動物細胞制藥動物細胞制藥第1頁

細胞是生物體基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)單位和功效單位，單細胞生物，一個細胞就是一個個體，而多細胞生物則由許多細胞組成一個個體。咱們所看到生物體都是由多細胞所組成。在多細胞生物體中，由形態(tài)結(jié)構(gòu)相同細胞再組成組織，執(zhí)行著生物體中個別功效。

動物細胞制藥第2頁細胞工程（cellengineering）應用細胞生物學和分子生物學方法，借助工程學試驗方法或技術(shù)，在細胞水平上研究改造生物遺傳特征和生物學特征，以取得特定細胞、細胞產(chǎn)品或新生物體相關(guān)理論和技術(shù)方法學科。廣義細胞工程包含全部生物組織、器官及細胞離體操作和培養(yǎng)技術(shù)，狹義細胞工程則是指細胞融合和細胞培養(yǎng)技術(shù)。依據(jù)研究對象不一樣，細胞工程可分為動物細胞工程和植物細胞工程。動物細胞制藥第3頁動物細胞工程單克隆抗體細胞融合細胞培養(yǎng)胚胎移植核移植動物細胞制藥第4頁

動物細胞培養(yǎng)胚胎或幼齡動物組織器官（細胞起源）剪碎、胰蛋白酶分離細胞單個細胞洗滌、稀釋、分離原代培養(yǎng)原代細胞細胞株傳代培養(yǎng)遺傳物質(zhì)沒有發(fā)生改變細胞系遺傳物質(zhì)發(fā)生改變動物細胞制藥第5頁應用1、生產(chǎn)有價值蛋白質(zhì)制品，（如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體、動物激素）2、檢測有毒物質(zhì)3、用于一些器官移植動物細胞制藥第6頁細胞分化

多細胞生物體是由各種各樣形態(tài)和功效都不一樣細胞群所組成。高等動、植物由受精卵細胞開始胚胎發(fā)生過程伴隨細胞分裂次數(shù)增加而使得早期胚胎細胞數(shù)量也增加許多。其中有些細胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功效上逐步發(fā)生了差異，這種細胞之間差異發(fā)生過程就是細胞分化。個體發(fā)育過程就是細胞分化過程，個體各種器官和組織都是經(jīng)過細胞分化形成。

動物細胞制藥第7頁離體細胞形態(tài)貼壁細胞：來自動物實體組織大多數(shù)細胞需要貼壁單層生長。普通成纖維樣或上皮樣細胞型。懸浮細胞：細胞無需貼附到固體介質(zhì)上就能生存和生長細胞。來自血液、淋巴系統(tǒng)細胞和大多數(shù)腫瘤細胞常為非貼壁依賴性，它們形態(tài)呈圓形。兼性貼壁細胞：不嚴格依賴支持物。動物細胞制藥第8頁

動物細胞化學組成

水分85%，無機鹽1-1.5%，蛋白質(zhì)7-10%，脂質(zhì)1-2%，其它有機物1.5%。動物細胞代謝糖、脂肪、蛋白質(zhì)降解代謝分三階段：第一階段是大分子降解為小分子；第二階段是小分子代謝產(chǎn)生乙酰輔酶A、α-酮戊二酸和草酰乙酸；第三階段是三羧酸循環(huán)。

動物細胞體外培養(yǎng)主要能源來自葡萄糖和谷氨酰胺，怎樣提升DO2？在高密度培養(yǎng)時加個別果糖。動物細胞制藥第9頁動物細胞生理特點1、動物細胞分裂周期長(12-48hr)各類細胞分裂周期時間表動物細胞制藥第10頁2、細胞生長需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象3、正常二倍體細胞壽命有限4、動物細胞對周圍環(huán)境敏感5、動物細胞對培養(yǎng)基要求高6、動物細胞蛋白質(zhì)合成路徑和修飾功效與細菌不一樣動物細胞制藥第11頁動物細胞和微生物細胞總體差異內(nèi)容微生物細胞動物細胞細胞壁普遍存在不存在生長速率0.1~0.5h-10.01~0.05h-1需氧量高低營養(yǎng)要求普遍簡單復雜CO2需求一些微生物需CO2許多需要CO2形成緩沖液環(huán)境影響小大大小范圍100~nm10000~100000nm接種濃度低高（105.ml-1）生長濃度高（109~1010.ml-1）低（106.ml-1）動物細胞制藥第12頁動物細胞培養(yǎng)特征動物細胞培養(yǎng)是指在適當培養(yǎng)條件下，動物細胞離體生長和增殖，并保持其特征和功效技術(shù)，這些細胞不再形成組織。動物細胞制藥第13頁細胞生長遲緩，易污染，培養(yǎng)需用抗生素細胞大，無細胞壁，機械強度低，環(huán)境適應性差需氧少，不耐受強力通風與攪拌群體生長期有效應，貼壁生長（錨地依賴性）培養(yǎng)過程產(chǎn)品分布細胞內(nèi)外，成本高原代培養(yǎng)細胞普通繁殖50代即退化死亡

