農(nóng)業(yè)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)講義課程簡(jiǎn)介

訓(xùn)練學(xué)生的農(nóng)業(yè)微生物學(xué)基本實(shí)驗(yàn)技能實(shí)驗(yàn)內(nèi)容常見的器皿、工具和儀器設(shè)備無(wú)菌操作技術(shù)；培養(yǎng)基的制備&消毒滅菌技術(shù)土壤微生物（固氮菌）的分離培養(yǎng)純化技術(shù)微生物制片染色技術(shù)微生物在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)生掌握農(nóng)業(yè)微生物學(xué)的最基本技能要求主要參考書沈萍，范秀容，李廣武主編．微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)（第三版）．北京：高等教育出版社，1999杜連祥，路福平主編．微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]．北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2005．周德慶．微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程（第2版）[M]．北京：高等教育出版社，2006．楊文博主編．微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004．趙斌，何紹江主編．微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]．北京：科學(xué)出版社，2002．東秀珠，蔡妙英主編．常見細(xì)菌系統(tǒng)分類和鑒定方法[M]．北京：科學(xué)出版社，2001．

實(shí)驗(yàn)課內(nèi)容介紹農(nóng)業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)要求及安全須知、環(huán)境、人體表面微生物的檢測(cè)從土壤中分離各種類群微生物（重點(diǎn)：固氮菌的分離）幾大類群微生物個(gè)體形態(tài)觀察微生物在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用固氮菌的分離鑒定土壤中氨化細(xì)菌的測(cè)定植物病原菌的分離鑒定（自主選做）實(shí)驗(yàn)一

農(nóng)業(yè)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課

介紹與安全教育實(shí)驗(yàn)課的目的掌握農(nóng)業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)的最基本操作技術(shù)相關(guān)技術(shù)得到充分訓(xùn)練（熟練掌握最好）讀、想、學(xué)、會(huì)、用實(shí)驗(yàn)課的具體安排和要求實(shí)驗(yàn)課學(xué)習(xí)要求實(shí)驗(yàn)過(guò)程的要求實(shí)驗(yàn)課安排良好的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣實(shí)驗(yàn)報(bào)告的形式成績(jī)的評(píng)定及組成實(shí)驗(yàn)課學(xué)習(xí)要求認(rèn)真對(duì)待，做好預(yù)習(xí)，加強(qiáng)自主拋磚引玉，增強(qiáng)學(xué)科聯(lián)系多發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，多和教師交流注重原理，努力創(chuàng)新做到“讀、想、學(xué)、會(huì)、用”實(shí)驗(yàn)過(guò)程的要求實(shí)驗(yàn)過(guò)程注意安全（具體介紹）操作時(shí)要預(yù)防空氣對(duì)流接種時(shí)不要走動(dòng)和講話認(rèn)真做好環(huán)境衛(wèi)生，做到“干干凈凈進(jìn)來(lái)，干干凈凈出去”進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室要洗手實(shí)驗(yàn)課安排根據(jù)教學(xué)計(jì)劃，本門實(shí)驗(yàn)課程1.5學(xué)分，3學(xué)時(shí)/周，14周共42學(xué)時(shí)，每學(xué)時(shí)45分鐘，每次課3小時(shí)；實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察是實(shí)驗(yàn)過(guò)程的重要內(nèi)容。分組——2-4人一組，登記聯(lián)系；穿白色實(shí)驗(yàn)服進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室；每組準(zhǔn)備記號(hào)筆和打火機(jī)各一個(gè)；值日生由班委每次實(shí)驗(yàn)前委派；良好的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣不遲到，不缺席，有事提前請(qǐng)假；遲到5分鐘以上以缺席計(jì)入實(shí)驗(yàn)習(xí)慣成績(jī)；愛護(hù)實(shí)驗(yàn)用具；實(shí)驗(yàn)完成后認(rèn)真清洗實(shí)驗(yàn)用具，并擺放整齊；離開實(shí)驗(yàn)室要經(jīng)教師檢查同意方可離開；認(rèn)真做好值日生工作，有人具體負(fù)責(zé)安排檢查。實(shí)驗(yàn)報(bào)告的格式實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)材料和器材實(shí)驗(yàn)方法和步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果、數(shù)據(jù)分析討論及思考題實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求

1.每位學(xué)生準(zhǔn)備規(guī)定式樣的實(shí)驗(yàn)報(bào)告紙。

2.上課時(shí)每給出一次作業(yè)，就在下一次上課前上交這一次的實(shí)驗(yàn)報(bào)告，不得拖延時(shí)間

3.報(bào)告要求寫清楚實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、原理、步驟、結(jié)果及思考題。希望簡(jiǎn)潔、工整

4.本門課結(jié)束前，要求使用統(tǒng)一的封面，把自己的所有實(shí)驗(yàn)報(bào)告按實(shí)驗(yàn)先后順序裝訂成一冊(cè)，交給實(shí)驗(yàn)教師實(shí)驗(yàn)課成績(jī)平時(shí)成績(jī)（20%，安排于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中或期末進(jìn)行操作考核）實(shí)驗(yàn)習(xí)慣（10%）期末考試（20%，筆試考試）實(shí)驗(yàn)報(bào)告（50%）可能組織就實(shí)驗(yàn)內(nèi)容進(jìn)行答辯，替代期末考試

實(shí)驗(yàn)用到儀器設(shè)備顯微鏡（光學(xué)——普通、相差、微分干涉差、暗視野；電子——掃描、透射）；高壓蒸汽滅菌鍋（立式和臥式）；超凈工作臺(tái)、隔水式恒溫培養(yǎng)箱；鼓風(fēng)恒溫干燥箱；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（旋轉(zhuǎn)式和往復(fù)式）；旋渦振蕩器；恒溫水浴鍋；pH計(jì)；分光光度計(jì)（紫外、可見光、紅外、原子吸收等）；離心機(jī)；冰箱；微波爐等。實(shí)驗(yàn)用到器械試管（testtube）德漢氏小管（Durhamtube）小塑料離心管，又稱Eppendorf管玻璃吸管（glass

pipette）微量吸管（micropipette）[微量加樣槍]培養(yǎng)皿（petridish）三角燒瓶（erlenmeyerflask）實(shí)驗(yàn)用到器械載玻片（slide）和蓋玻片（coverslip）滴瓶(dropperbottle)接種工具——接種環(huán)、接種針、接種鉤、接種鏟、接種刀、涂布器（玻璃或不銹鋼制作）等。常見的接種工具

