課題2土壤中分解尿素細菌的分離與計數(shù)一、基礎知識：1、尿素的利用尿素[CO(NH2)2]——重要的農(nóng)業(yè)氮肥。土壤中細菌將其分解為NH3才能被植物吸收利用。2、土壤中的細菌能利用尿素的原因:土壤中的尿素分解菌菌能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+H2O+CO22NH3再通過平板劃線法或稀釋涂布平板法對目的菌進行分離和純化。3、實驗室中微生物的篩選原理：

利用選擇培養(yǎng)基，人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，促進目的菌株的生長，同時抑制或阻止其他微生物生長。15.0g瓊脂1.0g尿素(唯一N源)10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNa2HPO41.4gKH2PO4篩選尿素分解菌的選擇培養(yǎng)基：（下列物質(zhì)溶解后，定容至1000mL）4.統(tǒng)計菌落數(shù)目：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于具有運動性的細菌的計數(shù)；需要較高的細菌濃度；顯微鏡下難以觀察個體小的細菌；缺點：(1)顯微鏡直接計數(shù)(血細胞計數(shù)板)(2)間接計數(shù)(1)顯微鏡直接計數(shù)(血細胞計數(shù)板)2.間接計數(shù)法（活菌計數(shù)法）⑴原理：在稀釋度足夠高時，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落是由一個細胞繁殖而成的，即一個菌落代表原先的一個細胞。⑵常用方法：稀釋涂布平板法。每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的菌落的平均數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。計算公式：每克樣品中的菌株數(shù)=（C÷V）×M某同學在稀釋倍數(shù)為106

的培養(yǎng)基中測得平板上菌落數(shù)的平均數(shù)為234，那么每克樣品中的菌落數(shù)是（涂布平板時所用稀釋液的體積為0.1ml）()A.2.34×108B.2.34×109C.234D.23.4B注意事項①為了保證結果準確，一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板上進行計數(shù)。②為使結果更接近真實值可將同一稀釋度的土壤稀釋液涂布到三個或三個以上的平板中，并求平均值。③由于菌落間有粘連，因此統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比實際的活菌數(shù)低。二、實驗過程

（一）配制土壤溶液

1、土壤取樣：鏟去表層土取樣。2、將10g土樣溶于90mL無菌水，制成101的稀釋液。

（四）菌落鑒定（一）配制土壤溶液（二）系列稀釋（三）涂布平板與培養(yǎng)、觀察（二）樣品稀釋（酒精燈火焰旁進行）（1）測細菌數(shù)：一般用104、105、106稀釋液（2）測放線菌：一般用103、104、105稀釋液（3）測真菌數(shù)：一般用102、103、104稀釋液原則：確保平板上的菌落數(shù)在30～300之間。（三）涂布平板與培養(yǎng)、觀察1、涂布：用適當?shù)南♂屢鹤鐾坎计桨澹ɑ鹧媾裕?、培養(yǎng)：細菌：30～37℃，1～2d;

放線菌:25～28℃,5～7d;

霉菌:25～28℃,3～4d.3、觀察：a.每24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目b.以“穩(wěn)定菌落”為觀察對象，防止因培養(yǎng)時間不足而遺漏菌落。

（四）鑒定--鑒別培養(yǎng)基（不影響微生物的生存）

鑒定尿素分解菌的培養(yǎng)基---酚紅培養(yǎng)基

原理：脲酶催化尿素分解成氨→培養(yǎng)基堿性增強→酚紅變紅CO(N