動物細胞制藥第14頁

細胞生長類型

貼壁依賴性

來自動物實體組織大多數(shù)細胞需要貼壁單層生長。只要它們沒有轉(zhuǎn)化為非貼壁依賴性必須貼伏在適當固體介質(zhì)上并鋪展，才能生長。

非貼壁依賴性

細胞無需貼附到固體介質(zhì)上就能生存和生長細胞。來自血液、淋巴系統(tǒng)細胞和大多數(shù)腫瘤細胞常為非貼壁依賴性，它們形態(tài)呈圓形。動物細胞制藥第15頁生長特征貼壁依賴型細胞在培養(yǎng)時要貼附于培養(yǎng)（瓶）器皿壁上，細胞一經(jīng)貼壁就快速鋪展，然后開始有絲分裂，并很快進入對數(shù)生長久。普通數(shù)天后就鋪滿培養(yǎng)表面，并形成致密細胞單層。

動物細胞制藥第16頁

貼壁培養(yǎng)優(yōu)點

●輕易更換培養(yǎng)液；細胞緊密黏附于固相表面，可直接傾去舊培養(yǎng)液，清洗后直接加入新培養(yǎng)液。

●輕易采取灌注培養(yǎng)，從而到達提升細胞密度目標；因細胞固定表面，不需過濾系統(tǒng)。

●當細胞貼壁于生長基質(zhì)時，很多細胞將更有效表示一個產(chǎn)品。

●同一設(shè)備可采取不一樣培養(yǎng)液/細胞百分比。

●適合用于全部類型細胞。

動物細胞制藥第17頁

貼壁培養(yǎng)缺點與懸浮培養(yǎng)法相比

●擴充培養(yǎng)比較困難，投資大；

●占地面積大；

●不能有效監(jiān)測細胞生長。

動物細胞制藥第18頁

細胞培養(yǎng)物取得原代培養(yǎng)物在無菌條件下，用鑷子和剪刀將切下組織剪碎成小塊，再用胰蛋白酶等蛋白水解酶處理，使組織解離成單個細胞，放入培養(yǎng)容器中無菌培養(yǎng)。這種原代培養(yǎng)物中含有各種不一樣分化細胞類型，它們生長速率不一樣，成纖維細胞最易生長，常會在今后傳代培養(yǎng)中占據(jù)優(yōu)勢。仔細控制培養(yǎng)基成份，能夠選擇性地支持一些細胞類型生長。動物細胞制藥第19頁動物細胞制藥第20頁

兩個專業(yè)術(shù)語

細胞系：首次分離組織培養(yǎng)稱之為原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)物經(jīng)傳代成功后即成細胞系。

細胞株：經(jīng)過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細胞系中取得含有特殊性質(zhì)或標識培養(yǎng)物稱為細胞株。動物細胞制藥第21頁轉(zhuǎn)化細胞正常細胞經(jīng)過某個轉(zhuǎn)化過程，喪失了對生長控制敏感性。轉(zhuǎn)化伴伴隨染色體模式改變，二倍體變成異倍體。更經(jīng)典表現(xiàn)是，貼壁依賴性細胞對貼壁依賴及細胞密度抑制發(fā)生改變，即使可能細胞仍需貼壁生長，但可能生長到不止單層。細胞轉(zhuǎn)化有四種主要路徑：①有些細胞在培養(yǎng)中自發(fā)轉(zhuǎn)化。②化學轉(zhuǎn)化，一些化學致癌物會增加轉(zhuǎn)化頻率。③病毒轉(zhuǎn)化。④致瘤因子轉(zhuǎn)化。動物細胞制藥第22頁

轉(zhuǎn)化細胞因為有沒有限壽命，在培養(yǎng)中更易生長，被廣泛用于生產(chǎn)生物制品，如重組蛋白藥品、病毒疫苗等。不過，大家對它們安全性依然非常關(guān)心，對可能造成生物危害性進行嚴格檢測和控制。動物細胞制藥第23頁

腫瘤細胞腫瘤細胞是來自于腫瘤組織細胞或經(jīng)腫瘤細胞與其它細胞融合產(chǎn)生細胞，如雜交瘤細胞。與轉(zhuǎn)化細胞相比，它們是惡性，基礎(chǔ)上是非貼壁依賴性。腫瘤細胞有很好增殖特征，生長速率高。對生長因子依賴程度低，對培養(yǎng)環(huán)境要求也不那么苛刻。動物細胞制藥第24頁體外培養(yǎng)所需普通條件適宜培養(yǎng)皿、血清成份、370C、CO25％、95～100％濕度、抗生素。