（可根據(jù)要求自已定做）常用玻璃儀器實(shí)驗(yàn)室安全實(shí)驗(yàn)教學(xué)過(guò)程中出現(xiàn)的各類突發(fā)事故和事件主要有：1、火災(zāi)；2、觸電；3、跑（漏）水；4、化學(xué)品傷害及中毒；5、灼傷；6、割（劃）傷。實(shí)驗(yàn)室安全事故處理要求先保護(hù)好自身的安全，再施救不要慌張，按安全預(yù)案處理認(rèn)真負(fù)責(zé)，不推缷責(zé)任逐級(jí)上報(bào)，不隱瞞事故化學(xué)藥品及溶劑的處理方法1.在使用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿時(shí)必需戴上安全手套，并戴上安全眼鏡。2.有機(jī)溶劑，固體化學(xué)藥品，酸、堿化合物均需分類存放，揮發(fā)性之化學(xué)藥品更必需放置于具有抽氣裝置的藥品柜內(nèi)。3.高揮發(fā)性或易于氧化之化學(xué)藥品必需存放于冰箱或冰柜之中。4.強(qiáng)酸或強(qiáng)堿（包括廢酸堿）不得存放于金屬架之上。安全用電防止事故1.了解實(shí)驗(yàn)室總電源開關(guān)的安裝位置。2.不可用濕手操作電器，使用電工工具前確認(rèn)其完好無(wú)損。3.嚴(yán)禁在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)私自接用電源。4.確保漏電保護(hù)器起作用，用電器外殼接好地線，實(shí)驗(yàn)室無(wú)人時(shí)要切斷電源。5.遇有電器失火，先要切斷電源，再行滅火。6.人身觸電，立即人工呼吸，再送醫(yī)院，切忌打強(qiáng)心針。

節(jié)約用水防止跑漏1.不用水時(shí)，隨手關(guān)閉閥門。2.廢物廢液不準(zhǔn)倒在水槽內(nèi)，實(shí)驗(yàn)完了放水沖洗水槽和下水管，勿使廢液殘留其中。安全使用藥品防止中毒1.使用化學(xué)藥品前，要充分了解其化學(xué)性質(zhì)、物理性質(zhì)和使用注意事項(xiàng)。2.不能嘗化學(xué)藥品，也不能直接去聞化學(xué)藥品，避免用手直接去接觸藥品；使用藥品和實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即用肥皂水洗手。3.盡量不可在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)餐。4.有毒或帶剌激味的實(shí)驗(yàn)要在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)期間要開排風(fēng)扇，或開窗通風(fēng)。5.做好廢液處理，防止環(huán)境污染；發(fā)現(xiàn)中毒現(xiàn)象，及時(shí)對(duì)癥治療，必要時(shí)送醫(yī)院。實(shí)驗(yàn)時(shí)需特別注意：人身安全防止割傷、灼傷，如有發(fā)生，應(yīng)用急救藥品施治意外對(duì)策學(xué)生衣服著火的對(duì)策以滅火「氈」包裹該同學(xué)，并使其在地上滾動(dòng)其他同學(xué)立刻通知老師。實(shí)驗(yàn)室的窗簾布著火的對(duì)策：取出滅火器，拔出安全針。把噴咀對(duì)準(zhǔn)火源。按掣使滅火器噴出二氧化碳。其他同學(xué)立刻通知老師。酒精濺在實(shí)驗(yàn)桌上并著火的對(duì)策：利用沙桶或濕抹布把燃燒的液體用沙蓋著。其他同學(xué)立刻通知老師。學(xué)生打破了燒杯，被碎片割傷流血的對(duì)策以清水沖洗傷口。貼上干凈的消毒膠布。其他同學(xué)立刻通知老師?；瘜W(xué)藥品濺進(jìn)學(xué)生的眼睛內(nèi)的對(duì)策用洗眼瓶以大量清水沖洗眼睛。其他同學(xué)立刻通知老師。一個(gè)學(xué)生在傾倒酸時(shí)意外地接觸到酸的對(duì)策立刻以大量清水沖洗患處最少五分鐘。立刻通知老師。實(shí)驗(yàn)物品常見警告標(biāo)識(shí)符號(hào)滅火器及其使用方法實(shí)驗(yàn)二

實(shí)驗(yàn)室環(huán)境及人體表面微生物的檢測(cè)

一、目的要求

檢查實(shí)驗(yàn)室空氣中及各人手上的微生物(細(xì)菌為主)，并加以統(tǒng)計(jì)、比較和描述（數(shù)量、菌落形態(tài)等）。使學(xué)生認(rèn)識(shí)到微生物無(wú)處不在，以便在以后的實(shí)驗(yàn)中重視無(wú)菌操作。二、實(shí)驗(yàn)原理微生物廣泛分布于室內(nèi)外、水、空氣和土壤中；通過(guò)對(duì)環(huán)境和人體表面微生物的檢測(cè)及觀察，建立起“微生物無(wú)處不在、無(wú)孔不入”的概念。形成自身良好的衛(wèi)生習(xí)慣，認(rèn)識(shí)到在微生物實(shí)驗(yàn)中無(wú)菌操作的重要性。平板培養(yǎng)基含有微生物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)成分，當(dāng)不同來(lái)源的樣品接種于培養(yǎng)基上，在適宜溫度下培養(yǎng)，1~2天內(nèi)每一菌體細(xì)胞即能通過(guò)很多次細(xì)胞分裂而進(jìn)行繁殖，形成一個(gè)肉眼可見的細(xì)胞群體（菌落）；每種微生物都有其特有的菌落形態(tài)，一般情況下一個(gè)菌落對(duì)應(yīng)一個(gè)微生物活細(xì)胞，這樣就可以統(tǒng)計(jì)不同微生物在某樣品中的數(shù)量。三、實(shí)驗(yàn)材料及器材牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板3個(gè)/組；洗手液、酒精燈、記號(hào)筆、恒溫培養(yǎng)箱等。四、實(shí)驗(yàn)方法及步驟（一）實(shí)驗(yàn)室空氣中微生物檢查（二）手上微生物檢測(cè)

1、取一無(wú)菌牛肉膏蛋白胨瓊脂平板，打開上皿蓋（皿蓋扣放，開始計(jì)時(shí)），使培養(yǎng)基暴露于空氣中30分鐘，蓋上皿蓋。

2、在37℃下倒置培養(yǎng)24~48小時(shí)，觀察結(jié)果，統(tǒng)計(jì)微生物數(shù)量。（一）實(shí)驗(yàn)室空氣中微生物檢查

