。第二節(jié)臨床免疫學檢驗的技術特點重點提示陽性反應判斷值的設定臨床預測值根據陽性預測值對免疫測定方法的分類：篩查試驗；診斷試驗；確認試驗一、陽性反應判斷值的設定在大部分的免疫測定中，陽性人群標本檢測值的范圍與陰性人群標本檢測值的范圍往往會存在部分的重疊，因此為了判斷定性免疫測定的結果，需要設定判斷陰性或陽性結果的陽性反應判斷值(cut-offvalue)。需根據三組人群綜合考慮：患該病人群、健康人群及患其他疾病人群。1.為得到較高的PPV,陽性反應判斷值可能大大高于測定下限。如ELISA試驗測定丙肝病毒時，丙肝病毒在正常人群出現較高的陽性反應結果，因此陽性結果判斷值常遠高于測定下限。2.陽性反應判斷值依人群及年齡而不同。3.陽性反應判斷值判斷結果，假陽性和假陰性不可避免。因此需進一步確認。如HIV診斷二、臨床預測值

結果

50%感染率

30%感染率10%感染率1%感染率0.5%感染率

檢出(+)未檢出(－)

檢出(+)未檢出(－)

檢出(+)未檢出(－)

檢出(+)未檢出(－)

檢出(+)未檢出(－)+49,50050029,7003009,900100990104955

－50049,50070069,30090089,10099098,01099598,505敏感性(TP/[TP+FN])99%99%99%99%99%特異性(TN/[TN+FP])99%99%99%99%99%陽性預示值TP/[TP+FP]49500/[49500+500]=99.0%29700/[29700+700]=94.6%9900/[9900+900]=91.67%990/[990+990]=50%495/[495+995]=33.2%陰性預示值TN/[TN+FN]49500/[49500+500]=99.0%69300/[69300+300]=99.6%89100/[89100+100]=99.89%98010/[98010+10]=99.99%98505/[98505+5]=99.99%需根據三組人群綜合考慮：臨床預測值與特定感染性疾病在某一人群中的流行率直接相關。如一個具有敏感性和特異性的檢驗方法在流行率為10%的人群中，其PPV為67.9%，而在流行率為1%的人群中，其PPV低至16%。在臨床上對懷疑某種疾病的患者進行檢測，則PPV大大提高，相反，對所有常規(guī)就診者，則PPV很低。三、根據陽性預測值對免疫測定方法的分類篩查試驗(screeningtests)用于檢測整個人群或部分人群中抗原或抗體的存在情況。一般而言，篩查試驗應當具有較高的臨床敏感性（即臨床檢出率大于95%），對其特異性的要求（和陽性預測值）則取決于對各種因素的綜合考慮，例如假陽性結果是否會對被檢測人經濟或心理上產生嚴重的不良影響、對誤診病例的治療是否會產生嚴重的后果（例如，由于風疹抗體水平較高，而懷疑妊娠期感染，為避免感染造成的不良后果，需要進行流產手術以終止妊娠）、是否有可以對陽性篩查結果進行確認的方法、確認是否易于執(zhí)行、確認方法是否價格昂貴等。通常情況下，篩查試驗結果陰性提示被檢測人待測物陰性的可能性很高，而篩查試驗結果陽性僅提示陽性結果的可能，但需要進一步的確認。診斷試驗診斷試驗(diagnostictests)用于檢測臨床上已懷疑某種疾病的患者中抗原或抗體的存在情況。如果待測的抗原或抗體對于治療以及判斷預后有重要意義，則該診斷試驗應當具有足夠高的敏感性。如果試驗的結果可以很容易地通過確認試驗進行確認，且確認試驗的準確性高，那么對診斷試驗的特異性要求可適當降低。確認試驗確認試驗（confirmatorytests）用于對篩查試驗或者診斷試驗結果的確認。對于確認試驗，特異性和陽性預測值比敏感性和陰性預測值更為重要，確認試驗的特異性應當大于99%。確認試驗可以是免疫測定，也可以是培養(yǎng)或核酸檢測。一般來說，可以作為確認試驗的免疫測定方法有免疫印跡試驗、重組免疫印跡、抗體中和試驗等，但這些方法不一定就是確認試驗，這取決于試劑的特異性是否足夠高。如果診斷試驗本身的特異性和陽性預測值就很高，那么就沒有必要再使用確認試驗進行結果的確認。第三節(jié)分析前質量保證分析前質量保證檢驗項目的申請患者的準備標本的采集標本的運送標本的接收標本的保存血清中影響檢測結果的常見內源性干擾因素一、檢驗項目的申請（二）檢驗項目的申請原則臨床醫(yī)生根據疾病的診療需要選擇合適的檢驗項目，保證項目的有效性、及時性和經濟性。臨床上絕大多數免疫學方法僅能作為篩查或診斷試驗，也存在一定比例的假陽性，因此只能用于輔助診斷。如有肝炎的患者，可申請做肝炎全套檢測；對正常人，陽性結果不能用于診斷，需進一步確認。（二）申請單格式和填寫受檢者的唯一標識（姓名、年齡、科別、病房、門診號/住院號）、臨床診斷或疑似診斷、標本類型、檢驗項目、送檢日期（年、月、日）、標本采集時間和接收時間；收費/記賬及檢驗號。