腫瘤細胞致癌性是造成其難以用于體內(nèi)治療產(chǎn)品生產(chǎn)主要原因。因為多年來分離純化技術(shù)進步和對這些細胞致瘤性深刻認識，對其在生產(chǎn)中應用有所松動，如雜交瘤細胞生產(chǎn)單克隆抗體已用于體內(nèi)治療，C127細胞生成重組蛋白研究也形成了規(guī)模。動物細胞制藥第25頁培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件培養(yǎng)基配制時考慮原因pH

多數(shù)細胞系在pH7.4下生長得很好。一些正常成纖維細胞系以7.4~7.7最好，轉(zhuǎn)化細胞系以pH7.0~7.4更適當。緩沖在高細胞密度下，轉(zhuǎn)化細胞系產(chǎn)生大量二氧化碳和乳酸，引發(fā)pH下降，需要在培養(yǎng)基中加入緩沖作用試劑，如碳酸氫鈉、HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸)。動物細胞制藥第26頁溫度低溫下CO2溶解度增加，引發(fā)pH改變。黏度培養(yǎng)基黏度主要受血清含量影響。在攪拌條件下黏度大則細胞受損傷小。加入羧甲基纖維素或聚乙烯基吡咯烷增加培養(yǎng)基黏度動物細胞制藥第27頁細胞培養(yǎng)基基礎(chǔ)組成（1）水細胞培養(yǎng)用各種液體都要用水來配置，對水純度要求很高。通常細胞培養(yǎng)用水污染物標準可參考醫(yī)藥上注射用水標準，但標準上應高于注射用水標準。動物細胞制藥第28頁（2）能源和碳源主要是糖和糖酵解產(chǎn)物和谷氨酰胺。細胞能用糖主要是六碳糖，尤其是葡萄糖。葡萄糖很輕易被大多數(shù)細胞轉(zhuǎn)化為乳酸。昆蟲細胞更偏愛蔗糖。在多數(shù)培養(yǎng)基中谷氨酰胺作為主要能源和碳源。使用谷氨酰胺最大問題是它自發(fā)降解，降解量與時間、溫度、血清和磷酸濃度相關(guān)，降解產(chǎn)物為氨，對細胞有毒性。動物細胞制藥第29頁（3）氮源氨基酸是組成蛋白質(zhì)基礎(chǔ)單位，也是細胞合成復雜含氮化合物前體，還作為必不可少能源物質(zhì)。不一樣種類細胞對氨基酸種類和濃度有不一樣要求，但除了谷氨酰胺外，還有12種氨基酸不能在細胞內(nèi)合成，必須依靠從培養(yǎng)基中攝取。幾乎全部培養(yǎng)基中都含有全部必須氨基酸，依據(jù)需要補充適量非必需氨基酸。非必須氨基酸含量低時常會增加必須氨基酸消耗量。增加氨基酸濃度能夠提升培養(yǎng)細胞密度和產(chǎn)物產(chǎn)率。動物細胞制藥第30頁（4）維生素維生素是維持細胞正常生理狀態(tài)一個主要生物活性化合物，在細胞中多形成酶輔基或輔酶，對細胞代謝過程有主要影響。（5）無機離子無機離子分為兩組，一個是含量較高，包含維持膜電勢（Na+，K+），維持滲透壓平衡（Na+，Cl－），作為酶輔因子（Mg2+），促進細胞貼附（Mg2+Ca2+），起緩沖作用（HPO42-，HCO3-）；另一個勢微量元素，如鐵、錳、鋅、鉬、硒、釩、銅。動物細胞制藥第31頁（6）脂類和磷脂前體在使用血清細胞培養(yǎng)中，脂類來自血清，在無血清培養(yǎng)中，有些細胞需要添加脂類，如膽固醇、脂肪酸、磷脂。尤其是缺點型細胞，對某種脂類有很高依賴性。動物細胞制藥第32頁非營養(yǎng)性物質(zhì)（1）抗生素細胞培養(yǎng)中，尤其是原代細胞培養(yǎng)中，常使用抗生素抑制微生物污染。（2）pH緩沖劑最常見緩沖劑是碳酸氫鈉，常見濃度26mmol/L，靠近血中濃度，必須與5％～10％CO2平衡，不然培養(yǎng)基快速變堿。HEPES是緩沖能力很強化合物，但因為它相當昂貴，細胞大規(guī)模培養(yǎng)中極少使用。動物細胞制藥第33頁（3）酚紅酚紅普遍作為培養(yǎng)基pH指示劑（4）保護劑細胞保護劑指保護細胞免受由滲透壓改變、剪切、毒性金屬和氧化劑所引發(fā)損傷物質(zhì)。在生物反應器中培養(yǎng)細胞會受到機械攪拌和氣泡運動所產(chǎn)生剪切損傷，一些大分子化合物，如甲基纖維素、葡聚糖、PEG、聚乙烯吡咯烷酮、PluronicF68、血清白蛋白，能夠減輕這種損傷。動物細胞制藥第34頁（5）還原劑一些還原劑在細胞培養(yǎng)中有特殊作用。β－巰基乙醇在雜交瘤細胞培養(yǎng)中能刺激抗體分泌，并促進半胱氨酸利用。動物細胞制藥第35頁（6）血清常見血清是小牛血清、胎牛血清、馬血清和人血清。最常見是小牛血清。血清是極其復雜混合物，含有食物物質(zhì)、代謝物、激素、血漿蛋白、破碎細胞釋放物質(zhì)、采血中引入污染物。因為歷史原因，商業(yè)培養(yǎng)基大都是按添加血清來設(shè)計，使用血清技術(shù)也很成熟，盡管使用血清有許多缺點，仍將其作為細胞培養(yǎng)最主要添加劑普遍采取。動物細胞制藥第36頁培養(yǎng)物污染及預防1、污染路徑

