第五章生物制品生產(chǎn)第一頁，共一百二十一頁。1主要內(nèi)容第一節(jié)細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)第二節(jié)

動物細(xì)胞制藥第三節(jié)

植物次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)第二頁，共一百二十一頁。2第一節(jié)

細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)

大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是建立在實驗室培養(yǎng)方法（貼壁培養(yǎng)法和懸浮培養(yǎng)法）的基礎(chǔ)上，再利用固定化細(xì)胞、人工灌注、生物反應(yīng)器技術(shù)等技術(shù)發(fā)展起來的。

一、細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式二、大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)第三頁，共一百二十一頁。3一、細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式培養(yǎng)方式分為：分批式流加式培養(yǎng)半連續(xù)式連續(xù)灌注式第四頁，共一百二十一頁。41、分批式培養(yǎng)指先將細(xì)胞和培養(yǎng)液一次性裝入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞不斷生長，產(chǎn)物不斷形成，經(jīng)一段時間后，終止培養(yǎng)。第五頁，共一百二十一頁。5分批式培養(yǎng)特點①系統(tǒng)密閉，只允許氣體和揮發(fā)性代謝物質(zhì)與外界交換。②培養(yǎng)基體積固定，當(dāng)主要營養(yǎng)物質(zhì)耗盡時，細(xì)胞即停止生長，又稱為分批培養(yǎng)或間歇培養(yǎng)，多在3-5d/批。③細(xì)胞數(shù)目、總重量、DNA含量呈“S”形(五個時期)變化。④為保證細(xì)胞不斷增殖，須在達(dá)到最大重量時取出1/5～1/3的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移繼代培養(yǎng)。⑤是傳統(tǒng)的、常用的方法，可直接放大。其工業(yè)反應(yīng)器規(guī)模可達(dá)12000L。第六頁，共一百二十一頁。6第七頁，共一百二十一頁。72、半連續(xù)式（流加式）培養(yǎng)

指在分批式培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，將分批培養(yǎng)的培養(yǎng)液部分取出，并補充加入等量的新鮮培養(yǎng)基，使反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的總體積保持不變。第八頁，共一百二十一頁。83、流加式培養(yǎng)在分批式操作的基礎(chǔ)上，在培養(yǎng)過程中根據(jù)細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗和需求，流加濃縮的營養(yǎng)物或培養(yǎng)基，從而使細(xì)胞持續(xù)生長至較高的密度，目標(biāo)產(chǎn)品達(dá)到較高的水平。由于流加式培養(yǎng)能控制更多的環(huán)境參數(shù)，使得細(xì)胞生長和產(chǎn)物生成容易維持在優(yōu)化狀態(tài)，是當(dāng)前動物細(xì)胞培養(yǎng)工藝中占有主流優(yōu)勢的培養(yǎng)工藝。第九頁，共一百二十一頁。94、連續(xù)灌注式培養(yǎng)是把細(xì)胞接種后進(jìn)行培養(yǎng)，新鮮的培養(yǎng)液不斷從反應(yīng)器一頭加入，從另一頭不斷取出等量的培養(yǎng)液，細(xì)胞仍留在反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞處于一種營養(yǎng)不斷供應(yīng)狀態(tài)。使反應(yīng)條件處于一種恒定狀態(tài)。第十頁，共一百二十一頁。10連續(xù)灌注式培養(yǎng)特點1）不斷加入新培養(yǎng)基，保證了營養(yǎng)物質(zhì)的充分供應(yīng)。2）培養(yǎng)期細(xì)胞增殖速度快，細(xì)胞生長速率長久地保持在對數(shù)生長期，形成一個穩(wěn)定的培養(yǎng)狀態(tài)。3）適用于細(xì)胞大規(guī)模工業(yè)化培養(yǎng)。4）由于連續(xù)培養(yǎng)需要的設(shè)備比較復(fù)雜，投入較大，且要維持細(xì)胞無菌狀態(tài)，技術(shù)條件要求苛刻，因此未得到廣泛應(yīng)用。第十一頁，共一百二十一頁。11第十二頁，共一百二十一頁。12開放式連續(xù)培養(yǎng)----細(xì)胞隨排出培養(yǎng)液一起流出且速度恒定。在穩(wěn)定狀態(tài)下流出細(xì)胞的速率等于培養(yǎng)系統(tǒng)中新細(xì)胞的增長速率。封閉式連續(xù)培養(yǎng)----新鮮培養(yǎng)液和老培養(yǎng)液以等量方式進(jìn)出，而收集的細(xì)胞重新放入原培養(yǎng)系統(tǒng)中繼續(xù)培養(yǎng)，故培養(yǎng)系統(tǒng)中細(xì)胞數(shù)量是在不斷增加的。

第十三頁，共一百二十一頁。13第十四頁，共一百二十一頁。14二、大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)方法按供養(yǎng)方式分為三種：

攪拌式、氣升式、旋轉(zhuǎn)式按細(xì)胞固定分為四種：

懸浮培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、

微囊化培養(yǎng)、

微導(dǎo)管培養(yǎng)（中空纖維培養(yǎng)）。第十五頁，共一百二十一頁。15機械攪拌式(Spinner)機械攪拌式主要是通過不銹鋼攪拌系統(tǒng)使培養(yǎng)物的混勻。在罐體頂端有一些傳感器，監(jiān)測培養(yǎng)物的溫度、pH值、溶氧度(DO)、葡萄糖消耗、NH3、NH4+等參數(shù)。這種反應(yīng)器培養(yǎng)規(guī)?？蛇_(dá)2000L。第十六頁，共一百二十一頁。16該系統(tǒng)優(yōu)點：（1）設(shè)計簡單，操作方便，易于放大生產(chǎn)；（2）細(xì)胞密度高，達(dá)到107/mL以上；（3）便于無菌操作，不易污染；（4）氧的轉(zhuǎn)換率高，能滿足細(xì)胞在生長時所需的要求。缺點：對細(xì)胞損傷較大，產(chǎn)物含量不高。第十七頁，共一百二十一頁。17氣升攪拌式氣體從罐底的噴射管進(jìn)入反應(yīng)器的導(dǎo)流管。湍流溫和而均勻，循環(huán)量大，細(xì)胞與培養(yǎng)液混合均勻。剪切力小，細(xì)胞的傷害小。噴射供氧，氧傳遞速率高，供氧良好。適用于懸浮細(xì)胞分批培養(yǎng)、微載體和連續(xù)培養(yǎng)。第十八頁，共一百二十一頁。18