（二）申請單格式和填寫受檢者的唯一標識（姓名、年齡、科別、病房、門診號/住院號）、臨床診斷或疑似診斷、標本類型、檢驗項目、送檢日期（年、月、日）、標本采集時間和接收時間；收費/記賬及檢驗號。（三）申請檢驗項目的時間患者處于疾病感染的窗口期，抗原抗體無法檢測病毒感染IgM升高在早期IgG在感染早期和恢復期，需采雙份血清，過早或過晚可能導致陰性結果。生物素-親和素系統檢測時，使用5mg/d生物素治療，至少用藥8小時才能采樣

二、患者的準備（一）標本采集確定患者的身份，核實患者的姓名、性別、住院號等信息。不清醒者，找家屬或醫(yī)護人員加以確認三標本的采集最常用的標本：血液，包括血清、血漿和全血，也可用唾液或尿液。尿液標本，需采集“中段尿”。建議采用真空采血管及蝶形針具，以免直接接觸血液。采集容器最好為一次性無菌密閉容器對激素如可的松在早晨4:00-6:00，會出現一峰值，從臥位到站位，血清中腎素活性增高；激素和治療藥物、感染性病原體、抗原、抗體、腫瘤標志物、特定蛋白等，無時間和體位的要求。四標本的運送運送過程需密閉、防震、防漏和防污染。特殊標本如胰島素、C肽等需冰盒送檢五標本的接收1.標本的溶血：避免嚴重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團，有類似過氧化氫酶活性，在ELISA如血清中血紅蛋白濃度過高，易吸附于固相，從而與加入的HRP底物反應顯色，產生假陽性或陰性。2.細菌的污染一是分泌的酶能分解抗原抗體等蛋白二是細菌的內源性酶對測定方法的酶標記物有干擾作用六標本的保存標本接收后，應立即進行檢測如不能立即檢測，血清標本分離血清后可2~8℃保存一周，如為無菌操作，建議-20℃保存七血清中影響檢測結果的內源性干擾因素1.RFRF具有與變性IgG產生非特異性結合的特點，在ELISA中，可與固相包被的IgG-RF-酶標特異IgG抗體，出現假陽性結果，尤其在捕獲法IgM性抗體表現尤為典型。2.補體在固相抗體及酶標二抗均有激活人補體的功能。一是它們在吸附過程中，抗體分子結構改變，激活C1q,將兩者橋聯，導致假陽性結果；另一方面固相抗體也因活化補體的結合，封閉抗體的抗原結合能力，導致引起假陰性結果3.嗜異性抗體在人類血清中含有抗嚙齒類動物（如鼠、馬及羊）的免疫球蛋白抗體，一般結合在Fab段，可通過交聯固相和酶標的單抗或多抗出現假陽性反應。4.自身抗體自身抗體如抗甲狀腺球蛋白抗體、抗胰島素抗體等，能與相應的靶抗原結合，干擾ELSIA抗原的測定5.溶菌酶:與等電點較低的蛋白質有較強的結合能力，在雙抗體夾心法仲，可與固相的IgG和酶標的IgG形成橋聯，從而導致假陽性。第四節(jié)分析中的質量保證重點提示實驗室環(huán)境條件儀器設備維護校準試劑方法的性能驗證標準操作程序的建立人員培訓標本前處理室內質量控制室間質量評價或實驗室間比對一實驗室環(huán)境條件空間充分合理的空間良好的照明空調設備二、儀器設備維護校準溫度濕度不只是為了儀器設備運行抗原抗體結合反應與環(huán)境溫度和濕度均有關系實驗室儀器設備及管理加樣器：維護、校準熒光顯微鏡：維護、校準水浴箱：維護、校準酶標儀：維護、校準洗板機：維護離心機：維護生物安全柜：維護冰箱：維護三試劑方法的性能驗證精密度或重復性（定性和定量）：定性測定時不能使用強陽性或陰性標本，只能使用接近臨界濃度的標本；定量測定時通過標準差和變異系數來評估準確度（定性和定量）:定性時將待驗證方法與公認（金標準或參考方法），比較兩種方法之間結果的差異性，一般用陽性或陰性符合率來評價（要求95%以上）；定量評價測定結果與真實結果的差異線性（定量）可報告范圍（定量）檢出限（定性）：是指被檢體系重復檢測出待測物質的最低濃度水平。