（1）空氣：空氣流動性大，假如培養(yǎng)操作場地于外界隔離不嚴格或消毒不充分，外界不潔空氣很輕易進入造成污染。所以，培養(yǎng)設(shè)施不能設(shè)在通風場所。無菌操作應在凈化臺內(nèi)進行，工作時要帶口罩

動物細胞制藥第37頁2、器材：各種培養(yǎng)器皿

3、操作：試驗操作無菌觀念不強，技術(shù)不熟練，使用污染器皿或封瓶不嚴等，都能夠造成污染。

4、血清：有些血清在生產(chǎn)時就已經(jīng)被支原體或病毒等污染，變成了污染。

5、組織樣本：原代培養(yǎng)污染多數(shù)起源于組織樣本；取材時碘酒消毒后脫碘不徹底，可造成碘混入組織，細胞或培養(yǎng)液中，影響細胞細胞生長。

動物細胞制藥第38頁動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)（一）培養(yǎng)環(huán)境1、溫度溫度是細胞在體外生存基礎(chǔ)條件之一，起源不一樣動物細胞，其最適生長溫度不一樣。比如昆蟲細胞最適溫度是25～280C，人和哺乳動物細胞最適溫度是370C，細胞代謝強度與溫度成正比，超出最適溫度范圍，細胞正常代謝和生長將會受到影響，甚至造成死亡。動物細胞制藥第39頁2、pH

大規(guī)模培養(yǎng)時影響培養(yǎng)液pH穩(wěn)定性主要原因有三種：（1）緩沖液緩沖能力及種類；（2）對流空間大??；（3）葡萄糖濃度。培養(yǎng)液中正常緩沖系統(tǒng)是NaHCO3/CO2系統(tǒng)，它是一個弱緩沖系統(tǒng)，其pK為6.1，低于生理學最正確要求。這種緩沖系統(tǒng)要求在培養(yǎng)液上面對流空間加入CO2以預防它丟失及增加羥基離子。動物細胞制藥第40頁

也可使用磷酸緩沖液，但磷酸對動物細胞有毒害作用。HEPES生物緩沖劑也曾被加入NaHCO3/CO2緩沖系統(tǒng)中，這是因為HEPESpK為7.0，HEPES被加入后，其緩沖能力為pH6.8～7.2。不過當HEPES濃度高于25mM時，它對大多數(shù)動物細胞都有毒害作用。

動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)時常有幾個方法來調(diào)整培養(yǎng)液中pH：（1）在培養(yǎng)基中添加NaHCO3作為緩沖劑及通入含CO2空氣進行調(diào)整動物細胞制藥第41頁（2）用0.1mol/LNaON或0.1mol/LHCl進行調(diào)整。因為動物細胞培養(yǎng)時要求低攪拌和弱混合，利用NaOH或HCl進行調(diào)整時會發(fā)生局部過酸或過堿現(xiàn)象，從而對細胞產(chǎn)生毒性作用，所以這種調(diào)整方法在動物細胞培養(yǎng)時不太適當。通常經(jīng)過調(diào)整培養(yǎng)基中NaHCO3用量及通氣中CO2濃度來控制發(fā)酵過程pH。動物細胞制藥第42頁3、溶解氧