工作原理

反應(yīng)器運轉(zhuǎn)時，圓筒以30-60

r/min的速度轉(zhuǎn)動，由于離心力的作用，攪拌器中心管內(nèi)產(chǎn)生負(fù)壓，使攪拌器外培養(yǎng)基流入中心管，沿管螺旋上升，再從導(dǎo)流筒口排出，從攪拌器外沿下降，形成循環(huán)流動。在氣腔內(nèi)氣體由分布管鼓泡，氣體溶于液體中，依靠氣腔絲網(wǎng)外液體的循環(huán)流動及擴散作用，使溶于液體中的氣體成分均勻地分布到反應(yīng)器內(nèi)。第十九頁，共一百二十一頁。19Celltech公司采用氣升式反應(yīng)器培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，生產(chǎn)單克隆抗體。生產(chǎn)周期為14~400h。從10L逐級放大到10000L。17d生產(chǎn)抗體100g，抗體合成大多數(shù)處于穩(wěn)定期和衰退期，比傳統(tǒng)搖瓶提高約5倍。第二十頁，共一百二十一頁。20通氣攪拌式細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器第二十一頁，共一百二十一頁。21第二十二頁，共一百二十一頁。22第二十三頁，共一百二十一頁。23旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)20世紀(jì)90年代中期，美國宇航局開發(fā)一系列旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(Therotarycellculturesystem,RCCS)，又叫回轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器(Rotatingwallvesselbiore-actor,RWVB)。RCCS是繞水平軸旋轉(zhuǎn)、無氣泡、膜擴散式氣體交換的培養(yǎng)系統(tǒng)。第二十四頁，共一百二十一頁。24該反應(yīng)器是將細(xì)胞種植到微載體后，將其移入RCCS圓柱狀的培養(yǎng)容器內(nèi)，加滿培養(yǎng)液。整個容器由電機驅(qū)動沿水平軸旋轉(zhuǎn)，細(xì)胞微載體顆粒在水平軸內(nèi)建立均質(zhì)的液體懸浮軌道，并隨容器一起旋轉(zhuǎn)且不與容器壁和其它物體相撞。細(xì)胞通過膜式氣體交換器來吸氧和排出CO2。由于系統(tǒng)無推進(jìn)器、氣泡或攪拌器,使破壞性應(yīng)力減到最小。因此，細(xì)胞可以在相對溫和的環(huán)境中進(jìn)行三維生長，得到類似人體內(nèi)的培養(yǎng)產(chǎn)物.近年來已經(jīng)廣泛應(yīng)用于微載體系統(tǒng)，至今已有近百種組織細(xì)胞均在該系統(tǒng)內(nèi)成功進(jìn)行了大規(guī)模擴增。第二十五頁，共一百二十一頁。25第二十六頁，共一百二十一頁。26懸浮培養(yǎng)與微生物的肉湯培養(yǎng)基本相同。懸浮培養(yǎng)細(xì)胞增殖快、產(chǎn)量高，沒有接觸抑制特性，是動物大規(guī)模培養(yǎng)的理想方法。但只有極少數(shù)動物細(xì)胞適宜進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，適用于確立細(xì)胞株（系）、雜交瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、血液和淋巴細(xì)胞培養(yǎng)。第二十七頁，共一百二十一頁。27微載體培養(yǎng)微載體為三維培養(yǎng)系統(tǒng)，細(xì)胞貼附于微載體上伸展和增殖，微載體懸浮于培養(yǎng)液中。微載體培養(yǎng)具貼壁和懸浮培養(yǎng)的雙重優(yōu)點，有很大的比表面積，供單層細(xì)胞貼附和增殖。懸浮微球使細(xì)胞生長的環(huán)境均一，培養(yǎng)基利用率高，重復(fù)性好，容易放大。20世紀(jì)80年代正式用于工業(yè)化生產(chǎn)干擾素、疫苗和尿激酶原等。第二十八頁，共一百二十一頁。28理想的微載體所具備的性能：質(zhì)地柔軟，微球間摩擦輕；耐高溫，可高壓滅菌；透明性，便于觀察細(xì)胞生長；細(xì)胞相容性，利于貼附和生長；無毒性和惰性，對細(xì)胞無毒害，不產(chǎn)生有害物質(zhì)，不吸附培養(yǎng)基；低速即懸浮，靜止即沉降，便于換液和收獲；微粒大小均勻；可回收重復(fù)使用。第二十九頁，共一百二十一頁。29

為了提高貼壁能力，對基質(zhì)表面進(jìn)行包埋，如血清蛋白、多聚賴氨酸處理，可加速貼壁過程。

懸浮培養(yǎng)早期，還可向培養(yǎng)液補充丙酮酸、腺嘌呤、次黃嘌呤、胸腺嘧啶等。將這些微載體懸浮在培養(yǎng)液中，大大增加細(xì)胞的貼壁面積，可使每毫升培養(yǎng)基達(dá)到1000萬個（108）細(xì)胞的密度。第三十頁，共一百二十一頁。30常用微載體玻璃珠：直徑約2～3μm，密度1.5g/cm3。在玻璃表面覆蓋塑料或中空玻璃也可達(dá)到此密度。葡聚糖微載體：帶正電，干粉在pH7.2的磷酸鹽緩沖液中吸脹，清洗滅菌后使用。Cytodex2：電荷性大大下降，吸附能力很低，適合于蛋白質(zhì)藥物的生產(chǎn)。纖維素微載體DE52和DE53：適合多種細(xì)胞培養(yǎng)。聚丙烯酰胺載體：貼壁較快，親水性。第三十一頁，共一百二十一頁。31多孔微載體：

直徑0.2～5mm，孔徑20～300μm，達(dá)占總體積的85%，極大地增加了比表面積，可實現(xiàn)細(xì)胞的固定化，達(dá)到高密度培養(yǎng)。