（沉降法）3、利用沉降法測(cè)定計(jì)算空氣中微生物的數(shù)量，結(jié)果的表示的方法有兩種：①一種是每一平皿上菌落形成單位;②另一種是每一平皿實(shí)測(cè)得的菌落形成單位，再按奧梅梁斯基公式換算成為每立方米多少個(gè)細(xì)菌。

根據(jù)前蘇聯(lián)奧梅梁斯基提出的建議：面積為100cm2的平板培養(yǎng)基，暴露在空氣中5分鐘相當(dāng)于10升空氣中的菌落數(shù)。具體計(jì)算公式如下：除沉降法外，常用還有撞擊式（有專門儀器設(shè)備）。多級(jí)撞擊式空氣微生物采樣器1、取一個(gè)牛肉膏蛋白胨瓊脂平板，用記號(hào)筆在平板底部（外面）劃線等分成2半，用手指在其中一半上印（或摩擦）幾下（不能把培養(yǎng)基劃破）；然后用肥皀洗手，用同一手指在另一半上印（或摩擦）幾下。2、在37℃下倒置培養(yǎng)24~48小時(shí)，觀察結(jié)果，統(tǒng)計(jì)比較洗手前后的微生物數(shù)量及菌落種類。（二）手上微生物檢測(cè)

（三）菌落特征描寫方法①大小大、中、小、針尖狀?？上葘⒄麄€(gè)平板上的菌落粗略觀察一下，再?zèng)Q定大、中、小的標(biāo)準(zhǔn)，或由教師指出一個(gè)大小范圍。②顏色黃色、金黃色、灰色、乳白色、紅色、粉紅色等。③干濕情況干燥、濕潤(rùn)、粘稠④形態(tài)圓形、不規(guī)則等⑤高度扁平、隆起、凹下⑥透明程度透明、半透明、不透明⑦邊緣整齊、不整齊本次實(shí)驗(yàn)的思考題1、將你在平板上觀察到的結(jié)果填入下表樣品來(lái)源菌落數(shù)(近似值)菌落類型特征描寫大小形態(tài)干濕高度透明度顏色邊緣洗手前1234洗手后1234空氣中12342、計(jì)算出相應(yīng)的空氣中微生物數(shù)量？

3、洗手前后的手指平板，菌落數(shù)有無(wú)區(qū)別，為什么？如果想定量測(cè)定人體某部分皮膚上的細(xì)菌如何操作？

4、通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)?zāi)阌惺裁锤惺荏w會(huì)？

5、根據(jù)已做過(guò)的實(shí)驗(yàn)，談?wù)剬?shí)驗(yàn)室安全需要注意的事項(xiàng)。下周的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)二培養(yǎng)基配制、相關(guān)器皿的包扎及消毒滅菌重點(diǎn)：培養(yǎng)基的概念、分類、配制過(guò)程及注意事項(xiàng)；相關(guān)器皿的規(guī)范包扎及要求；消毒、滅菌的概念和方法，滅菌器的使用。實(shí)驗(yàn)二

培養(yǎng)基配制、相關(guān)器皿的包扎及消毒滅菌實(shí)驗(yàn)的目的&要求明確培養(yǎng)基制備原理通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基的配制，掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟了解消毒、滅菌的原理及方法，掌握干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌學(xué)習(xí)并練習(xí)相關(guān)器皿的包扎方法內(nèi)容一

培養(yǎng)基及無(wú)菌水的制備一、培養(yǎng)基的相關(guān)知識(shí)介紹1、培養(yǎng)基的定義和組成培養(yǎng)基：指由人工配制的、適合微生物生長(zhǎng)繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物用的混合營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)（反映培養(yǎng)基的2個(gè)作用？）。包括六大營(yíng)養(yǎng)要素：碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子、能源、水。2、培養(yǎng)基制備原則和方法四個(gè)原則：目的明確；營(yíng)養(yǎng)協(xié)調(diào)；物理化學(xué)條件適宜；經(jīng)濟(jì)節(jié)約C/N：指在微生物培養(yǎng)基中所含的碳源中碳原子摩爾數(shù)與氮源中的氮原子摩爾數(shù)之比四種方法：生態(tài)模擬；參閱文獻(xiàn)；精心設(shè)計(jì)；試驗(yàn)比較3、物理化學(xué)條件適宜的說(shuō)明pH值：滲透壓和水活度（aw）：在同溫同壓下，某溶液的蒸氣壓（P）與純水蒸氣壓（P0）之比。氧化還原電位：針對(duì)厭氧菌分離特別需要注意（半胱氨酸、巰基乙醇酸鈉等）4、培養(yǎng)基的分類（1）按成分分——對(duì)成分種類、量是否清楚天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基（組合培養(yǎng)基）半合成培養(yǎng)基（也稱半組合培養(yǎng)基）（2）按物理狀態(tài)分固體培養(yǎng)基（凝固劑的使用1.5%-2.5%)；固體基質(zhì)的使用）半固體培養(yǎng)基（凝固劑使用量較低0.2-0.7%）液體培養(yǎng)基（工業(yè)生產(chǎn)中的重要性）脫水培養(yǎng)基（也稱預(yù)制干燥培養(yǎng)基）（3）按培養(yǎng)基對(duì)微生物的功能分基礎(chǔ)培養(yǎng)基：含有一般微生物生長(zhǎng)繁殖需要的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。選擇性培養(yǎng)基：根據(jù)某種微生物的特殊營(yíng)養(yǎng)要求或其對(duì)某化學(xué)、物理因素的抗性而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，具有使混合菌樣中的劣勢(shì)菌變成優(yōu)勢(shì)菌的功能，廣泛用于菌種篩選等領(lǐng)域。“投其所好、取其所抗”。——高通量篩選的建立。鑒別性培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入有能與目的菌的無(wú)色代產(chǎn)物發(fā)生顯色反應(yīng)的指示劑，從而達(dá)到只須用肉眼辨別顏色就能方便地從近似菌落中找出目的菌菌落的培養(yǎng)基。——直觀、專一性（伊紅美蘭培養(yǎng)基，EMB）大腸桿菌在EMB培養(yǎng)基上的形態(tài)二、培養(yǎng)基的配方一個(gè)實(shí)驗(yàn)班共配置3種固體培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基高氏1號(hào)培養(yǎng)基馬丁氏培養(yǎng)基按照老師的劃分進(jìn)行，每個(gè)實(shí)驗(yàn)小組都要準(zhǔn)備，幾個(gè)實(shí)驗(yàn)小組配1種培養(yǎng)基，供全班使用1、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（分離、培養(yǎng)細(xì)菌用）