大規(guī)模培養(yǎng)中怎樣提供足夠氧是非常主要。通氣目標有兩個：一是提供細胞代謝所需足夠氧；二是使發(fā)酵液處于均勻懸浮狀態(tài)，有利于傳質(zhì)過程。動物細胞制藥第43頁（二）培養(yǎng)容器1、多孔板、Petri培養(yǎng)皿和組織培養(yǎng)方瓶都是常見靜止培養(yǎng)容器，體積小，操作方便，很輕易放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2、滾瓶也是一個主要培養(yǎng)容器，培養(yǎng)時放在滾瓶機上遲緩滾動，但培養(yǎng)條件很靠近于靜止培養(yǎng)。它體積較大，接種后放入溫室或?qū)ｉT培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)依賴性貼壁培養(yǎng)細胞時，需加入微載體以增加培養(yǎng)表面積。3、生物反應器是大規(guī)模培養(yǎng)中最主要培養(yǎng)設(shè)備。它有各種不一樣形式，容積能夠從1升到幾十立方米。動物細胞制藥第44頁微載體微載體是指直徑在60～250μm、適合于動物細胞貼附和生長微珠。微載體法培養(yǎng)動物細胞有很多好處：①可在反應器中提供大比表面積②可采取均勻懸浮培養(yǎng)，簡化了各種環(huán)境原因檢測和控制，提升了培養(yǎng)系統(tǒng)重演性③可用普通顯微鏡觀察細胞在微載體上生長情況④輕易放大⑤適合于各種貼壁依賴性細胞培養(yǎng)⑥輕易收獲細胞。微載體培養(yǎng)系統(tǒng)缺點是：①細胞生長在微載體表面，易受到剪切損傷，不適合貼壁不牢細胞生長②微載體價格較貴，普通不能重復使用③需要較高細胞接種量。動物細胞制藥第45頁懸浮培養(yǎng)

懸浮培養(yǎng)指細胞在培養(yǎng)容器中自由懸浮生長過程，主要用于非貼壁依賴性細胞培養(yǎng)，如雜交瘤細胞等。動物細胞懸浮培養(yǎng)與微生物過程比較靠近，但因為動物細胞對攪拌和通氣造成流體剪切很敏感，在反應器設(shè)計和操作上又有特殊要求，如利用螺旋帶葉輪減小生物反應器培養(yǎng)過程中剪切作用，并經(jīng)過表面充氣及誘導表面氣泡產(chǎn)生含有雙層濾網(wǎng)新型攪拌器，它提升了氧傳遞速率。動物細胞制藥第46頁

當前，動物細胞培養(yǎng)用生物反應器主要包含：轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)器、塑料袋增殖器、填充床反應器、多層板反應器、螺旋膜反應器、管式螺旋反應器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應器、流化床反應器、中空纖維及其它膜式反應器、攪拌反應器、氣升式反應器等。動物細胞制藥第47頁4、細胞大規(guī)模培養(yǎng)生物反應器氣升式生物反應器氣升式生物反應器與其它反應器相比，結(jié)構(gòu)簡單，無轉(zhuǎn)動部件，細胞損傷率低，降低了污染機會；產(chǎn)生湍流溫和而均勻，剪切力相當?。恢苯油夤┭?，氧傳遞速率高，供氧充分；液體循環(huán)量大，細胞和營養(yǎng)成份混合均勻。存在問題：因為液體混合能量唯一來自通入氣體，因而通氣量大，泡沫多，而且氣泡破碎造成嚴重細胞機械損傷。動物細胞制藥第48頁通氣攪拌生物反應器

依據(jù)動物細胞培養(yǎng)特點，要求攪拌器轉(zhuǎn)動時混合性能好，產(chǎn)生剪切力小，氣泡產(chǎn)生不利影響小。設(shè)計有各種形式攪拌器，應用最多是籠式攪拌器。

籠式攪拌器有兩個由200目不銹鋼絲網(wǎng)圍成籠式腔。下部是通氣腔，上部是消泡腔，之間有細管相通。氣體交換在通氣腔內(nèi)進行，其中液體經(jīng)過絲網(wǎng)與腔外液體進行交換。在氣體鼓泡中形成泡沫經(jīng)細管進入消泡腔，經(jīng)絲網(wǎng)破碎分成氣液兩個別，既做到深層通氣，又防止泡沫在反應器中積累。

動物細胞制藥第49頁

攪拌器有三個導流筒，與攪拌器中心垂直空腔相通，當導流筒隨攪拌器轉(zhuǎn)動時，因為離心力作用，攪拌器中心空腔產(chǎn)生負壓，使培養(yǎng)基從底部吸入，沿空腔螺旋式上升，再從三個導流筒排出，繞攪拌器外緣螺旋式下降。懸浮細胞或貼附有細胞微載體密度靠近于培養(yǎng)基，被培養(yǎng)基所裹脅，重復循環(huán)，充分混合。在微載體法培養(yǎng)貼壁動物細胞時，普通攪拌轉(zhuǎn)速在30～60r/min范圍內(nèi)。動物細胞制藥第50頁中空纖維生物反應器用途較廣，既可用于懸浮細胞培養(yǎng)，又可用于貼壁細胞培養(yǎng)。其原理是：模擬細胞在體內(nèi)生長三維狀態(tài)，利用反應器內(nèi)數(shù)千根中空纖維縱向布置，提供細胞近似生理條件體外生長微環(huán)境，使細胞不停生長。中空纖維是一個細微管狀結(jié)構(gòu)，管壁為極薄半透膜，富含毛細管，培養(yǎng)時纖維管內(nèi)灌流充以氧氣無血清培養(yǎng)液，管外壁則供細胞黏附生長，營養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)過半透膜從管內(nèi)滲透出來供細胞生長；對于血清等大分子營養(yǎng)物，劃必須從管外灌入，不然會被半透膜阻隔不能被細胞利用；細胞代謝廢物也可經(jīng)過半透膜滲透管內(nèi)，防止了過量代謝物對細胞毒害作用。動物細胞制藥第51頁優(yōu)點●占地空間少；