廣泛使用的有：Cellsnow、Cytocell（纖維素基質(zhì)）、Verax、Cultisphere（膠原）、Cytoline1和2（聚苯乙烯）、ImmobaSil（硅橡膠）及Siran（玻璃）等。

主要用于攪拌、固定床和流化床反應(yīng)器。第三十二頁，共一百二十一頁。32第三十三頁，共一百二十一頁。33微囊化培養(yǎng)

利用固定化細(xì)胞技術(shù)，將一定量細(xì)胞與約4％的褐藻酸鈉混合后，滴到CaCl2溶液中，構(gòu)成半透性微膠囊。又稱固定化細(xì)胞、大載體培養(yǎng)法。第三十四頁，共一百二十一頁。34

1）細(xì)胞在微膠囊內(nèi)生長，既吸收外界營養(yǎng)，又可排出自身代謝物。2）細(xì)胞所受的剪切力損傷小，細(xì)胞生長良好，純度提高。便于連續(xù)培養(yǎng)，提高培養(yǎng)細(xì)胞的利用率；3）細(xì)胞培養(yǎng)密度高，生長緩慢，有利于次生代謝產(chǎn)物的積累，提高產(chǎn)量。第三十五頁，共一百二十一頁。354）次生代謝物直接分泌到培養(yǎng)液中，可簡化分離、收獲步驟，提高工作效率。如次生代謝物不分泌，培養(yǎng)結(jié)束后，收獲微囊，破微囊，純化抗體。5）固定化細(xì)胞的氧氣、營養(yǎng)供應(yīng)與傳遞及細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性等問題有待于進(jìn)一步研究解決。

這種培養(yǎng)方法是生產(chǎn)單克隆抗體、干擾素的一種有效培養(yǎng)方法。目前，美國藥用產(chǎn)品大規(guī)模生產(chǎn)常用此法進(jìn)行。第三十六頁，共一百二十一頁。36第三十七頁，共一百二十一頁。37第三十八頁，共一百二十一頁。38中空纖維（微導(dǎo)管）培養(yǎng)是模擬體內(nèi)細(xì)胞三維生長環(huán)境而發(fā)明的。將由硝酸纖維素或醋酸纖維素構(gòu)成外徑不超過1mm（φ≤1mm）的微導(dǎo)管平鋪成層，相當(dāng)于體內(nèi)的毛細(xì)血管。微導(dǎo)管表面貼壁生長細(xì)胞，管內(nèi)通無菌空氣，管外浸泡在培養(yǎng)液中，氣體、水分及其它營養(yǎng)物質(zhì)可以通過微導(dǎo)管與細(xì)胞進(jìn)行交換。微導(dǎo)管表面的細(xì)胞密度可達(dá)100萬/cm2個。細(xì)胞密度可達(dá)108/mL。第三十九頁，共一百二十一頁。39接種孔水套層產(chǎn)物出口培養(yǎng)基入口產(chǎn)物出口培養(yǎng)基入口內(nèi)膜外膜腔室細(xì)胞培養(yǎng)基分散后,灌入床層。纖維管壁薄，半透膜，截留不同分子量。纖維管的空腔組成的內(nèi)室：灌流含氧氣的培養(yǎng)基纖維管之間的空間組成的外室：細(xì)胞生長。第四十頁，共一百二十一頁。40

細(xì)胞分泌的產(chǎn)物和血清中的成分由于分子量較大而無法進(jìn)入內(nèi)室，產(chǎn)物只能在外室積累和濃縮。

細(xì)胞代謝的廢物是小分子物質(zhì)，可滲透進(jìn)入內(nèi)室，從內(nèi)腔開口排出，避免了對細(xì)胞的毒性。

在收獲時，打開纖維管之間的外室開口，產(chǎn)物就流出來。此時雖然細(xì)胞停止分裂，但細(xì)胞的存活、健康和核形態(tài)不變，代謝和分化功能仍可保持?jǐn)?shù)月。第四十一頁，共一百二十一頁。41第二節(jié)動物細(xì)胞生物制藥用動物細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)來生產(chǎn)有功能的蛋白質(zhì)，特別是人源細(xì)胞的培養(yǎng)，在藥物生產(chǎn)中的位置越來越重要。一、表達(dá)蛋白的宿主系統(tǒng)二、生產(chǎn)用動物細(xì)胞的要求三、常用動物細(xì)胞的特性四、基因工程細(xì)胞構(gòu)建和篩選五、細(xì)胞庫的建立第四十二頁，共一百二十一頁。42

常見的動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物

疫苗小兒麻痹癥疫苗、狂犬疫苗、腦炎疫苗、皰疹疫苗、風(fēng)疹疫苗單克隆抗體IgG、IgM、IgA等免疫調(diào)節(jié)劑細(xì)胞生長因子、干擾素、白細(xì)胞活化因子、胸腺肽酶胰蛋白酶、尿激酶、膠原酶、胃蛋白酶激素生長激素、促紅細(xì)胞生成素第四十三頁，共一百二十一頁。43基因工程藥物生產(chǎn)示意圖第四十四頁，共一百二十一頁。44一、表達(dá)目的蛋白的宿主系統(tǒng)總體分為：原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)。常見的宿主系統(tǒng)

細(xì)菌、酵母、霉菌、絲狀真菌、植物細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞等。第四十五頁，共一百二十一頁。45原核表達(dá)系統(tǒng)----細(xì)菌特點：繁殖快、易于培養(yǎng)，限制：表達(dá)的蛋白質(zhì)缺乏轉(zhuǎn)錄后的修飾；原核系統(tǒng)表達(dá)的蛋白一般為胞內(nèi)產(chǎn)物，需要破碎細(xì)胞提取產(chǎn)物，給產(chǎn)物的分離純化帶來困難；還易受外源毒素的污染。