——500ml/組牛肉膏3.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g水1000ml瓊脂15～20g（本次用15g）pH7.4～7.6

可溶性淀粉20gNaCl0.5gKNO31.0gK2HPO4·3H2O

0.5gMgSO4·7H2O0.5gFeSO4·7H2O0.01g

瓊脂15～25g(本次用15g）水1000mlpH7.4～7.6

臨用時(shí)無(wú)菌操作在800ml培養(yǎng)基中加入3%的K2Cr2O7溶液1ml2、高氏1號(hào)培養(yǎng)基（分離、培養(yǎng)放線菌用）

——500ml/組KH2PO41gMgSO4·7H2O0.5g蛋白胨5g葡萄糖10g瓊脂20g水1000mlpH6.0配好后在此培養(yǎng)基中，按1000ml加入1%孟加拉紅水溶液3.3ml。臨用時(shí)以無(wú)菌操作在100ml培養(yǎng)基中加入1%的鏈霉素0.3ml，使其終濃度為30ug/ml。3、馬丁氏培養(yǎng)基（分離、培養(yǎng)真菌用）

——500ml/組三、培養(yǎng)基配制的步驟1、計(jì)算按照配方要求（一般為1000ml的量）和實(shí)際配制培養(yǎng)基的量，計(jì)算出不同組分需要的量。2、稱量、溶解按培養(yǎng)基配方在三角瓶中先加水（如無(wú)加入后大幅度改變?cè)w積的物質(zhì)，可以把水加足），然后依次準(zhǔn)確稱取各藥品并分別逐一溶解于其中（瓊脂需加熱溶解），最后補(bǔ)充水到所需體積。（注意：各成分之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生不溶的沉淀；培養(yǎng)基成分中有影響pH試紙的顯色的物質(zhì)，調(diào)pH值后再加入）3、調(diào)pH

用5~10%NaOH、1~5%HCl溶液將培養(yǎng)基的pH調(diào)到所需范圍，根據(jù)需要用精密pH試紙或pH計(jì)來(lái)確定。4、包扎（有一定規(guī)范要求）5、滅菌（高壓蒸汽滅菌：121.3℃,15～30min）四、培養(yǎng)基配制過(guò)程中需注意的事項(xiàng)先加水——易產(chǎn)生沉淀逐一溶解——易產(chǎn)生沉淀調(diào)節(jié)pH——容易忘記加塞滅菌（或過(guò)濾除菌）——即時(shí)滅菌煮過(guò)或加熱過(guò)培養(yǎng)基，注意水的蒸發(fā)——補(bǔ)足五、培養(yǎng)基配制中的2點(diǎn)說(shuō)明1、量微的藥品（天平無(wú)法稱量），以溶液形式加入（先配制成一定濃度的溶液）；2、粘稠的藥品和物品，稱好后與稱量紙一起放入溶液中，待藥品溶解后取出稱量紙；或利用減稱量法完成（從總藥品量中以減量稱出所需要的量）。六、無(wú)菌水的準(zhǔn)備經(jīng)滅菌處理后的蒸餾水或自來(lái)水。1、量取90mL蒸餾水在250mL三角瓶，內(nèi)加玻珠1瓶2、吸取9mL蒸餾水在18*180試管中6支包扎后滅菌。注意?。?biāo)記（記號(hào)筆）寫在器皿壁或外包裝紙上（如還需要高壓蒸汽滅菌，只能寫在外包裝紙上）；不要直接寫在瓶（管）塞或包裝棉布上。內(nèi)容二

消毒與滅菌一、消毒、滅菌的定義和常見方法消毒：指消滅病原菌和有害微生物的營(yíng)養(yǎng)體。滅菌：指殺滅一切微生物的營(yíng)養(yǎng)體、芽孢和孢子。常見方法：加熱法：包括干熱滅菌和濕熱滅菌過(guò)濾除菌輻射滅菌化學(xué)藥品滅菌高溫滅菌或消毒的方法過(guò)濾除菌技術(shù)（正壓和負(fù)壓之分）濾膜過(guò)濾器——微孔濾膜（醋酸纖維、硝酸纖維、火棉膠、有機(jī)大分子物質(zhì)），孔徑0.22和0.45um。玻璃濾器——玻璃粉燒結(jié)板（G1~G6）蔡氏（Seitz）濾器——多層石棉纖維板（整體為金屬制成）其它（不常見）——陶瓷、硅藻土制濾燭形：

——張伯倫（Chamberland）濾器

——伯克菲爾德（Berkefeld）濾器

——曼德勒爾（Mandler）濾器膜過(guò)濾裝置不耐熱的液體培養(yǎng)基的除（滅）菌膜過(guò)濾裝置細(xì)菌截留于膜過(guò)濾器濾膜表面二、加熱滅菌的方法1、干熱滅菌法：火焰灼燒法烘箱內(nèi)熱空氣滅菌法2、濕熱滅菌（消毒）法：常壓下：巴氏消毒法；煮沸消毒法；間歇滅菌法。加壓下：常規(guī)加壓滅法；連續(xù)加壓滅菌法。三、干熱滅菌火焰灼燒滅菌和熱空氣滅菌兩種方法通常所說(shuō)的干熱滅菌是在電熱干燥箱內(nèi)利用高溫干燥空氣（160~170℃）進(jìn)行滅菌，此法適用于玻璃器皿（吸管、培養(yǎng)皿等）的滅菌干熱滅菌需要注意的事項(xiàng)不能對(duì)塑料器皿和培養(yǎng)基滅菌；控制好溫度和時(shí)間（160~180℃，2小時(shí)），防止包扎的報(bào)紙焦糊；滅菌過(guò)程（未完全冷下來(lái)，60℃以下）不要打開烘箱門，防止報(bào)紙著火或玻璃器皿遇冷爆裂。四、高壓蒸汽滅菌鍋的