如采用濃度為檢測下限的標本檢測至少20次，如產生95%的陽性結果，則驗證通過參考區(qū)間（定量）;劃分正常或異常人群。一般有廠家或方法建立者提供抗干擾能力（定性和定量）四標準操作程序的建立需要將每個操作步驟標準化，并形成標準操作程序。最重要的是在測定中，所有的實驗技術人員在進行相關測定時，必須嚴格按相應的SOP進行操作，除非經實際工作證明正在使用的SOP中有不適當之處時，才可對SOP按一定程序進行修改。五人員培訓實驗人員需具有一定的專業(yè)技術知識和經驗，包括檢測技術的基本原理、實驗操作、儀器設備的使用、維護和保養(yǎng)、質量保證、質量控制、生物安全、結果的報告和解釋等。從實際工作來看，不同的操作者所得到的測定結果，往往差異很大。因此人員的培訓非常重要，應根據實際工作的需要，建立定期培訓計劃。六標本前處理血液采集后，如收集管中無促凝劑或抗凝劑，則血液通常在半小時后開始凝固，18小時～24小時完全凝固。日常檢驗中，常在血液還未開始凝固時即離心分離血清，此時分離出的血清仍殘留部分纖維蛋白原，易造成假陽性結果。因此，血液標本采集后，應使其充分凝固后再分離血清，或標本采集時用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當的促凝劑。七室內質量控制統計室內質量控制方法非統計室內質量控制方法Levey-Jennings質控圖方法也稱Shewhart質控圖，是由美國的Shewhart于1924年首先提出，并用于工業(yè)產品的質量控制。二十世紀五十年代初，Levey-Jennings將其引入臨床檢驗的質量控制。經Henry和Segalove的改良，即為目前常用的Levey-Jennings質控圖。Levey-Jennings質控圖方法Levey-Jennings質控圖方法統計學含義1.±2s為告警限，±3s為失控限，穩(wěn)定條件下，在20次結果中不應有多于1個結果超過2SD（95.5%可信限）限度；在1000個測定結果中超過3SD（99.7%可信限）的結果不多于3個。如以±3s為失控限，假失控的概率為0.3%。2.在每批病人標本測定的同時測定質控品，將所得結果標在質控圖上，質控品在控時，方能報告該批病人標本的測定結果，質控品失控時，說明測定過程存在問題，不能報告病人標本結果，應解決存在的問題，并重新測定在控后方能報告3.當使用一個以上濃度的質控品想在同一張質控圖描點時，則質控圖上均值和s可不標具體數據如以±3s為失控限，假失控的概率為0.3%。4.若以均值±2s為失控限，假失控的概率太高，通常不能接受；以均值±3s為失控限，假失控的概率低，但誤差檢出能力不強陽性率的統計室內質量控制方法按統計學規(guī)律，一個事件發(fā)生的概率小于5%被稱為小概率事件，即發(fā)生的可能性很小。當一個小概率事件發(fā)生時，則可能有誤差存在，有必要對其發(fā)生的原因進行分析。對每天的日常病人結果中陽性率出現的概率進行計算，如果這種結果出現的概率小于5%時，則可判為失控。根據二項式分布的概率計算如在一個實驗室中某檢測結果的陽性率為p，計算在n個患者樣本中有m個陽性結果的概率。根據二項式分布的概率計算公式如下：Pm=