第四十六頁，共一百二十一頁。46真核表達(dá)系統(tǒng)特點表達(dá)后的蛋白有修飾作用，與人體自身分泌的天然蛋白非常近似；動物細(xì)胞表達(dá)的蛋白都是胞外分泌，產(chǎn)物的分離純化過程非常簡單。但是，動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)比較復(fù)雜，目前仍處于發(fā)展完善階段。第四十七頁，共一百二十一頁。47表達(dá)系統(tǒng)的選擇原核表達(dá)系統(tǒng)：一般“小分子、結(jié)構(gòu)簡單”的蛋白生產(chǎn)，且蛋白轉(zhuǎn)錄后無需修飾，如胰島素；真核表達(dá)系統(tǒng)：主要“生產(chǎn)大分子、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白”，并且轉(zhuǎn)錄后的修飾對蛋白的生物活性具有重要影響，如組織型纖溶酶原激活劑(tPA）、促紅細(xì)胞生成素等（EPO）等。對既可用原核、可用真核表達(dá)的蛋白如α-干擾素、人生長激素等，應(yīng)綜合考察生產(chǎn)的經(jīng)濟成本和技術(shù)難易程度等選擇表達(dá)系統(tǒng)。第四十八頁，共一百二十一頁。48

口蹄疫疫苗生產(chǎn)示意圖第四十九頁，共一百二十一頁。49過去使用動物生產(chǎn)的生物制品，經(jīng)常發(fā)生過敏反應(yīng)或病原體傳染事件。如脊髓灰質(zhì)炎疫苗可能被猿猴腎病毒污染；用人血制備的某些生物制品可能被肝炎或艾滋病病毒污染。采用細(xì)胞工程生產(chǎn)的產(chǎn)品能將致病因素降到最?。簞游锛?xì)胞培養(yǎng)所用的細(xì)胞背景明確，經(jīng)過嚴(yán)格的安全檢測，消除了污染病原體的危險。第五十頁，共一百二十一頁。50實例EPO的生產(chǎn)：以前需要從2500L再生障礙性貧血病人的尿液中才能提取極微量的EPO用于實驗室分析?，F(xiàn)在，通過大規(guī)模培養(yǎng)基因工程細(xì)胞生產(chǎn)的EPO，已經(jīng)治療了成千上萬的腎性貧血的病人。胰島素的生產(chǎn)：過去從豬胰腺中提取胰島素，但某些患者會引起抗原抗體反應(yīng)?；蚬こ炭梢杂萌艘葝u素基因生產(chǎn)人源化蛋白，克服免疫反應(yīng)的缺點。第五十一頁，共一百二十一頁。51動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的不足

細(xì)胞生長緩慢，生產(chǎn)效率較低，產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他表達(dá)系統(tǒng)。如骨髓細(xì)胞MPG-11生產(chǎn)IgG，每個細(xì)胞1分鐘為5pg，10L反應(yīng)器，細(xì)胞密度為107/mL，生產(chǎn)能力不到1

g/d。

連續(xù)細(xì)胞系增加了生長和代謝速率，但同時導(dǎo)致了副產(chǎn)物的增加。

第五十二頁，共一百二十一頁。52

動物細(xì)胞對培養(yǎng)條件要求苛刻和敏感，對溫度、pH、滲透壓、剪切力等忍受能力差。

需要添加氨基酸、維生素、血清、生長因子等，

培養(yǎng)基要求高，生產(chǎn)費用較高。

第五十三頁，共一百二十一頁。53原代細(xì)胞二倍體細(xì)胞系轉(zhuǎn)化細(xì)胞系

二、生產(chǎn)用動物細(xì)胞的要求第五十四頁，共一百二十一頁。54⒈原代細(xì)胞

直接取自動物組織器官，經(jīng)過粉碎消化而獲得的細(xì)胞懸液（109/g）。

需要大量動物，費錢費勞力。細(xì)胞質(zhì)量不穩(wěn)定。常用雞胚細(xì)胞、原代兔腎細(xì)胞、鼠腎細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等。第五十五頁，共一百二十一頁。552.二倍體細(xì)胞系

原代細(xì)胞經(jīng)過傳代、篩選克隆，從多種細(xì)胞成分中，挑選并純化出具有一定特征的某種細(xì)胞株。

特點①正常細(xì)胞的染色體2n核型；②貼壁依賴接觸抑制；③可傳代培養(yǎng)50代；④無致瘤性。第五十六頁，共一百二十一頁。56

3.轉(zhuǎn)化細(xì)胞系

通過某個轉(zhuǎn)化過程形成的，常由于染色體斷裂變成異倍體，失去正常細(xì)胞特點，而獲得無限增殖能力。轉(zhuǎn)化過程可以是自發(fā)的、人工的、或從腫瘤組織中產(chǎn)生。第五十七頁，共一百二十一頁。57三、常用動物細(xì)胞的特性W1-38

人胚胎肺組織二倍體成纖維細(xì)胞系。核型為2n=46。

貼壁生長，能產(chǎn)生膠原，同工酶為G6PD-B型。培養(yǎng)基用EBM加10%小牛血清，pH7.2。倍增時間為24h，有限壽命50代。

對很多病毒敏感，第一個被用于制備疫苗，目前廣泛應(yīng)用。第五十八頁，共一百二十一頁。58MRC-5

正常男性肺組織中獲得的人二倍體成纖維細(xì)胞系。核型為2n=46。

培養(yǎng)基需加小牛血清。有限壽命42～46代。增殖速度較W1-38快，對不良環(huán)境敏感性較W1-38低。對人的病毒敏感。

用于生產(chǎn)疫苗。第五十九頁，共一百二十一頁。59Namalwa

從患有淋巴瘤病的肯尼亞人獲取，建成人的類淋巴母細(xì)胞系。非整體核型，12～14條標(biāo)記染色體，單條X，無Y。

外源基因表達(dá)水平較高，培養(yǎng)基為RPMI1640+7%胎牛血清?？捎脽o血清培養(yǎng)基高密度培養(yǎng)。懸浮生長，表達(dá)IgM。英國Wellcome公司用Namalwa細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)α干擾素，反應(yīng)器達(dá)8000L。用該細(xì)胞生產(chǎn)rhEPO、rhG-CSF、tPA等。第六十頁，共一百二十一頁。60CHO-K1

從中國地鼠卵巢中分離的上皮樣細(xì)胞。核型2n=20～22。

貼壁生長，也可進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，對剪切力和滲透壓有較高的忍受能力。培養(yǎng)基為：DEME+0.1mmol/L次黃嘌呤+0.1mmol/L胸苷+10%小牛血清+脯氨酸。