結(jié)構(gòu)及使用高壓蒸汽滅菌的原理高壓蒸汽滅菌器是利用加壓的飽和蒸汽（潛熱）對(duì)物品、器械、藥液等滅菌的設(shè)備，適用于科學(xué)研究、醫(yī)療衛(wèi)生、食品等實(shí)驗(yàn)室或工廠使用——造成蛋白質(zhì)等變性失活。潛熱是指當(dāng)1g100℃的水蒸汽變成1g100℃水時(shí)，釋放出2255.2J（1卡=4.184焦耳）的熱量。各種高壓蒸汽滅菌器之間的區(qū)別只在于自動(dòng)化程度的高低（水位控制、溫度恒定控制、時(shí)間控制、自動(dòng)排放冷空氣、程序化顯示）飽和蒸汽壓壓力指示溫度直接利用溫度探測(cè)器指示溫度典型的高壓蒸汽滅菌鍋縱剖面結(jié)構(gòu)壓力調(diào)節(jié)器安全閥排氣口控制柄記錄儀門墊圈放電器蒸汽閥蒸汽夾層阻板蒸汽供給蒸汽供應(yīng)閥溫度感應(yīng)器蒸汽凝汽瓣廢汽冷凝器蒸汽通入夾層蒸汽由夾層到滅菌室夾層冷凝水收集口蒸汽由夾層進(jìn)入滅菌室和蒸汽排出口臥式滅菌鍋示意圖（簡(jiǎn)圖）蒸汽進(jìn)口滅菌過(guò)程出氣口（冷空氣和蒸汽）滅菌時(shí)間到排汽口壓力表蒸汽排氣閥溫度計(jì)閥蒸汽供應(yīng)閥門消毒室夾套（層）

立式壓力滅菌器手提式滅菌鍋臥式矩型和圓型壓力蒸汽消毒器高壓蒸汽滅菌過(guò)程：1、取出內(nèi)筒，檢查水位；2、加水至淹過(guò)電發(fā)熱管和內(nèi)筒支架；3、放入內(nèi)筒，并在其中放入需滅菌物品（要求松散）；4、加蓋（對(duì)稱旋緊），打開放汽閥；5、加熱（有內(nèi)外兩種），升溫；6、排除冷空氣——由放汽閥冒汽3~5分鐘；7、關(guān)閉放汽閥（有些滅菌鍋滅菌過(guò)程中一直保持較小排氣或到一定溫度自動(dòng)關(guān)閉），加壓升溫至所需溫度或壓力；8、保溫定時(shí)至所需時(shí)間；9、不再加熱，降溫至壓力表為“0”，打開放汽閥；10、開蓋取物（注意蒸汽燙傷）。空氣排除度對(duì)滅菌溫度的影響壓力表讀數(shù)鍋內(nèi)溫度（℃）kg/cm2磅/吋2MPa飽和蒸汽排除1/2空氣不排除空氣0.3550.031108.894720.70110.076115.6110901.05150.108121.31121001.40200.142126.21181091.75250.172130.01241152.10300.213134.6128121一些細(xì)菌芽孢濕熱滅菌所需時(shí)間消毒、滅菌的生物指示菌嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillusstearothermophilus）結(jié)核分枝桿菌——致病菌指示菌（Mycobacteriumtuberculosis沙門氏菌——致病菌指示菌（通用檢測(cè)）（Salmonellaspp）高壓蒸汽滅菌效果的監(jiān)測(cè)方法（3種）1、工藝（程序）監(jiān)測(cè)——壓力表、溫度計(jì)等，最常見，每次都使用；2、化學(xué)指示監(jiān)測(cè)——特定化合物熔點(diǎn)（熔化前后晶體形態(tài)不同，硫磺熔點(diǎn)115℃、乙酰替苯胺116℃、脫水琥珀酸120℃、苯甲酸122.4℃等結(jié)晶）、滅菌指示膠帶（變色反應(yīng)）；3、生物指示劑監(jiān)測(cè)——特定微生物（需經(jīng)培養(yǎng)）。五、實(shí)驗(yàn)室常用滅菌方法1、高壓蒸汽滅菌——常用121.3℃，20min和115℃，10min兩種條件進(jìn)行；適用于耐熱性溶液、培養(yǎng)基和水的滅菌；2、熱空氣干熱滅菌——160~170℃，2hr；適用于玻璃器皿和金屬工具的滅菌；3、灼燒滅菌——酒精燈和電加熱，適用于接種工具的滅菌；4、過(guò)濾除菌——現(xiàn)在一般使用微孔濾膜（0.22μm或0.45μm），適用于非耐熱性溶液和培養(yǎng)基的過(guò)濾除菌。內(nèi)容三

相關(guān)器皿的包扎方法一、器皿包扎的作用1、濕熱滅菌時(shí)防止冷凝水的污染；2、滅菌后可以長(zhǎng)期放置，保持器皿等的無(wú)菌狀態(tài)和防止灰塵的污染。二、相關(guān)器皿的包扎要求利用報(bào)紙、牛皮紙或?qū)Ｓ闷餍蛋攸c(diǎn)練習(xí)報(bào)紙包扎。1、培養(yǎng)皿的包扎

——雙層大報(bào)紙、12套包扎成1包2、吸管的的包扎

——吸管先塞棉花（松緊適度），利用寬5cm左右的長(zhǎng)條形報(bào)紙裹扎3、試管和三角瓶的包扎4、涂布器（刮子）的包扎三、包扎中的幾點(diǎn)說(shuō)明包扎紙大小適中，器皿或器材不外露，塞子、紗（棉）布、瓶口、管口等不外露。包扎試管和三角瓶時(shí)，包扎線向下一點(diǎn)，不要扎在塞子上。裝有培養(yǎng)基等液體的容器，包扎過(guò)程或包扎好后不要倒置（包括水平放置），以免造成污染（塞子）和內(nèi)裝液體不準(zhǔn)。四、利用吸管筒（銅制或不銹鋼制）包扎吸管滅菌不銹鋼吸管筒、培養(yǎng)皿筒本次實(shí)驗(yàn)完成的內(nèi)容1、90mL無(wú)菌水1瓶（250mL三角瓶，內(nèi)加玻璃珠）2、9mL無(wú)菌水6支（18×180試管）3、1mL無(wú)菌吸管6支4、培養(yǎng)基１瓶（500mL，三種之一）5、9cm培養(yǎng)皿1包（12個(gè)）6、涂布刮子4支思考題1、在配制培養(yǎng)基的操作過(guò)程中應(yīng)該注意些什么問(wèn)題？為什么？2、高壓蒸汽滅菌之前，為什么要將鍋內(nèi)冷空氣排凈？滅菌完畢后，為什么要待壓力降至“0”時(shí)才能打開排氣閥，開蓋取物？下周的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)三微生物的分離和純化要點(diǎn)：無(wú)菌操作技術(shù)的概念、重要性及實(shí)現(xiàn)方式微生物的分離和純化的原理和方法實(shí)驗(yàn)三微生物的分離