●細胞產(chǎn)量高，細胞密度可達109數(shù)量級；

●生產(chǎn)成本低，且細胞培養(yǎng)維持時間長，適合用于長久分泌細胞。

動物細胞制藥第52頁5、細胞生物反應器控制系統(tǒng)

由動物細胞特征所決定，細胞培養(yǎng)不能沿用微生物發(fā)酵過程中常見伎倆，安全而有效地方法是靠通入培養(yǎng)罐內(nèi)氣體中氧氣和氮氣百分比來實現(xiàn)控制溶氧值目標；采取二氧化碳/碳酸氫鈉緩沖液系統(tǒng)來控制培養(yǎng)液pH值，它主要是靠預先加入培養(yǎng)液中適量碳酸氫鈉和經(jīng)過改變氣體流量中二氧化碳含量來實現(xiàn)。動物細胞制藥第53頁6、生物反應器中細胞培養(yǎng)模式分批培養(yǎng)分批培養(yǎng)是指將細胞和培養(yǎng)基一次性裝入反應器內(nèi)，進行培養(yǎng)，細胞不停生長，產(chǎn)物也不停形成，經(jīng)過一定時間反應后，將整個反應系取出。動物細胞制藥第54頁流加培養(yǎng)流加培養(yǎng)是指先將一定量培養(yǎng)液裝入反應器，在適宜條件下接種細胞，進行培養(yǎng)，細胞不停生長，產(chǎn)物也不停形成。伴隨細胞對營養(yǎng)物質(zhì)不停消耗，新營養(yǎng)成份不停補充至反應器內(nèi)，使細胞深入生長代謝。到反應終止時，取出整個反應系。動物細胞制藥第55頁半連續(xù)培養(yǎng)半連續(xù)培養(yǎng)又稱為重復分批培養(yǎng)或換液培養(yǎng)，是指在分批培養(yǎng)基礎(chǔ)上不全部取出反應系，剩下個別重新補充新營養(yǎng)成份，在按分批培養(yǎng)方式進操作。這是反應器內(nèi)培養(yǎng)液體積保持不變操作方式。動物細胞制藥第56頁連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)是指將細胞種子和培養(yǎng)液一起加入反應器內(nèi)進行培養(yǎng)，首先新鮮培養(yǎng)液不停加入反應器內(nèi)，另首先又將反應液連續(xù)不停地取出，反應條件處于一個恒定狀態(tài)。與分批培養(yǎng)和半連續(xù)培養(yǎng)不一樣，連續(xù)培養(yǎng)能夠控制細胞所處環(huán)境條件長時間穩(wěn)定。所以，能夠使細胞維持在優(yōu)化狀態(tài)下，促進細胞生長和產(chǎn)物形成。動物細胞制藥第57頁灌注培養(yǎng)

灌注培養(yǎng)是指細胞接種后進行培養(yǎng)，首先新鮮培養(yǎng)基不停加入反應器，另首先又將反應液連續(xù)不停地取出，但細胞留在反應器內(nèi)，使細胞處于一個不停營養(yǎng)狀態(tài)。當高密度培養(yǎng)動物細胞時必需保持給細胞補充分夠營養(yǎng)以及去除有毒代謝廢物。經(jīng)過調(diào)整灌注速率能夠把培養(yǎng)過程保持在穩(wěn)定、廢物代謝低于抑制水平狀態(tài)下。普通在分批培養(yǎng)中細胞密度為（2～

4）×106cell/ml，在灌注系統(tǒng)中可到達（2～5）×107cell/ml。動物細胞制藥第58頁灌注培養(yǎng)優(yōu)點1、細胞所處環(huán)境中營養(yǎng)條件很好，有害代謝廢物濃度低；2、顯著提升細胞密度，從而提升產(chǎn)物表示量；3、產(chǎn)物在反應器中停留時間短，預防變性損失；4、培養(yǎng)基比消耗率降低，生產(chǎn)成本顯著降低。動物細胞制藥第59頁7、培養(yǎng)基研究進展——無血清培養(yǎng)基

