學(xué)習(xí)目標(biāo)①掌握酶法破碎方法的選擇。重難點(diǎn)重點(diǎn)：識記纖維素酶和溶菌酶的相關(guān)知識；難點(diǎn)：正確先用纖維素酶和溶菌酶用于生化分離。纖維素酶1溶菌酶2目錄1.纖維素霉纖維素霉水解酶寡糖單糖真菌多組分酶纖維素酶是多糖水解酶的一種，能水解纖維素的β1,4-糖苷鍵，將纖維素分解成寡糖或單糖。纖維素酶廣泛存在于自然界的生物體中。細(xì)菌、真菌、動物體內(nèi)等都能產(chǎn)生纖維素酶。一般用于生產(chǎn)的纖維素酶來自于真菌，比較典型的有木霉屬、曲霉屬和青霉屬。1.纖維素霉纖維素酶反應(yīng)和一般酶反應(yīng)不一樣，其最主要的區(qū)別在于纖維素酶是多組分酶系，且底物結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜。纖維素酶根據(jù)其催化反應(yīng)功能的不同可分為內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶。內(nèi)切葡聚糖酶隨機(jī)切割纖維素多糖鏈內(nèi)部的無定型區(qū)，產(chǎn)生不同長度的寡糖和新鏈的末端。外切葡聚糖酶作用于這些還原性和非還原性的纖維素多糖鏈的末端，釋放葡萄糖或纖維二糖。β葡萄糖苷酶水解纖維二糖產(chǎn)生兩分子的葡萄糖。1.纖維素霉由于底物的水不溶性，纖維素酶的吸附作用代替了酶與底物形成的ES復(fù)合物過程。纖維素酶先特異性地吸附在底物纖維素上，然后在幾種組分的協(xié)同作用下將纖維素分解成葡萄糖。1.纖維素霉2.溶菌霉亞歷山大·弗萊明于1923年發(fā)現(xiàn)溶菌酶，1928年首先發(fā)現(xiàn)了青霉素。后英國病理學(xué)家弗勞雷、德國生物化學(xué)家錢恩進(jìn)一步研究改進(jìn)，并成功的用于醫(yī)治人的疾病，三人共獲諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎。青霉素的發(fā)現(xiàn)，使人類找到了一種具有強(qiáng)大殺菌作用的藥物，結(jié)束了傳染病幾乎無法治療的時代；從此出現(xiàn)了尋找抗菌素新藥的高潮，人類進(jìn)入了合成新藥的新時代。2.溶菌酶溶菌酶水解酶細(xì)菌肽聚糖溶菌酶又稱胞壁質(zhì)酶或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，是一種能水解細(xì)菌中肽聚糖的堿性酶。主要通過破壞細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的βB-1,4糖苷鍵，使細(xì)胞壁不溶性肽聚糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂、內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌溶解。溶菌酶還可與帶負(fù)電荷的病毒蛋白直接結(jié)合，與DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復(fù)鹽，使病毒失活。2.溶菌酶2.溶菌酶溶菌酶廣泛存在雞蛋革蘭氏陽菌3.蝸牛酶蝸牛酶是從蝸牛的嗦囊和消化道中制備的混合酶，它含有纖維素酶，果膠酶，淀粉酶，蛋白酶等20多種酶。蝸牛酶是很有價值的一種酶。它可以用于酵母細(xì)胞壁的破碎，因此廣泛用于細(xì)胞生物學(xué)和基因工程學(xué)的研究。蝸牛酶內(nèi)含常見9種酶:從蝸牛消化腺中發(fā)現(xiàn)有纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、阿爾法淀粉酶、甘露糖酶、蔗糖酶、半乳聚糖酶、蛋白水解酶、氨基酸轉(zhuǎn)移酶等多種具有生物活性的混合酶。2技能訓(xùn)練過渡1.酶溶法結(jié)合超聲波法破碎大腸桿菌細(xì)胞1菌體準(zhǔn)備2酶處理3超聲波4檢查破碎率1.酶溶法結(jié)合超聲波法破碎大腸桿菌細(xì)胞操作原理大腸桿菌是革蘭陰性菌，其外壁層的穩(wěn)定需要Ca2+參與，利用EDTA可以清除Ca2+,破壞其穩(wěn)定性；利用溶菌酶可以裂解內(nèi)壁層的肽聚糖；而裂解液中加入TritonX-100可以破壞細(xì)胞膜；再經(jīng)過超聲波處理，可使菌體細(xì)胞