分泌表達(dá)外源蛋白，蛋白質(zhì)翻譯后的修飾準(zhǔn)確，表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和生物活性接近天然。使用氨甲酰喋呤可增加外源基因的拷貝數(shù)，提高蛋白質(zhì)表達(dá)水平。是目前使用最為普遍和成熟的表達(dá)糖基化蛋白藥物的宿主細(xì)胞。第六十一頁，共一百二十一頁。61BHK-21

從1日齡地鼠幼鼠腎臟中分離的成纖維樣細(xì)胞，核型為2n=44。

培養(yǎng)基為DMEM+7%胎牛血清。

用于增殖病毒、制備疫苗和重組蛋白。現(xiàn)已用于工程細(xì)胞構(gòu)建。

第六十二頁，共一百二十一頁。62Vero

從正常成年非洲綠猴腎臟分離的上皮細(xì)胞，貼壁生長，核型2n=60。

能適應(yīng)灌流操作，進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)基：M199+5%胎牛血清。已有突變系能用無血清培養(yǎng)。

常用VeroE6增殖多種病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病毒、乙腦病毒等，生產(chǎn)病毒性疫苗，已被批準(zhǔn)用于人體。也可作為轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，用于表達(dá)外源基因的蛋白質(zhì)藥物和病毒的檢測。第六十三頁，共一百二十一頁。63SP2/0-Ag14

通過融合的方法分離獲得。

培養(yǎng)基為DMEM+10%胎牛血清。能耐受8氮鳥嘌呤20μg/mL，但在HAT選擇培養(yǎng)基中不能存活。

通常用于生產(chǎn)單克隆抗體。第六十四頁，共一百二十一頁。64C127：從小鼠乳腺瘤分離的上皮樣細(xì)胞。貼壁生長。表達(dá)多種外源基因，其中EPO的水平達(dá)10mg/L，生產(chǎn)rhGH已被批準(zhǔn)上市。3T3：HINSwiss小鼠胚胎培養(yǎng)中分離的細(xì)胞系。能大量表達(dá)外源蛋白，廣泛用于藥物毒理學(xué)研究。COS：從SV40DNA轉(zhuǎn)化的非洲綠猴腎細(xì)胞CV1中分離得到的，廣泛用于外源基因瞬時表達(dá)的研究。GH3：用于生長激素研究，293：用于基因治療的研究。第六十五頁，共一百二十一頁。65昆蟲細(xì)胞株系Sf-9

從秋粘蟲的卵巢細(xì)胞（SF21）中分離得到的，是最常用的昆蟲表達(dá)細(xì)胞。

通常用Grace培養(yǎng)基+3.3g/L水解乳蛋白+3.3g/L酵母浸液+10%胎牛血清。抗機械剪切，能在無血清培養(yǎng)基的攪拌反應(yīng)器中生長。

對苜宿尺蠖核型多角體病毒和其它桿狀病毒高度敏感。生長快，能高效表達(dá)外源基因。用于高效表達(dá)外來蛋白制品。第六十六頁，共一百二十一頁。66其他Sf21：從秋粘蟲卵巢細(xì)胞中分離得到，細(xì)胞較大，容易放大，高效表達(dá)外源基因。TN-5B1-4：從粉紋夜蛾卵細(xì)胞中分離得到的。無血清培養(yǎng)，快速倍增。分泌表達(dá)重組蛋白的能力比Sf9細(xì)胞系高20多倍，能適應(yīng)懸浮培養(yǎng)。第六十七頁，共一百二十一頁。67四、基因工程細(xì)胞構(gòu)建和篩選在生產(chǎn)中采用更多、更有前景的是融合細(xì)胞及各種基因工程細(xì)胞。被用于構(gòu)建工程細(xì)胞的動物細(xì)胞有：CHO-dhfr、BHK-21、Namalwa、Vero、SP2/0、Sf-9等細(xì)胞。第六十八頁，共一百二十一頁。681.真核細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建使用的載體有兩類：

病毒載體--牛痘病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒

質(zhì)粒載體--第六十九頁，共一百二十一頁。69

病毒作為載體的優(yōu)點：①雙鏈DNA，易重組；②插入7～8kbDNA不影響正常病毒粒子的形成③多角體蛋白和病毒粒子的形成無直接關(guān)系。因此，用外源基因更換多角體蛋白基因，仍能形成有感染力病毒粒子；第七十頁，共一百二十一頁。70④多角體蛋白基因有非常強的啟動子，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可占全部蛋白質(zhì)的20%～30%；⑤用光學(xué)顯微鏡可看到多角體，可以此作為標(biāo)記物，選陽性克隆。⑥如家蠶桿狀病毒，可在蠶體表達(dá)外源基因。第七十一頁，共一百二十一頁。71質(zhì)粒載體與微生物的質(zhì)粒載體類似，一般是穿梭質(zhì)粒，具有兩個復(fù)制子和抗性篩選標(biāo)記基因。大腸桿菌的復(fù)制子，細(xì)菌中繁殖?？股乜剐詷?biāo)記，原核細(xì)胞篩選。動物細(xì)胞復(fù)制子，在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。還有絲狀噬菌體復(fù)制子。

第七十二頁，共一百二十一頁。72

在細(xì)菌和哺乳動物細(xì)胞體內(nèi)都能擴增，含有如下基本成分：①允許載體在細(xì)菌體內(nèi)擴增的質(zhì)粒序列。②含有使基因表達(dá)的調(diào)控元件。③能用以篩選出外源基因已整合的選擇標(biāo)記。④有時還帶有選擇性增加拷貝數(shù)的擴增系統(tǒng)。第七十三頁，共一百二十一頁。73⒉基因的導(dǎo)入和高效表達(dá)細(xì)胞株篩選第七十四頁，共一百二十一頁。74基因載體導(dǎo)入動物細(xì)胞常用的方法

磷酸鈣沉淀法

電穿孔法

磷酸鈣沉淀法

溶解的DNA加Na2HPO4和CaCl2形成磷酸鈣沉淀，DNA被包在磷酸鈣沉淀中，形成DNA-磷酸鈣共沉淀物，當(dāng)和細(xì)胞表面接觸時，則通過細(xì)胞吞噬作用而將DNA導(dǎo)入。