和純化目的要求掌握一定的無(wú)菌操作技術(shù)（包括上次實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)基及實(shí)驗(yàn)用具的滅菌），了解無(wú)菌（潔凈）空間的實(shí)現(xiàn)手段和方式。掌握倒平板、制斜面的技術(shù)和方法。掌握幾種分離純化微生物的原理及基本操作技術(shù)和方法基本概念菌落——單個(gè)細(xì)胞（孢子）或少數(shù)幾個(gè)同種細(xì)胞（孢子）在固體培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)適當(dāng)培養(yǎng)后，形成肉眼可見的具有一定形態(tài)特征的細(xì)胞群體。菌苔——若干菌落（同種或不同種）聚集在一起，不可分，無(wú)一定形狀形態(tài)特征。稀釋倍數(shù)——溶液經(jīng)過(guò)定量稀釋后可以計(jì)算的倍數(shù)，一般用于CFU/ml計(jì)算。稀釋度——稀釋倍數(shù)的倒數(shù)，標(biāo)記和表述時(shí)用。污染來(lái)源空氣（空間）——實(shí)驗(yàn)室、車間、生產(chǎn)場(chǎng)所等；實(shí)驗(yàn)用器材——實(shí)驗(yàn)用具、器皿、器械、試劑、藥品等；實(shí)驗(yàn)材料——實(shí)驗(yàn)用材料和樣品本身攜帶；人體——衣服、毛發(fā)、皮膚表面、和外界相通的腔道等無(wú)菌操作技術(shù)的概念指防止微生物進(jìn)入機(jī)體或其他物品的操作技術(shù)，具有兩方面的要求。防感染——針對(duì)生物體（包括操作者）。防污染——針對(duì)培養(yǎng)物、實(shí)驗(yàn)所用物品和實(shí)驗(yàn)室空間等。針對(duì)人來(lái)說(shuō)，還要解決防止雙向交叉感染操作的問(wèn)題——人對(duì)培養(yǎng)物等的污染；培養(yǎng)物對(duì)人的感染。實(shí)驗(yàn)室中如何實(shí)現(xiàn)？無(wú)菌操作技術(shù)建立的理論

依據(jù)和過(guò)程路易斯·巴斯德

（LouisPasteur,1822---1895）曲頸瓶實(shí)驗(yàn)否認(rèn)“自然發(fā)生學(xué)說(shuō)”建立“種胚學(xué)說(shuō)”曲頸瓶試驗(yàn)過(guò)程約瑟夫·李斯特

（JosephLister1827~1912）發(fā)明和推廣外科防腐技術(shù)的外科專家。認(rèn)真仔細(xì)洗手；使用的手術(shù)器材和敷料做徹底的衛(wèi)生處理（高溫消毒）；向手術(shù)室空中噴灑石炭酸（空氣消毒）；病人的傷口要消毒，要包扎繃帶；醫(yī)生要穿潔白的衣服。使用手術(shù)后死亡率由45％減少至15％（1889年）。十九世紀(jì)外科手術(shù)的場(chǎng)景現(xiàn)今無(wú)菌操作技術(shù)的介紹世界各國(guó)潔凈度等級(jí)對(duì)照表國(guó)名美國(guó)美國(guó)日本英國(guó)德國(guó)規(guī)格FS209DFS209EJISB9920BS5295VDI2083年度19881992198919891990粒子粒度0.5um0.5um0.1um0.5um1um單位pcs/ft3pcs/m3pcs/m3pcs/m3pcs/m3等級(jí)--1---M12-01M1.53C110M2.54D2100M3.55E~F31,000M4.56G~H410,000M5.57I5100,000M6.58J6-M7-K7---L8生物安全實(shí)驗(yàn)室分級(jí)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究所美國(guó)疾病管理中心病源操作一級(jí)屏障二級(jí)屏障P1BSL-1不會(huì)經(jīng)常引發(fā)健康成人疾病標(biāo)準(zhǔn)的微生物操作不要求開放實(shí)驗(yàn)臺(tái)、洗手池P2

BSL-2

人類病源菌，因皮膚傷口、吸入、黏膜曝露而發(fā)生危險(xiǎn)

BSL—1操作加：1、限制進(jìn)入2、有生物危險(xiǎn)警告標(biāo)志3、“銳器”安全措施4、生物安全手冊(cè)，其中規(guī)定廢物消毒和醫(yī)療觀察1級(jí)、2級(jí)生物安全柜實(shí)驗(yàn)服、手套、若需要?jiǎng)t采取面部保護(hù)措施BSL-1加：高壓滅菌鍋P3BSL-3內(nèi)源性和外源性病源，可通過(guò)氣溶膠傳播，能導(dǎo)致嚴(yán)重后果或生命危險(xiǎn)BSL-2操作加：1、控制進(jìn)入2、所有廢物消毒3、洗滌前，實(shí)驗(yàn)服消毒4、有基礎(chǔ)血清1級(jí)、2級(jí)生物安全柜保護(hù)性實(shí)驗(yàn)服、手套、若需要?jiǎng)t采取呼吸保護(hù)措施BSL-2加：1、和進(jìn)入走廊隔開2、雙門進(jìn)入，門自動(dòng)關(guān)閉3、排出的空氣不循環(huán)4、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)負(fù)壓P4BSL-4對(duì)生命有高度危險(xiǎn)的危險(xiǎn)性病源或外源性病源：致命、通過(guò)氣溶膠而致實(shí)驗(yàn)室感染：或未知傳播風(fēng)險(xiǎn)的有關(guān)病源BSL—3操作加：1、進(jìn)入前換衣服2、出實(shí)驗(yàn)室前淋浴3、帶出設(shè)施的所有材料消毒3級(jí)生物安全柜或1級(jí)、2級(jí)生物安全柜加全身、供應(yīng)空氣、正壓防護(hù)服BSL—3加：1、單獨(dú)建筑或隔離區(qū)域2、有供氣系統(tǒng)、排氣系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、消毒系統(tǒng)3、其他有關(guān)要求中國(guó)藥品生產(chǎn)潔凈室（區(qū)）的空氣潔凈度標(biāo)準(zhǔn)