Pm<5%為失控。此時，陰性標本可以發(fā)出報告，所有陽性標本在查清原因后重做。

根據二項式分布的概率計算如果一個實驗室檢測HBsAg，平常病人結果的陽性率為10%，即p=0.1,在某一次檢測19個樣本出現5個陽性結果，14個陰性結果，則檢測過程中是否存在污染的可能性可通過下述方法計算。即計算在19個樣本中出現至少5個陽性結果的概率，此時的概率為1-（獲得0個或1個或2個或3個或4個陽性結果的概率）即：1?[P(0)+P(1)+P(2)+P(3)+P(4)]=1?[0.919+19(0.9)18(0.1)+171(0.9)17(0.1)2+969(0.9)16(0.1)3+3876(0.9)15(0.1)4]=0.035說明在該實驗室19個標本中獲得5個或5個以上陽性結果的概率為3.5%，屬于小概率事件，結果失控，有假陽性結果的可能。非統計室內質量控制方法在檢測臨床標本的同時，檢測靶抗原或抗體接近試劑測定下限的質控品，并與臨床標本的測定同時進行，以判斷檢測的有效性。檢測結果為陽性，則質控品在控。適用于定性和半定量免疫檢驗，如沉淀試驗、凝集試驗、熒光免疫試驗、固相膜免疫分析技術或非定量的酶免疫試驗和化學發(fā)光免疫試驗等?？购丝贵w熒光免疫試驗室內質控品1:1001:1601:3201:6401:1000弱陽性樣本較強陽性樣本室內質控品的基本條件1.基質與待測標本一致,如標本為血清，質控品也應為血清2.室內質控品要求其所含待測物的濃度接近試驗或臨床決定性水平（對定性試驗來說，是指特定試驗的檢驗下限，即特定試劑的陽性反應判斷值，更能靈敏反應常規(guī)測定中批間變異；對定量測定來說，反映具有臨床診療價值3.良好的穩(wěn)定性4.靶值或預期結果已定;室內質控品濃度接近試驗的決定水平，其靶值或預期結果是已知的5.無已知的傳染危險性：經血液傳播的病原體如HIV、HCV和HBV等必須做滅活處理6.單批可大量獲得7.價廉失控后的常見原因1.測定操作中的隨機誤差2.儀器的問題3.試劑的問題4.室內質控品失效（二）室內質控的局限性可確保實驗室室內測定質量的一致性，確保臨床測定過程及結果在精密度方面達到預定的標準。但不能保證在單個的測定樣本中不出現誤差。比如標本吸取錯誤、結果記錄錯誤等。八室間質量評價為客觀地比較某一實驗室的測定結果與靶值的差異，由外單位機構，采取一定的方法，連續(xù)、客觀地評價實驗室的結果，發(fā)現誤差并校正結果，使各實驗室之間的結果具有可比性。是對實驗室操作和實驗方法的回顧性評價，而不是用來決定實時的測定結果的可接受性。通過參與EQA，實驗室可對自己的實驗操作進行糾正，從而起到自我教育的作用。第五節(jié)分析后的質量保證重點提示結果的報告與解釋檢驗后標本的保存與處理咨詢服務結果的報告基本信息①患者的姓名、性別、年齡；②送檢科室或單位名稱；③標本采集時間和實驗室接收標本時間；④標本的編號或條碼；⑤檢測項目；⑥標本類型；⑦檢測方法和主要設備等。結果的報告篩查試驗或診斷試驗的陽性結果應當報告為“反應性”或“陽性反應”。如未發(fā)生抗原抗體的反應，則報告為“陰性”。確認試驗的結果可直接報告“陽性”或“陰性”。結果的報告將檢測結果對應檢測項目的名稱，列在報告單上。定量檢測應注明項目的參考區(qū)間或檢測方法的線性或測定范圍；定性檢測篩查試驗或診斷試驗報告“反應性”（陽性反應）或“陰性”，確認試驗的結果報告“陽性”或“陰性”，并提供報告結果的測定范圍。檢測人、審核人、復核人簽字，結果報告日期和備注。結果的解釋需清楚說明結果對疾病的診斷意義，即指出該檢測結果提示疾病的可能性。說明在何種情況下有可能為假陽性或假陰性結果。排除假陽性或假陰性結果的方法（進一步檢測或追蹤）。如果已在進行進一步的檢測，應在報告中予以說明。臨床解釋的責任屬于臨床醫(yī)生，臨床醫(yī)生通過綜合患者臨床信息解釋結果和其他檢測結果來對特定的免疫測定結果作出最終解釋。檢驗后標本的保存與處理檢驗后標本的保存檢驗后標本的檢索檢驗后標本的處理咨詢服務咨詢服務的提供與臨床的溝通本章小結由于免疫學檢驗的原理主要是抗原抗體的相互作用，陽性反應判斷值的設定決定了免疫測定存在假陽性和假陰性的可能。對于臨床而言，免疫測定方法的臨床預測值是最為重要的參數。根據陽性預測值的高低，可將免疫測定方法分為篩查試驗、診斷試驗和確認試驗三種。臨床上絕大部分開展的免疫學檢驗，都是僅能作為篩查試驗或診斷試驗，陽性結果僅代表在檢測中發(fā)生了抗原抗體的陽性反應，但陽性反應可能是真陽性，也可能是假陽性，也就是說存在一定比例的假陽性可能。由于免疫檢驗方法學的這一局限性，在免疫檢驗的分析前、分析中和分析后質量保證中，都涉及到與其他檢驗項目不同的特點，突出表現在檢