電穿孔法

借助電穿孔儀的高壓脈沖電場，使細(xì)胞膜出現(xiàn)瞬時可逆性小孔，外源DNA沿小孔進(jìn)入細(xì)胞。轉(zhuǎn)化率較高，拷貝數(shù)低。第七十五頁，共一百二十一頁。75

化學(xué)轉(zhuǎn)染是最常用的轉(zhuǎn)染方法。

滲透性休克和DMSO等化學(xué)試劑能促進(jìn)DNA進(jìn)入細(xì)胞。轉(zhuǎn)染試劑盒已有商業(yè)化供應(yīng)，特別是脂質(zhì)體材料的轉(zhuǎn)染試劑。影響因素

細(xì)胞培養(yǎng)物的密度、DNA的大小、純度與用量、化學(xué)試劑的用量與處理時間、促進(jìn)劑的使用等。第七十六頁，共一百二十一頁。76轉(zhuǎn)染體篩選與分離

轉(zhuǎn)染后1～6天收獲細(xì)胞，進(jìn)行核酸分子雜交或蛋白質(zhì)雜交，檢測外源基因的瞬時表達(dá)。

為了獲得穩(wěn)定整合的細(xì)胞系，先在非選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)24～48小時，讓細(xì)胞倍增1～2代，使轉(zhuǎn)染DNA表達(dá)。再按1：15比例轉(zhuǎn)移到選擇性培養(yǎng)基上，每2～4天更換培養(yǎng)基，持續(xù)2～3周，促進(jìn)抗性細(xì)胞生長，清除死細(xì)胞殘骸，最后得到獨立的克隆。

在轉(zhuǎn)染中大約有萬分之一的細(xì)胞將穩(wěn)定整合外源基因，因此需要使用與之相對應(yīng)的顯性選擇標(biāo)記來分離轉(zhuǎn)染細(xì)胞。第七十七頁，共一百二十一頁。77五、細(xì)胞庫的建立

必須建立兩個細(xì)胞庫⒈原始細(xì)胞庫

⒉生產(chǎn)用細(xì)胞庫第七十八頁，共一百二十一頁。78原始細(xì)胞庫

存有該細(xì)胞的詳細(xì)擋案，包括：

①該細(xì)胞系的歷史②該細(xì)胞系的特性③對各種有害因子的檢查結(jié)果第七十九頁，共一百二十一頁。79生產(chǎn)用細(xì)胞庫

從原始細(xì)胞庫來的，或從單一安瓶來，或從多個安瓶來即刻混合，經(jīng)培養(yǎng)擴增再分裝儲存形成生產(chǎn)細(xì)胞庫。需建立檔案，進(jìn)行無菌、無細(xì)胞交叉污染的檢查。需確定最高使用的傳代次數(shù)。第八十頁，共一百二十一頁。80第三節(jié)植物次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)隨著植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展及各種新型生物反應(yīng)器的出現(xiàn)，植物細(xì)胞能像微生物細(xì)胞那樣在發(fā)酵罐中大量連續(xù)培養(yǎng)，產(chǎn)生相當(dāng)于幾倍或幾十倍該完整植株所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物。植物細(xì)胞培養(yǎng)的產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品、化工、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。如：人參愈傷組織在培養(yǎng)基中培養(yǎng)數(shù)周，所含粗皂苷的含量可達(dá)19.3%，而天然人參根中含量僅為4.1%。第八十一頁，共一百二十一頁。81一、次生代謝產(chǎn)物二、培養(yǎng)條件下次生產(chǎn)物積累的特性三、提高細(xì)胞次生產(chǎn)物產(chǎn)量的途徑四、培養(yǎng)技術(shù)的選擇五、植物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用第八十二頁，共一百二十一頁。82一、次生代謝產(chǎn)物

次生代謝產(chǎn)物是代謝的最終產(chǎn)物，并非一般生命活動所必需的產(chǎn)物。多是一類小分子有機化合物，如黃酮、色素、毒素、抗生素、生長素、生物堿等。

次生代謝產(chǎn)物分布具有種、屬、器官、組織以及發(fā)育階段的特異性，也就是說不同植物類型或同一植物不同生長階段及組織部位產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物及產(chǎn)量是不同的。第八十三頁，共一百二十一頁。83

主要分為三類

萜類、

酚類、

含氮次級化合物。第八十四頁，共一百二十一頁。84酚類--黃酮類、醌類和簡單酚類黃酮類結(jié)構(gòu)：C6-C3-C6生物合成前體：苯丙氨酸和丙二酸單酰輔酶A功效：治療心血管和高血壓的藥物成分。醌類化合物結(jié)構(gòu)：由苯式多環(huán)芳烴衍生的芳香二氧化合種類：苯醌、萘醌。功效：呈現(xiàn)顏色，具有抗菌、抗癌作用。第八十五頁，共一百二十一頁。85簡單酚類結(jié)構(gòu)：苯丙酸類、苯丙酸內(nèi)酯和苯甲酸衍生物分布：廣泛分布于維管植物。功能：許多是植物防御食草昆蟲和真菌侵襲的保護(hù)劑。常用的藥物有：綠原酸、姜酚、肉桂醛等。第八十六頁，共一百二十一頁。86萜類化合物單萜和倍半萜是植物揮發(fā)油和香料的主要成分，有的具有重要的藥用價值。萜類化合物已超過2萬種。倍

半

萜：抗瘧疾藥物青蒿素。二萜生物堿：抗癌藥物紫杉醇。三萜

皂甙：人參皂甙。甾體

皂甙：薯蕷皂甙。第八十七頁，共一百二十一頁。87含氮化合物包括：生物堿、胺類、非蛋白質(zhì)氨基酸和生氰苷合成：從普通的氨基酸合成的。分布：雙子葉植物種類：主要有生物堿、含氰苷、芥子油苷和非蛋白、氨基酸等，有5500種以上。第八十八頁，共一百二十一頁。88二、次生產(chǎn)物積累的特性生長偶聯(lián)型----產(chǎn)物合成與細(xì)胞生長成正比。如長春花堿的合成、煙草中煙堿合成。中間型----產(chǎn)物僅在細(xì)胞生長下降時合成，細(xì)胞在指數(shù)生長期或停止期產(chǎn)物都不合成。如蒽醌類物質(zhì)、莨菪烷類的合成等。非生長偶聯(lián)型----產(chǎn)物合成在細(xì)胞生長停止以后。如紫草寧。第八十九頁，共一百二十一頁。89三、提高細(xì)胞次生產(chǎn)物產(chǎn)量的途徑選擇適宜的起始材料－－種類、部位梔子