潔凈度級(jí)別塵埃最大允許數(shù)/立方米微生物最大允許個(gè)數(shù)≥0.5um≥5um浮斿菌個(gè)數(shù)/立方米沉降菌個(gè)數(shù)/皿30分鐘1003500051100003500002000100310000035000002000050053000001050000061800NA15設(shè)備及設(shè)施介紹具有高效過(guò)濾器（HEPA）過(guò)濾器級(jí)別：HEPA過(guò)濾器（標(biāo)準(zhǔn)）；ULPA過(guò)濾器達(dá)到的潔凈等級(jí)——HEPA：ISO5級(jí)（美聯(lián)邦209E標(biāo)準(zhǔn)100級(jí)）；ULPA：ISO4級(jí)（美聯(lián)邦209E標(biāo)準(zhǔn)10級(jí)）過(guò)濾效率——HEPA：99.999%（0.3μm）；ULPA：99.9999%（0.12μm）水平流和垂直流超凈工作臺(tái)WD-9409型桌面式潔凈工作臺(tái)生物安全柜生物安全柜的要求（A2）針對(duì)垂直下降型層流風(fēng)向方式；氣幕隔離式設(shè)計(jì)，防止內(nèi)外交叉污染，提供對(duì)產(chǎn)品及操作者、環(huán)境的雙重保護(hù)功能；有專門的空氣處理系統(tǒng)（無(wú)害化處理外排）。生物安全柜和生物安全實(shí)驗(yàn)室風(fēng)淋門潔凈手術(shù)室吹淋潔凈傳遞窗潔凈病房無(wú)菌操作規(guī)范（11步）1.

打開無(wú)菌工作臺(tái)及凈化室的紫外燈，消毒半小時(shí)以上。2.

進(jìn)入凈化室前先關(guān)閉紫外燈，打開超凈臺(tái)風(fēng)機(jī)，等待30min以上，以排盡臭氧。3.

穿好隔離衣，戴好口罩，帽子。4.

風(fēng)淋2分鐘。5.

0.1%過(guò)氧乙酸水（新潔爾滅）泡手，擦干。6.

點(diǎn)燃酒精燈；超凈臺(tái)內(nèi)應(yīng)避免放入過(guò)多的物品；使用的吸管，滴管，試管，培養(yǎng)瓶等均事先滅菌。無(wú)菌操作規(guī)范7.

打開各類瓶蓋前先過(guò)火，以固定灰塵；打開的瓶口、試管口過(guò)火焰，鑷子使用前應(yīng)經(jīng)火焰燒灼。8.

垂直式風(fēng)機(jī)的超凈臺(tái)，應(yīng)使瓶口斜置，應(yīng)盡量避免瓶口敞開直立。9.

同一根吸管或滴管不應(yīng)連續(xù)用于幾個(gè)不同的細(xì)胞系或微生物菌種；吸取培養(yǎng)基的吸管應(yīng)離開培養(yǎng)瓶或試管口0.5cm，避免伸入培養(yǎng)瓶口或試管口；以防止細(xì)胞系的互相混雜污染。10.

漏在培養(yǎng)瓶上或臺(tái)上的液體，立即用酒精棉球擦凈。11.

操作完畢后恢復(fù)工作臺(tái)面，并進(jìn)行必要消毒滅菌。中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范總體設(shè)計(jì)（潔凈廠房位置選擇和總平面布置、工藝布置和設(shè)計(jì)綜合協(xié)調(diào)、噪聲控制、振動(dòng)控制）建筑（人員凈化和物料凈化設(shè)施、防火和疏散、室內(nèi)裝修、裝配式潔凈室等）空氣凈化（潔凈室正壓控制、氣流組組織和送風(fēng)量、空氣凈化處理、采暖通風(fēng)、風(fēng)管和附件）給排水工業(yè)氣體管道……制藥企業(yè)潔凈車間過(guò)道、車間內(nèi)部和設(shè)備無(wú)菌操作技術(shù)的介紹及演示（實(shí)驗(yàn)室）操作要點(diǎn)：①利用酒精燈或煤氣燈的火焰外焰的外部高溫區(qū)造成的無(wú)菌小環(huán)境來(lái)進(jìn)行操作；形成上升氣流，防止灰塵沉降污染；加熱固定器皿口處的灰塵和微生物顆粒。②還可以利用一些輔助儀器設(shè)備進(jìn)行操作（超凈工作臺(tái)，一般為100級(jí)）；③無(wú)菌操作只是相對(duì)而言的，只要有人活動(dòng)的地方就很難達(dá)到絕對(duì)無(wú)菌。④操作規(guī)范、準(zhǔn)確、迅速分離、純化的概念分離——指為了生產(chǎn)和科學(xué)研究的需要從自然混雜狀態(tài)得到純種的過(guò)程（可能達(dá)不到細(xì)胞純）；純化——同一個(gè)菌落不一定是同種菌，需要對(duì)其進(jìn)行純化，使之達(dá)到細(xì)胞純；多數(shù)情況下，二者無(wú)明顯劃分，是統(tǒng)一在一起的過(guò)程。發(fā)明培養(yǎng)基，并用其純化微生物等一系列研究方法的創(chuàng)立；證實(shí)炭疽病因—

炭疽桿菌；發(fā)現(xiàn)結(jié)核病原菌—結(jié)核桿菌；科赫法則（4點(diǎn)）羅伯特·科赫（RobertKoch，1843-1910）實(shí)驗(yàn)原理分離的目的：得到單細(xì)胞得到單細(xì)胞的手段：①利用顯微單細(xì)胞挑取器操作（儀器特殊，針對(duì)微生物效率不高）；②稀釋取樣——單位體積由多至少→單位面積由多至少（單菌落分散好）。操作流程圖：稀釋→單細(xì)胞→培養(yǎng)形成菌落→挑取單菌落→多次重復(fù)達(dá)到純化的目的單細(xì)胞挑取法