通常動物細胞生長都有賴于血清存在，在普通培養(yǎng)基中，如不加血清，絕大個別細胞將不能增殖。但使用血清主要弊端是存在潛在污染源、不一樣批號蛋白含量差異大及價格高等，給生物制品生產(chǎn)造成了不利。這就引發(fā)了大家對無血清培養(yǎng)基研究。結(jié)果發(fā)覺，只要在培養(yǎng)基中增加一些適于細胞生長成份，如纖連蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素和表皮生長因子等，不少細胞即能在無血清供給情況下生長，尤其是CHO、雜交瘤及重組骨髓瘤細胞等。動物細胞制藥第60頁

其中胰島素是無血清培養(yǎng)基中促進動物細胞生長最主要多肽。CHO細胞能在僅含重組人胰島素一個蛋白成份無血清培養(yǎng)基中連續(xù)傳代。在人類細胞培養(yǎng)中，應用無血清培養(yǎng)基還能有選擇性地控制及防止成纖維細胞過分生長。一些細胞在無血清條件下，其生長和抗體產(chǎn)量甚至較有血清培養(yǎng)時高出數(shù)倍。另外，動物細胞培養(yǎng)應用無血清培養(yǎng)基成功，還將為一些疫苗生產(chǎn)降低成本。動物細胞制藥第61頁高等哺乳動物細胞生長特征正常哺乳類動物細胞含有以下四大生物學特征：

錨地依賴性：細胞必須附在固體上或固定表面才能生長分裂

血清依賴性：細胞必須含有生長因子才能生長

接觸抑制性：細胞與細胞接觸后，生長便受到抑制

形態(tài)依賴性：細胞稱扁平狀，并有長纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)

上述特征使得正常哺乳動物細胞在體外培養(yǎng)中，普通只能存活50代且在培養(yǎng)皿上以平面形式生長，即單層細胞生長。有時，正常細胞會改變一些特征而越過生理臨界點，繼續(xù)增殖并無限制分裂，這種狀態(tài)稱為細胞系形成，此時細胞成為細胞系。動物細胞制藥第62頁高等哺乳動物受體細胞條件細胞系特征喪失細胞接觸抑制性和錨地依賴性特征，遺傳穩(wěn)定性外源基因?qū)掖蝹鞔蟛恢劣趤G失，易于長久保留適當標識便于轉(zhuǎn)化株篩選和維持生長快且齊分裂周期短，生長均一，便于控制

便于大規(guī)模培養(yǎng)

大多數(shù)正常高等哺乳動物細胞并不能同時具備上述條件，癌細胞能滿足上述前四項要求，但在安全性能上有欠缺。安全性能好不合成份泌致病物質(zhì)，不致癌動物細胞制藥第63頁高等哺乳動物受體細胞遺傳標識營養(yǎng)缺點型哺乳動物受體細胞5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）次黃嘌呤核苷一磷酸（HMP）次黃嘌呤核苷（HR）GMPAMP尿嘧啶核苷一磷酸（UMP）胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP）胸腺嘧啶核苷（TR）嘌呤核苷酸生物合成路徑嘧啶核苷酸生物合成路徑次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HPRT）（TK）胸腺嘧啶核苷激酶氨基喋呤（AP）氨基喋呤（AP）從頭合成路徑補救合成路徑重新合成路徑補救路徑動物細胞制藥第64頁高等哺乳動物受體細胞遺傳標識營養(yǎng)缺點型哺乳動物受體細胞

含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）編碼基因缺點受體細胞（tk-）不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷培養(yǎng)基上（HAT培養(yǎng)基）生長，載體上標識基因tk能與之遺傳互補。

含有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HPRT）編碼基因缺點受體細胞（hprt-）不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷培養(yǎng)基上（HAT培養(yǎng)基）生長，載體上標識基因hprt與之遺傳互補。動物細胞制藥第65頁常見高等哺乳動物受體細胞

迄今為止，用于醫(yī)療用具（藥品、抗體、診療試劑）大規(guī)模生產(chǎn)高等哺乳動物受體細胞主要還是中國倉鼠卵巢細胞（CHO/dhFr-），其優(yōu)勢有以下幾個方面：遺傳背景清楚，生理代謝穩(wěn)定與人親緣關(guān)系靠近，外源蛋白修飾準確基因轉(zhuǎn)移和載體表示系統(tǒng)完善耐受剪切力，便于大規(guī)模培養(yǎng)被美國FDA確認為安全基因工程受體細胞動物細胞制藥第66頁磷酸鈣共沉淀法

將待轉(zhuǎn)化DNA溶解在磷酸緩沖液中，加入CaCl2溶液混勻，此時DNA被包裹在磷酸鈣晶體顆粒內(nèi)；將上述制備顆粒懸浮液滴入細胞培養(yǎng)皿中，37℃保溫4-16小時此時細胞膜形成吞噬泡，磷酸鈣晶體局部溶解膜結(jié)構(gòu)，DNA便進入受體細胞；棄去DNA溶液，加入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)7天即可篩選轉(zhuǎn)化株。假如在外源DNA中摻入少許受體細胞內(nèi)源性DNA能夠提升轉(zhuǎn)化效率。動物細胞制藥第67頁電擊轉(zhuǎn)化法