胚軸銀杏

子葉當(dāng)歸

根紅豆杉

幼嫩的莖茜草

葉柄培養(yǎng)基既要滿足植物細(xì)胞的生物量增長，還要滿足細(xì)胞合成及積累次生產(chǎn)物的需要。第九十頁，共一百二十一頁。90前體（precursor）的應(yīng)用

主要是提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。對某一目的產(chǎn)物來講，可能有多種前體物質(zhì)。同一種前體物質(zhì)又可能有多條代謝路徑，從而形成不同的代謝產(chǎn)物。針對其合成的關(guān)鍵生化過程進(jìn)行前體物質(zhì)添加。

多數(shù)前體物質(zhì)對細(xì)胞生長并不十分有利，可能有前體濃度過量產(chǎn)生的反饋抑制。第九十一頁，共一百二十一頁。91激發(fā)子（elicitor）的應(yīng)用

是指能夠誘導(dǎo)植物細(xì)胞中某些反應(yīng)，并形成細(xì)胞特征性自身反應(yīng)的分子，也稱誘導(dǎo)子。非生物激發(fā)子----如輻射、金屬離子、茉莉酸類似物（茉莉酸甲酯，M-JA）等。生物激發(fā)子外源激發(fā)子：菌絲、微生物機體提取物及微生物產(chǎn)生的多糖、蛋白和脂肪酸等。

內(nèi)源性激發(fā)子：來源于植物結(jié)構(gòu)化合物。如降解細(xì)胞壁的酶、細(xì)胞壁碎片、寡聚糖等有機分子。第九十二頁，共一百二十一頁。92激發(fā)子促進(jìn)次生產(chǎn)物積累激發(fā)子對南方紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)合成紫杉醇的影響激發(fā)子適宜濃度（mM）與對照比提高產(chǎn)物效率（倍）M-JA0.17.0花生四烯酸0.16.5硝酸柿胺1.05.5水楊酸0.14.5硝酸鹽0.013.0第九十三頁，共一百二十一頁。93四、培養(yǎng)技術(shù)的選擇包括反應(yīng)器的選擇和培養(yǎng)方式的選擇。

培養(yǎng)技術(shù)的選擇不僅要考慮細(xì)胞生長和產(chǎn)物積累的效率，同時還應(yīng)考慮技術(shù)基礎(chǔ)和生產(chǎn)成本。如兩相培養(yǎng)技術(shù)。培養(yǎng)方式可采用兩步培養(yǎng)，即在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，在生產(chǎn)培養(yǎng)基中積累產(chǎn)物。第九十四頁，共一百二十一頁。94兩相培養(yǎng)技術(shù)

指在植物細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入水溶性或脂溶性的有機化合物，或者是具有吸附作用的多聚化合物，使培養(yǎng)體系由于分配系數(shù)不同而形成上、下兩相，細(xì)胞在其中一相中生長并合成次生代謝物，而這些次生代謝物又通過主動或被動運輸?shù)姆绞结尫诺桨猓涣硪幌嗨?。第九十五頁，共一百二十一頁?5特點可及時分離次生代謝物，減少負(fù)反饋抑制，提高次生代謝產(chǎn)物含量，而且有機相可循環(huán)使用，基本實現(xiàn)了植物組織的連續(xù)培養(yǎng)。迄今為止，已有18種植物細(xì)胞應(yīng)用此項技術(shù)獲得成功。例如添加十六烷提取紫草素，可使產(chǎn)量提高7倍多；添加十六烷可使孔雀草發(fā)根培養(yǎng)的噻吩分泌量由原來的1％提高至70％。第九十六頁，共一百二十一頁。96舉例兩相培養(yǎng)紅豆杉細(xì)胞生產(chǎn)紫杉醇

紫杉醇為抗癌藥，價99%純度的1500元/g，35%的138元/g。第一相：B5培養(yǎng)基第二相：5％(v/v)的松油醇產(chǎn)物釋放劑：5％(v/v)二甲基亞砜。10g(鮮重)/100mL培養(yǎng)基/250mL三角燒瓶。25℃，120rpm，黑暗培養(yǎng)。第九十七頁，共一百二十一頁。97毛狀根培養(yǎng)技術(shù)發(fā)根土壤桿菌的Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)移并整合到雙子葉植物基因組中誘導(dǎo)出毛狀根。其生長迅速，分支多，且具有器官化的特征，遺傳性、生理生化特征穩(wěn)定，具有更強的次生代謝物合成能力，可建立培養(yǎng)系統(tǒng)。毛狀根具有很強的繁殖能力，可以制成人工種子長期保存。第九十八頁，共一百二十一頁。98毛狀根具有生物轉(zhuǎn)化功能，可以產(chǎn)生許多新的化合物；能產(chǎn)生某些植物的愈傷組織不能合成的新的有效成分；由于毛狀根培養(yǎng)技術(shù)的高產(chǎn)，并且可從基因水平上對某些酶和特定次生代謝過程進(jìn)行調(diào)控，因此，被公認(rèn)是生產(chǎn)植物次生代謝物的一條新途徑。目前誘導(dǎo)植物產(chǎn)生毛狀根的種類已達(dá)幾十種以上，且次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)水平達(dá)到相當(dāng)于或高于原植株的水平。第九十九頁，共一百二十一頁。99舉例誘導(dǎo)人參愈傷組織生產(chǎn)人參皂苷在無外源激素的條件下，毛狀根生長速度為激素誘導(dǎo)根的2倍，人參皂苷的含量達(dá)干重的0.95％，高于再生根(0.91％)和天然栽培根(0.4％)。人參愈傷組織第一百頁，共一百二十一頁。100第一百零一頁，共一百二十一頁。101青蒿毛狀根生產(chǎn)青蒿素青蒿為雙子葉植物藥菊科植物。青蒿素為治療瘧疾的首選藥。結(jié)構(gòu)為倍半萜內(nèi)酯類化合物第一百零二頁，共一百二十一頁。102