簡(jiǎn)易單細(xì)胞挑取法

micromanipulator

實(shí)驗(yàn)方法和步驟稀釋涂布平板法平板劃線分離法稀釋混合平板法稀釋涂布平板法倒平板→倒置空白培養(yǎng)24小時(shí)（?）→制備土壤稀釋液→涂布→倒置培養(yǎng)→挑取單菌落。不經(jīng)特殊處理，只適用于好氧菌的培養(yǎng)。稀釋混合平板法取已滅菌的空白培養(yǎng)皿→加入分離樣品稀釋液（一般為1ml）→倒入冷卻至45~50℃滅菌固體培養(yǎng)基→旋轉(zhuǎn)混合均勻（操作速度要快？）→凝固后適溫培養(yǎng)；挑取單菌落較困難（破壞培養(yǎng)基），菌落形態(tài)不易觀察（飛碟形），一般用于計(jì)數(shù)（分布均勻，相對(duì)誤差較小？）和厭氧菌的分離培養(yǎng)。平板劃線分離法利用接種環(huán)在固體瓊脂培養(yǎng)基上劃線，使粘在接種環(huán)上的微生物分布在所劃線上而得到稀釋（由點(diǎn)變線，線由點(diǎn)組成），達(dá)到分離的目的。操作簡(jiǎn)單，但不能進(jìn)行定量測(cè)定；一般不用于分離的最初步驟，而多用于微生物菌種的后序純化步驟。稀釋度和每皿中微生物個(gè)數(shù)關(guān)系示意圖厭氧培養(yǎng)的一些設(shè)備和方法平板涂布培養(yǎng)分離法和平板混菌培養(yǎng)分離法幾種常微生物分離純化方法的比較分離方法缺點(diǎn)應(yīng)用范圍稀釋涂布平板法不經(jīng)特殊處理，只適用于好氧菌的培養(yǎng)，有時(shí)菌落分散度不好。即可定性，又可定量，用途廣泛。稀釋混菌平板法挑取單菌落較困難（破壞培養(yǎng)基）；菌落形態(tài)不易觀察。常用于計(jì)數(shù)（分布均勻，相對(duì)誤差較?。┖蛥捬蹙姆蛛x培養(yǎng)。平板劃線分離法不能進(jìn)行定量測(cè)定。操作簡(jiǎn)單，一般不用于分離的最初步驟，而多用于微生物菌種的后序純化步驟。單細(xì)胞挑取法儀器特殊，針對(duì)微生物效率不高。局限于高度專業(yè)化的科學(xué)研究。以下為本次實(shí)驗(yàn)要完成的任務(wù)1、培養(yǎng)基融化，倒平板和制備斜面牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：冷卻至60℃左右，倒平板。馬丁氏培養(yǎng)基：冷卻至60℃左右，加入鏈霉素至終濃度30μg/ml，混勻后倒平板。高氏1號(hào)培養(yǎng)基：冷卻至60℃左右，加入3%K2Cr2O71ml/500ml，混勻后倒平板。每組倒13~17個(gè)平板（根據(jù)各班次組數(shù)具體安排）；裝若干支斜面試管（滅菌后擺放斜面），每種培養(yǎng)基統(tǒng)一制作（牛肉膏100支、馬丁氏30支、高氏1號(hào)45支）。和其它組交換8個(gè)平板（自已組沒(méi)有的2種培養(yǎng)基平板，各4個(gè)），用于稀釋涂布平板法操作（共計(jì)12個(gè)）；平板劃線分離法操作用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板進(jìn)行（2個(gè)，練習(xí)用）；斜面下次實(shí)驗(yàn)使用。平板的制備（操作要快）——演示使滅菌的固體培養(yǎng)基冷卻至60℃左右（容器外表面熱而不燙），防止倒平板時(shí)過(guò)多冷凝水的產(chǎn)生；準(zhǔn)備好若干滅好菌的培養(yǎng)皿，拆去包裝，堆放整齊備用；一只手拿好裝有培養(yǎng)基的三角瓶，除去瓶口的包裝放好（內(nèi)部不能向上），瓶口傾斜放于酒精燈外焰外部（不可直接燒烤）。另一只手取1個(gè)滅菌的培養(yǎng)皿，抬平，放于酒精燈外焰外部（不可直接燒烤），打開培養(yǎng)皿蓋（不可全開）；將培養(yǎng)基倒入已打開的培養(yǎng)皿內(nèi)，使之剛好流平（15~20ml），放置于水平的桌面上待凝固后即可（凝固過(guò)程請(qǐng)勿再動(dòng)培養(yǎng)皿，否則會(huì)造成平板培養(yǎng)基表面不水平）。將上述平板放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置空白培養(yǎng)24小時(shí)以上，以檢查滅菌是否徹底。同時(shí)還可以去除培養(yǎng)基表面多余的冷凝水水膜（24小時(shí)左右）。平板及斜面無(wú)菌檢查制備平板的數(shù)量

——根據(jù)實(shí)驗(yàn)組確定牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板

——（6個(gè)×實(shí)驗(yàn)組÷準(zhǔn)備組+2個(gè)）=X個(gè)/組；高氏1號(hào)培養(yǎng)基平板

——（4個(gè)×實(shí)驗(yàn)組÷準(zhǔn)備組+2個(gè)）=Y個(gè)/組；馬丁氏培養(yǎng)基平板

——（4個(gè)×實(shí)驗(yàn)組÷準(zhǔn)備組+2個(gè)）=Z個(gè)/組。平板上的標(biāo)注要求

（一般要求在培養(yǎng)皿底部標(biāo)注）培養(yǎng)基名稱組別稀釋度培養(yǎng)菌種名稱其它注意所有標(biāo)注都可以用縮寫或簡(jiǎn)寫，目的只有一個(gè)，自已可以分清即可；標(biāo)注的內(nèi)容是根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)所決定的，沒(méi)有完全的模式。斜面的制備將固體培養(yǎng)基中加入的瓊脂通過(guò)加熱（90℃以上）完全溶解；利用分裝器將溶化的固體培養(yǎng)基加入到15×150mm試管中（最常用，也可根據(jù)實(shí)際情況選用其它規(guī)格），加入量為試管高度的1/4~1/5；加塞、包扎、標(biāo)記、滅菌；擺放、冷卻、無(wú)菌檢查；流程圖：稱量→融化→調(diào)pH值→過(guò)濾→分裝→加塞→包扎→滅菌→擱置斜面→無(wú)菌檢查→使用或備用斜面制備的數(shù)量牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面——100支/全班；高氏1號(hào)培養(yǎng)基平板——45支/全班；馬丁氏培養(yǎng)基平板——30支/全班。2、稀釋涂布平板法土壤懸液的制備及稀釋，樣品稀釋液的加入（0.1或0.2ml/皿），涂布平板（3種培養(yǎng)基平板）稀釋操作要