將待轉(zhuǎn)化DNA溶解在受體細胞懸浮液中，然后加入電擊轉(zhuǎn)化儀樣品槽內(nèi)，兩端施加瞬時高壓電場，使細胞膜產(chǎn)生細小縫隙，此時DNA片段便可不經(jīng)過胞飲作用直接進入受體細胞。電擊轉(zhuǎn)化法常見于對磷酸鈣共沉淀法無效細胞類型，如生長在懸浮液中淋巴細胞等。動物細胞制藥第68頁脂質(zhì)體介導法

將待轉(zhuǎn)化DNA溶液與磷脂混合，在表面活性劑存在下形成包埋水相DNA脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。將這種脂質(zhì)體懸浮液加入到細胞培養(yǎng)液中，便會與受體細胞膜融合，DNA隨即進入胞質(zhì)和核內(nèi)。利用上述程序曾將外源基因成功地導入了小鼠淋巴細胞和HeLa細胞。動物細胞制藥第69頁哺乳動物細胞物理轉(zhuǎn)化法

利用物理方法轉(zhuǎn)化高等哺乳動物細胞主要優(yōu)點是外源基因表示盒中不含任何病毒基因序列，這對外源基因表示產(chǎn)物分離純化減輕了負擔。但外源基因表示盒進入受體細胞后，往往以多拷貝形式隨機整合在染色體DNA上，造成受體細胞基因滅活、外源基因不表示。動物細胞制藥第70頁哺乳動物細胞病毒轉(zhuǎn)染法

以病毒DNA為載體能夠?qū)⑼庠椿蛑苯愚D(zhuǎn)染特定受體細胞。這種方法含有定向性好、試驗重復性佳、導入效率高等優(yōu)點，但也存在一定缺點，如當前常見載體宿主范圍有限，往往無法轉(zhuǎn)染一些含有主要經(jīng)濟價值家禽和牲畜細胞等。動物細胞制藥第71頁哺乳動物細胞高效表示外源蛋白基礎(chǔ)原理經(jīng)過強化基因擴增高效表示外源基因哺乳動物細胞內(nèi)基因擴增現(xiàn)象基因擴增是外源基因在哺乳動物細胞內(nèi)高效穩(wěn)定表示一個特殊方式。氨甲喋呤（MTX）是動物細胞中關(guān)鍵代謝酶二氫葉酸還原酶（DHFR）特異性抑制劑，細胞培養(yǎng)物經(jīng)氨甲喋呤處理后，絕大多數(shù)細胞死亡，但在極少數(shù)幸存下來抗性細胞中，dhfr基因均得以擴增。這些抗性細胞正是經(jīng)過增加相關(guān)基因拷貝數(shù)、提升關(guān)鍵代謝酶表示水平，從而抵消氨甲喋呤抑制效應。更主要是，擴增區(qū)域遠遠大于dhfr基因本身，即與dhfr基因相鄰DNA區(qū)域同時被擴增。動物細胞制藥第72頁哺乳動物細胞高效表示外源蛋白基礎(chǔ)原理經(jīng)過強化基因擴增高效表示外源基因DHFR-MTX高效表示系統(tǒng)外源基因dhfr轉(zhuǎn)染dhfr-

細胞系單克隆0.05mMMTX培養(yǎng)5mMMTX0.25mMMTX外源基因擴增至100拷貝培養(yǎng)單克隆轉(zhuǎn)移單克隆單克隆培養(yǎng)培養(yǎng)轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移不含核苷動物細胞制藥第73頁GS-MSX高效表示系統(tǒng)

谷氨酰胺合成酶（GS）能解除甲硫氨酸亞砜（MSX）對動物細胞毒害作用。先將帶有GS編碼基因載體轉(zhuǎn)入培養(yǎng)哺乳動物細胞中，因為只有多拷貝GS編碼基因才能抗MSX，所以在轉(zhuǎn)染過程中無須使用GS缺點型受體細胞，而且在正常MSX濃度下就能篩選到含有高拷貝外源基因轉(zhuǎn)染細胞，這是GS-MSX系統(tǒng)比DHFR-MTX系統(tǒng)優(yōu)越之處。動物細胞制藥第74頁經(jīng)過強化基因轉(zhuǎn)錄高效表示外源基因AprM13oriColE1oriCMVPPolylinkerGeneIntronSV40TPolyAsignal高效表示載體mRNA前體AAAAAAAAAmRNA

在載體上安裝病毒或細胞起源強開啟子以及有效翻譯元件，也是使外源基因高效表示一個伎倆，如