由發(fā)根農(nóng)桿菌R1601誘導(dǎo)青蒿葉片產(chǎn)生青蒿毛狀根。培養(yǎng)方法及條件固體培養(yǎng)：20～30mm青蒿毛狀根根尖，在MS固體培養(yǎng)基上，添加30L蔗糖，繼代時間為15d。液體培養(yǎng)：每升MS培養(yǎng)液接種5g毛狀根培養(yǎng)物，120-130rpm，25±1℃，12h／d光照，液體培養(yǎng)的繼代時間為10d。反應(yīng)器培養(yǎng)：

MS

培養(yǎng)液400mL，接種量為0.8g，12h／d光照培養(yǎng)，25±I℃。通氣量為0.5L／min，通氣時間為15mln。第一百零三頁，共一百二十一頁。103

最大生物量10.3g/L，青蒿素產(chǎn)量達(dá)到179.1mg/L，青蒿素的含量為1.74％。第一百零四頁，共一百二十一頁。104提高次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)率的方法----小結(jié)1.選育高效合成次生代謝產(chǎn)物能力的細(xì)胞。2.選擇合適的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，尋找最佳工藝條件實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。3.提高次生代謝前體物質(zhì)濃度，尋找增加次生前體物質(zhì)的途徑和調(diào)節(jié)方式，提高產(chǎn)量。4.降低次生代謝產(chǎn)物的濃度：固定化細(xì)胞培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)、兩相培養(yǎng)技術(shù)等。5.設(shè)計合適的生物反應(yīng)器：氣升式反應(yīng)器被認(rèn)為是最適反應(yīng)器。第一百零五頁，共一百二十一頁。105五、植物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用1.初級及次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。有400種左右。已實現(xiàn)工業(yè)化培養(yǎng)的有：煙草、人參、紫草、黃連等。2.天然植物色素的生產(chǎn)。有葉黃素、胡蘿卜素、花青素、單寧等。3.生物轉(zhuǎn)化。利用植物細(xì)胞氧化、還原、皂化、羥基化等多種酶源，使某種前體化合物生成為相應(yīng)有用的產(chǎn)物。如：毛地黃細(xì)胞將β-甲基毛地黃毒素羥基化為β-甲基地高辛，為臨床多用強心藥。第一百零六頁，共一百二十一頁。106舉例紫草細(xì)胞生物反應(yīng)器生產(chǎn)紫草色素紫草寧（紫草紅色素）外用治療皮膚癌、濕疹、帶狀皰疹等；內(nèi)服治療病毒性肝炎、肺癌、肝癌等。1.細(xì)胞來源

紫草細(xì)胞來自于紫草葉誘導(dǎo)的愈傷組織，經(jīng)多次培養(yǎng)篩選獲得。在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的紫草細(xì)胞直接接種于液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，作為反應(yīng)器培養(yǎng)的種子。第一百零七頁，共一百二十一頁。1072.培養(yǎng)過程

24℃左右搖瓶培養(yǎng)紫草細(xì)胞作為種子，接種于裝有7L細(xì)胞生長的B5液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)14天。利用過濾網(wǎng)放出培養(yǎng)液，并用適量無菌水沖洗殘留在反應(yīng)器內(nèi)的培養(yǎng)液。然后加入7L紫草色素積累的培養(yǎng)液(M9)

，培養(yǎng)20天，溫度控制在23-25℃。培養(yǎng)過程中監(jiān)測培養(yǎng)液酸堿度變化和電導(dǎo)率，以及紫草細(xì)胞濃度和色素含量變化。3.代謝產(chǎn)物

紫草色素形成與細(xì)胞生長基本同步。第一百零八頁，共一百二十一頁。108

自然植物和細(xì)胞培養(yǎng)的紫草寧含量比較生產(chǎn)方式生產(chǎn)周期紫草寧含量（％干重）完整植物2～3年1～2植物細(xì)胞培養(yǎng)3周14第一百零九頁，共一百二十一頁。109

植物次生代謝產(chǎn)品的市場潛能產(chǎn)品成分用途年銷售額（億美元）長春花堿治療白血病18～20（美國）奎寧治療瘧疾5～10（美國）致熱素殺蟲劑20（全世界）毛地黃心臟病藥20～55（美國）

第一百一十頁，共一百二十一頁。110本章小結(jié)細(xì)胞規(guī)模化培養(yǎng)有可能成為新型生化工業(yè)的重要途徑，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是細(xì)胞規(guī)模化培養(yǎng)的基礎(chǔ)。各種單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是細(xì)胞克隆的基礎(chǔ)，也適用于植物花粉培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)。高等生物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)體系的建立必須于生物反應(yīng)器的研制相匹配。根據(jù)目的產(chǎn)物建立包括培養(yǎng)基、種細(xì)胞、培養(yǎng)方式等在內(nèi)的一系列配套技術(shù)是商業(yè)化的前提。第一百一十一頁，共一百二十一頁。111Goodbye!Goodbye!第一百一十二頁，共一百二十一頁。112紫杉醇：二萜類化合物最早由太平洋紅豆杉Taxusbrevifolia的樹皮中分離廣泛用于治療卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌等十幾種癌癥。NCI稱其為過去15年中開發(fā)的最好的抗癌藥物，20世紀(jì)90年代抗腫瘤藥的三大成就之一，湯姆森科技桂冠獎。目前主要來源于紅豆杉屬植物。紫杉醇簡介第一百一十三頁，共一百二十一頁。113紫杉醇研發(fā)過程年代進(jìn)展1958

NCI開始大規(guī)模植物藥研發(fā)篩選1967發(fā)現(xiàn)紫杉醇抗癌活性1968從紅豆杉中分離出紫杉醇1971完成結(jié)構(gòu)鑒定1979發(fā)表作用機制1983臨床Ⅰ試驗1985臨床II期1991臨床III期19